Name: Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Aprende a visualizar interacciones plaqueta-neutrófilo en endotelio activado usando microscopía intravital de fluorescencia en ratones vivos. Este método permite estudiar la inflamación vascular y la formación de trombos en tiempo real.

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Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (P30 HL101302 y RO1 HL109439 a JC) y la American Heart Association (SDG 5270005 a JC). A. Barazia fue apoyado por una beca de formación T32HL007829 NIH.

1. Preparación de microscopio intravital (Figura 1A) <ol><li> Preparar tampón superfusión (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, y 17 mM NaHCO 3, pH 7,4). </li><li> Girar en un baño de agua circulatorio para mantener la temperatura de tampón y una manta termo controlada a 37 ° C. Airear tampón con gas nitrógeno (5% de CO 2 en equilibrio con nitrógeno). </li><li> Encienda el sistema de microscopio (Sutter Lambda DG-4 de alta velocidad longitud de onda cambiador, estación de trabajo, Olympus microscopio BX61W, MPC-200 multi-manipulador, el ROE-200 controlador de fase, cámara de alta velocidad y multiplicador). </li><li> Para el modelo de inflamación vascular, utilizar un espejo dicroico 100%. Para inducir la formación de trombos por lesión con láser, sustituir un espejo 100% con un espejo de 50/50% y activar un sistema de ablación láser micropoint. </li></ol> 2. Preparación del músculo cremáster para microscopía intravital (Figura 1B) <ol><li> Anestesiar a unratón macho (6-8 semanas de edad, C57BL / 6) por inyección ip de ketamina (125 mg / kg de peso corporal (BW)) y xilazina (12,5 mg / kg de peso corporal). La Universidad de Illinois Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión aprobó todo cuidado de los animales y los procedimientos experimentales. Para un modelo de inflamación vascular, inyectar murino TNF-α (0,5 g en 250 l de solución salina) en un ratón intrascrotally 3 h antes de la formación de imágenes (2-2.5 horas antes de la cirugía). </li><li> Coloque el ratón sobre una manta térmica controlada a 37 º C en una bandeja de microscopio intravital. </li><li> Tire hacia arriba de la piel en la superficie del cuello utilizando fórceps y una incisión en la línea media horizontal de la piel del cuello hasta 1 cm con unas tijeras. </li><li> Abra suavemente el músculo cervical utilizando tijeras de punta roma y eliminar el músculo que rodea la tráquea. </li><li> Canular un tubo en la tráquea PE90 para eliminar la dificultad para respirar. </li><li> Retire suavemente el lado izquierdo del músculo cervical y aislar la vena yugular de los tejidos circundantes. </li><li> C annutarde un tubo PE10 en la vena yugular izquierda para la infusión de anticuerpos y anestésicos adicionales. </li><li> Tire suavemente hacia fuera y una incisión en la piel del escroto horizontalmente. Para mantener la integridad de los tejidos durante todo el experimento, tampón precalentado se superfused sobre el campo quirúrgico. </li><li> Pulse en la parte inferior del abdomen con una pinza y tire con cuidado un testículo con el fórceps otro. </li><li> Quite los tejidos conectivos que rodean todo el testículo. </li><li> Incisión en el músculo cremáster verticalmente y aplanar el músculo sobre un cubreobjetos de vidrio sobre una bandeja de microscopio intravital fijando la periferia. </li><li> Permitir 10-20 min para el músculo para estabilizar antes de la recogida de datos. Arteriolas del músculo cremáster (para la formación de trombos) y vénulas (para la inflamación vascular) con un diámetro de 30-45 micras fueron elegidos para el estudio. </li><li> Para mantener las condiciones de anestesia, infusión de 30-50 ml de la misma anestesia aproximadamente cada 30 minutos a través de la cannulus yugular. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Microscopía intravital para TNF-α inducida por la inflamación vascular <ol><li> Después de la colocación del ratón en el microscopio intravital, abierto SlideBook software 5.0 y haga clic en &quot;Ventana de enfoque&quot; en la barra de menú para configurar la óptica adecuadas y objetivas (60X). </li><li> Infundir DyLight 488-rata conjugado anti-ratón CD42c (0,1 mg / g de peso corporal en 100 l de solución salina) y Alexa Fluor 647-conjugado anti-ratón de rata Gr-1 anticuerpos (0,05 mg / g de peso corporal en 100 l de solución salina) a través de un cannulus yugular . </li><li> Ir a la barra de menús y haga clic en &quot;Captura de imagen&quot; en la barra de herramientas. </li><li> Un nuevo menú aparecerá, en &quot;Imagen&quot;, seleccione &quot;Factor Bin&quot; como 1x1 y seleccione &quot;640&quot; en la anchura y &quot;460&quot; en la altura. </li><li> En &quot;Set Filter&quot;, marque la casilla de verificación de los canales que le gustaría exponer y definir el tiempo de exposición para cada uno. Por ejemplo, canal abierto: 10 mseg, FITC canal: 50 mseg, y Cy5 canal: 50 mseg. </li><li> Seleccione &quot;Time-Lapse Capture&quot; para ajustar el número de puntos de tiempo e intervalo. For el modelo de inflamación, el número de puntos de tiempo se establece en 1,000-1,500 con un intervalo de 200 ms (el tiempo total transcurrido: 5 min). </li><li> Haga clic en &quot;Test&quot; para ver una imagen de un solo avión en el tiempo de exposición especificado para ese canal. Ajuste el tiempo de exposición y / o la luz del microscopio hasta que el histograma muestra una distribución de intensidad suficiente (para captura multi-canal, repita este proceso para cada canal). </li><li> Una vez que todos los parámetros se ajustan (canales, tiempos de exposición, etc) en la &quot;Captura de imagen&quot;, seleccione &quot;Start&quot; para comenzar la captura. </li><li> Monitorear las plaquetas rodantes y adherentes y los neutrófilos durante 5 min en la mitad superior de una vénula cremáster inflamado en el modelo de inflamación vascular. De ocho a diez vénulas diferentes se registran en un ratón. </li><li> Las imágenes fueron tomadas con un aumento total de 60x (1,0 NA objetivo de inmersión en agua), dando un tamaño de ventana de 157 m x 118 micras. </li><li> Al finalizar el experimento, los ratones fueron sacrificados mediante cervical dislocation. </li></ol> 4. Análisis de datos para el modelo de inflamación vénulas <ol><li> Abra SlideBook software 5.0 y haga clic en &quot;carpeta&quot; en la barra de menú para abrir un archivo. </li><li> Haga clic en el menú de canales desplegable y seleccionar &quot;Abrir con FITC, Cy5, etc&quot; </li><li> Haga clic en &quot;renormalizar (barras de color rojo y verde)&quot; y seleccione el canal. Arrastre las barras rojas y verdes a la izquierda oa la derecha para optimizar o menos la señal de fluorescencia. </li><li> Haga clic en &quot;Aplicar&quot; y &quot;OK&quot; para actualizar la imagen. </li><li> Haga clic en botón &quot;Miniaturas&quot; para seleccionar la visualización actual como predeterminado. </li><li> Juega imagen capturada timelapse, y contar neutrófilos rodantes y adherentes durante el período de 5 min. </li><li> Para el análisis de la formación del trombo plaquetario, vaya a &quot;Máscara&quot; y seleccione &quot;Crear&quot;. </li><li> Nombre una máscara y la marca &quot;A imagen actual&quot;. </li><li> Haga clic en &quot;icono de lápiz grande&quot; en &quot;Marquee Tool&quot; en la vista principal. </li><li> Colorea una región fuera del recipiente en la vista principal para establecer una máscara de fondo. </li><li> Ir to &quot;máscara&quot;, haga clic en &quot;Copiar Esta Plane&quot;, haga clic en &quot;máscara Copia en punto de tiempo actual&quot; y seleccione &quot;Todos los puntos de tiempo&quot;, y haga clic en &quot;OK&quot;. </li><li> Para el cálculo de la señal de fondo, vaya a &quot;Estadísticas&quot; y haga clic en &quot;Estadísticas máscara&quot;. </li><li> Haga clic en &quot;Current Time Lapse 2D o imagen 4D (s)&quot; en el ámbito de imagen y seleccione &quot;Máscara entera&quot; en Ámbito Mask. En Funciones, seleccione &quot;Tiempo transcurrido (hh: mm: ms)&quot; en Fecha de captura, seleccione &quot;Area (píxeles)&quot; bajo Morfometría, seleccione &quot;Nivel máximo&quot; bajo Intensidad, y haga clic en &quot;Exportar&quot; (Este método estadístico nos permite calcular auto-fluorescencia intensidad (señal de fondo)). </li><li> Abrir el archivo de texto en MS Office Excel y calcular el valor medio de la señal de fondo durante todo el período de registro. Esta es la intensidad de fluorescencia de fondo. </li><li> Para determinar la intensidad de trombos, haga clic en &quot;icono de lápiz grande&quot; de nuevo en el &quot;Marquee Tool&quot; en la vista principal. </li><li> Color en el interior del recipiente en la vista principal para ajustar la señal de plaquetas. </li><li> Vaya a &quot;Mask&quot;, haga clic en &quot;Copiar Esta Plane&quot;, haga clic en &quot;máscara Copia en punto de tiempo actual&quot;, seleccione &quot;Todos los puntos de tiempo&quot;, y haga clic en &quot;OK&quot;. </li><li> Vaya a &quot;Estadísticas&quot; y haga clic en &quot;Estadísticas máscara&quot;. </li><li> Haga clic en &quot;Current Time Lapse 2D o imagen 4D (s)&quot; en el ámbito de imagen y seleccione &quot;Máscara entera&quot; en Ámbito Mask. En Funciones, seleccione &quot;Tiempo transcurrido (hh: mm: ms)&quot; en Fecha de captura, seleccione &quot;Area (píxeles)&quot; bajo Morfometría, seleccione &quot;Nivel Sum&quot; en intensidad, y haga clic en &quot;Exportar&quot; (Este método estadístico nos permite calcular la intensidad de fluorescencia en el interior del recipiente). </li><li> Abra el archivo de texto en Microsoft Office Excel. La señal de fluorescencia de las plaquetas se calcula restando el valor medio de la intensidad de área de fondo x (píxel) de la suma de la intensidad en el interior de la vasija. Esta es la intensidad de fluorescencia de los trombos de plaquetas. </li><li> Repita esto en 30 vénulas diferentes en 3-5 ratones diferentes. A continuación, calcular el valor de la mediana de la intensidad de fluorescencia de las plaquetas. </li><li> Aanalizar la rodadura de neutrófilos y la adherencia, la afluencia de rodadura de neutrófilos se determinó durante 5 min en cada vénula y presentados como número de células por minuto. El número de neutrófilos adherentes que eran estacionaria durante&gt; 30 seg y se arrastró lentamente (&lt;10 micras durante 30 s), pero no rodar, se contaron y se presentaron como el número de células por 5 min. </li></ol> 5. Microscopía intravital de trombosis inducida por láser arteriolar 5-1 de calibración de láser de ablación <ol><li> Colocar un portaobjetos de microscopio reflejado en el escenario, aplicar una pequeña gota de agua destilada a la parte superior de la corredera, y ajustar la intensidad y el enfoque utilizando el ocular. </li><li> Abra &quot;Ventana Focus&quot; y seleccione la opción &quot;FRAP&quot; en la pestaña SlideBook software 5.0. </li><li> Ajuste la potencia del láser en 40-50, y ajustar &quot;repeticiones doble clic&quot; y del &quot;tamaño doble clic&quot; a 8. Marque en la &quot;guía&quot; casilla para mostrar un conjunto de punto de mira. </li><li> Seleccione la opción &quot;Arrow&quot; icono de la barra de tareas on la parte superior de la pantalla. </li><li> En la sección &quot;Alineación FRAP&quot; haga click en &quot;Fire siguiente&quot;. Un pequeño punto debería aparecer cerca de la esquina inferior izquierda de la pantalla. Una vez que la mancha aparece, haga doble clic en el centro de la misma. Una vez que se hace clic, otro punto debería aparecer por encima ya la derecha del punto primero, haga doble clic en él. Repita esto para 16 puntos (puntos 16 º aparecerá en la esquina inferior derecha.) Haga clic en &quot;Guardar&quot; cuando haya terminado de actualizar los parámetros de calibración. </li><li> Para probar la exactitud de la calibración, haga clic en el &quot;Centro&quot; botón, un pequeño punto debe aparecer en el centro de la pantalla. Si no es así, repita la calibración hasta que la precisión deseada. </li></ol> 5-2 inducida por láser formación de trombos arteriolar <ol><li> Coloque un ratón anestesiado (véase el procedimiento de 2-2 a 2-12) en la platina del microscopio. </li><li> En virtud de la &quot;captura&quot; de la ventana, seleccione un protocolo o crear uno nuevo. Los ajustes son los siguientes: CY5 (70 ms de exposición), Open (10 mseexposición c), y FITC (50 exposición mseg). La imagen se capturó más de 20 minutos (aproximadamente 2.400 puntos de tiempo con un intervalo de tiempo de 500 ms). </li><li> Infundir DyLight 488-anti-ratón conjugado CD42c y Alexa Fluor 647-anti-ratón conjugados Gr-1 anticuerpos como se describe anteriormente. </li><li> Optimizar los parámetros de microscopio incluyendo la intensidad de fluorescencia y la imagen de campo brillante como se describe en 3-3 a 3-7. </li><li> Haga clic en el botón &quot;Test&quot; para asegurar la intensidad adecuada campo claro o señal de anticuerpos, la colocación de las arteriolas y enfoque. </li><li> Haga clic en &quot;Inicio&quot; para iniciar el proceso de captura de imágenes. </li><li> Antes de disparar el láser de ablación, asegúrese de que el icono del puntero del ratón ha sido seleccionado y que la pared del vaso está enfocada. </li><li> Para disparar el láser, haga doble clic en un punto de 2-3 micras interna de la pared del vaso. Lesión de las células endoteliales de las arteriolas provoca un cambio de forma visual que deben ser evidentes en la imagen de campo claro, seguido por la acumulación de plaquetas. Monitor de tromboformación de 5 min después de la lesión con láser. </li><li> Cinco minutos después de la lesión con láser (el tamaño del trombo ahora debe ser estable) pausa y cancelar la captura. Posteriormente, iniciar una captura con 2400 puntos de tiempo con un intervalo de 500 ms para registrar las plaquetas adherentes y neutrófilos rodantes / adherentes durante 20 min. De tres a cinco arteriolas son registrados en un ratón. </li><li> Al finalizar el experimento, los ratones fueron sacrificados mediante dislocación cervical. </li></ol> 6. Análisis de datos para el modelo de trombosis arteriolar <ol><li> Repase los pasos 4.1 a 4.5. </li><li> Para obtener la intensidad de la fluorescencia de fondo durante la formación de trombos de plaquetas, pasar a través de los pasos 4,7 4,14. </li><li> Vaya a &quot;Mask&quot;, haga clic en &quot;segmentos&quot;, seleccione FITC en el canal, e insertar el valor medio de la señal de fondo en Low. Haga clic en &quot;Aplicar&quot; y &quot;OK&quot;. </li><li> Para analizar la intensidad de fluorescencia de trombos de plaquetas (DyLight 488-conjugado anti-CD42c anticuerpo), </strong&gt; repasar los pasos 4,18 por 4,19. Para el cálculo de la señal de anticuerpos, &quot;Intensidad Sum&quot; se resta de la señal de fondo (&quot;Intensidad máxima&quot; x &quot;en la zona (píxeles)&quot;). Esta es la intensidad de fluorescencia de los trombos de plaquetas. </li><li> Para cuantificar los neutrófilos rodantes y adherentes, jugar el timelapse y contar el número de células que visiblemente rodar sobre el trombo plaquetario más de 20 min. Rodadura se define como una disminución en la velocidad de neutrófilos, mientras que la interacción con el trombo de plaquetas durante al menos 2 segundos. Neutrófilos adherentes se definen como cualquier neutrófilos que permanecen unidos a los trombos de plaquetas durante al menos 2 min. El número de neutrófilos rodantes y adherentes se presentó como el número de células por 20 min. La velocidad de rotación se calculó utilizando un sistema de rastreo de partículas. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran no tener ningún interés en competencia financiera.

Aquí se describe un protocolo detallado para tiempo real microscopía de fluorescencia intravital para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y trombosis. Anteriormente, los enfoques similares microscópicas de fluorescencia se registraron para estudiar el mecanismo molecular de la formación de trombo y la inflamación vascular. 8,12 Desde el heterotípicos interacción célula-célula podría ser importante para la oclusión vascular en el...

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>0.9% NaCl solución salina</td><td>Hospira</td><td>0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Hospira</td><td>0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Lloyd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo intramédico (PE 90)</td><td>BD Diagnostics</td><td>427421</td><td></td></tr><tr><td>Tubo intramédico (PE 10)</td><td>BD Diagnostics</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Murine TNF-&alpha;</td><td>R& D Systems</td><td>410-MT</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 488- anticuerpo CD42b anti-ratón para ratas etiquetado </td><td>Emfret Analytics</td><td>X488</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-conjugado anti-ratón Anticuerpo Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)</td><td>BioLegend</td><td>108418</td><td></td></tr><tr><td>NESLAB EX baño de agua/circulador</td><td>Microscopio Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX61W</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TH4-100 Potencia</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG-4</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MPC-200 multi-manipulador</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R&#8211;-200 controlador de etapa</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C9300 cámara de alta velocidad</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intensificador</td><td>de video Láser de</td> ablación internacional <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Instrumentos Fotónicos, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 5.0</td><td>Innovaciones en</td><td></td><td></td> imágenes inteligentes</tr></tbody></table>

imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

La interacción de las plaquetas activadas y leucocitos (principalmente neutrófilos) en el endotelio activado trombosis media y la inflamación vascular. 1,2 Durante la formación de un trombo en el sitio de la lesión arteriolar, las plaquetas adherentes al endotelio activado y proteínas subendoteliales matriz de soporte de rodadura de neutrófilos y la adherencia. 3 A la inversa, bajo venulares condiciones inflamatorias, neutrófilos adherentes al endotelio activado puede soportar la adhesión y acumulación de plaquetas circulantes. Heterotípicos plaquetas agregación de neutrófilos requiere procesos secuenciales por las interacciones con los receptores específicos de receptor-contador entre las células. 4 Se sabe que las células endoteliales activadas liberan moléculas de adhesión tales como el factor de von Willebrand, iniciando así la adhesión de las plaquetas y la acumulación bajo condiciones de alto cizallamiento. 5 Además, células endoteliales activadas soporte rodante de neutrófilos y la adhesión por selectinas que expresan unmolécula-1 d adhesión intercelular (ICAM-1), respectivamente, en condiciones de bajo cizallamiento. 4 de plaquetas P-selectina interactúa con los neutrófilos a través de P-selectina glicoproteína ligando-1 (PSGL-1), induciendo de ese modo la activación de neutrófilos β2 integrinas y firmes adhesión entre dos tipos de células. A pesar de los avances en los experimentos in vitro en el que heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones se determinan en sangre entera o de células aisladas, 6,7 esos estudios no se pueden manipular las condiciones de estrés oxidativo durante la enfermedad vascular. En este informe, utilizando marcadas con fluorescencia, anticuerpos específicos contra un ratón de plaquetas y neutrófilos marcador, se describe un protocolo detallado intravital microscópico para monitorear las interacciones heterotípicas de plaquetas y neutrófilos sobre el endotelio activado durante TNF-α inducida por inflamación o por láser inducida lesión del músculo cremáster en microvasos de ratones vivos.

Usando un análisis detallado microscopía intravital, heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado se visualizaron mediante la infusión de anticuerpos marcadas con fluorescencia contra una de plaquetas (CD42c) o neutrófilos marcador (Gr-1) en ratones vivos. En un modelo de TNF-α inducida por inflamación venular, neutrófilos más de rodadura se adhirieron de forma estable al endotelio presumiblemente por la interacción de las integrinas β2 activados con ICAM-1 dura...

Aquí se presenta una técnica experimental de microscopía intravital de fluorescencia para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos. Esta tecnología microscópica será valiosa para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad vascular y para poner a prueba los agentes farmacológicos bajo condiciones fisiopatológicas.

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar la interacción típica entre plaquetas y neutrófilos sobre el endotelio activado durante la enfermedad vascular. Esto se logra mediante microscopía intravital de fluorescencia en tiempo real en ratones vivos para visualizar la microvasculatura dentro del músculo cremáster. Como segundo paso, se infunden anticuerpos marcados con fluorescencia y se inicia una inflamación o lesión tisular para facilitar la visualización directa de las interacciones típicas entre plaquetas y neutrófilos resultantes.A continuación, se analizan los datos guardados para cuantificar el número de células y su dinámica. En última instancia, se pueden evaluar las interacciones típicas directas entre plaquetas y neutrófilos sobre el endotelio activado, basándose en la señal fluorescente de los anticuerpos infundidos mediante microscopía intravital en tiempo real. Nuestra técnica de microscopía intravital puede proporcionar información sobre las interacciones en tiempo real entre plaquetas y neutrófilos sobre el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos.Esta tecnología también puede aplicarse a otros sistemas, como la evaluación de las interacciones entre células cancerosas y células sanguíneas. Antes de comenzar el experimento, encienda el sistema de microscopía para el modelo de inflamación vascular. Inyecte intraarterialmente TNF alfa tres horas antes de la inyección intraperitoneal de anestésicos.Una vez que se haya confirmado la sedación mediante el pellizco del dedo del pie, canule un tubo PE 90 en la tráquea del ratón para eliminar cualquier dificultad respiratoria. A continuación, canule un tubo PE 10 en la vena yugular izquierda para la infusión de anticuerpos marcados con fluorescencia y anestésicos adicionales. Luego, retire suavemente y haga una incisión horizontal en la piel escrotal y vierta buffer previamente calentado sobre el campo quirúrgico.Ahora, presionando el abdomen inferior con una pinza, extraiga cuidadosamente un testículo con la otra pinza según su tamaño, corte el músculo car master longitudinalmente y aplane el músculo sobre una laminilla de vidrio colocada en una bandeja microscópica intra-vial, fijando el tejido periférico a la bandeja. Comience este paso infundiendo primero DITE 4 88 conjugado con ratón anti ratón CD 42 C y Alexa floor 6 47 conjugado con anticuerpos anti ratón GR uno a través de la cánula yugular previamente colocada. Luego, en el conjunto de filtros del microscopio, marque la casilla de verificación para los canales que se expondrán y establezca el tiempo de exposición para cada captura de lapso de tiempo seleccionada.Para establecer el número de puntos temporales entre 1000 y 1500 con un intervalo de 200 milisegundos, lo que equivale a un tiempo total transcurrido de cinco minutos. Una vez que todos los parámetros se hayan configurado en la captura de imagen, seleccione iniciar para comenzar la captura con un aumento de 60 x y una ventana de 157 micrómetros por 118 micrómetros. Monitoree la formación de filas y las plaquetas adheridas a los neutrófilos durante cinco minutos en la mitad superior de un vaso cremastérico inflamado.Para analizar la formación del trombo plaquetario, vaya a máscara y seleccione crear. Luego, en la herramienta de marquesina de la vista principal, haga clic en el icono del lápiz grande. Utilice el lápiz para colorear una región fuera del vaso sanguíneo en la vista principal.Para establecer una máscara de fondo, vaya a máscara, haga clic en copiar este plano, luego haga clic en copiar máscara. En el punto temporal actual, seleccione todos los puntos temporales y haga clic en aceptar. Para calcular la señal de fondo, vaya a estadísticas y haga clic en estadísticas de máscara.Luego, en el alcance de la imagen, haga clic en la cronofotografía actual en 2D o en imágenes en cuatro dimensiones en el alcance de máscara, y seleccione toda la máscara en las características. En fecha de captura, seleccione el tiempo transcurrido. En geometría morfológica, seleccione área en píxeles y en intensidad, seleccione intensidad máxima.Ahora haga clic en exportar. Abra el archivo de texto en un programa de hoja de cálculo y calcule el valor promedio de la señal de fondo durante todo el período de grabación. Para determinar la intensidad de fluorescencia de fondo.Después de calcular la intensidad de fluorescencia de fondo durante el trombo plaquetario tal como se acaba de demostrar en el modelo de inflamación ular, vaya a máscara, haga clic en segmentar, seleccione ajuste e, canal e inserte el valor promedio de la señal de fondo en baja, haga clic en aplicar y luego en aceptar. A continuación, vaya a estadísticas y haga clic en estadísticas de máscara. Ahora, en el alcance de la imagen, haga clic en la imagen actual en 2D con lapse de tiempo o en imágenes 4D en el alcance de máscara, seleccione toda la máscara en características, en fecha de captura seleccione tiempo transcurrido, en geometría morfológica seleccione área en píxeles y en intensidad seleccione intensidad total.Luego, haga clic en exportar. Abra el archivo de texto en el programa de hoja de cálculo y calcule la intensidad de fluorescencia del trombo plaquetario. Para analizar la trombosis arteriolar, comience infundiendo los anticuerpos anti ratón CD 42 conjugados con DITE 4 88 y anti ratón GR uno conjugados con ANDOR 6 47, tal como se acaba de demostrar.Después de hacer clic en iniciar para comenzar el proceso de captura de imágenes, haga doble clic en un punto ubicado de dos a tres micrómetros hacia el interior de la pared del vaso para disparar el láser. La lesión de las células endoteliales arteriolares provoca un cambio de forma visible que debería ser evidente en la imagen de campo claro, seguido por la acumulación de plaquetas. Cinco minutos después de la lesión con láser, detenga y cancele la captura.Posteriormente, inicie una captura con 2.400 puntos de tiempo con un intervalo de 500 milisegundos para registrar las plaquetas adheridas y los neutrófilos adherentes y rodantes durante 20 minutos. Después de calcular la intensidad de fluorescencia de fondo durante el trombo plaquetario de manera similar al modelo de inflamación ular, vaya a máscara, haga clic en segmentar, seleccione fite y canal e inserte el valor promedio de la señal de fondo en baja, haga clic en aplicar y en aceptar. Ahora, en el alcance de la imagen, haga clic en la serie temporal 2D actual o en imágenes 40D en el alcance de máscara, seleccione toda la máscara en características, en fecha de captura seleccione tiempo transcurrido, en Morpho seleccione área en píxeles y en intensidad, seleccione intensidad total.Luego haga clic en exportar. Abra el archivo de texto en el programa de hoja de cálculo y calcule la intensidad de fluorescencia del trombo plaquetario. Para cuantificar los neutrófilos en rodadura y adheridos, reproduzca el lapso de tiempo y cuente el número de células que ruedan visiblemente sobre la superficie.Se define como trombo plaquetario durante 20 minutos con movimiento rodante una disminución en la velocidad de los neutrófilos mientras interactúan con el trombo plaquetario durante al menos dos segundos. Se definen como neutrófilos adheridos aquellos que permanecen unidos al trombo plaquetario durante al menos dos minutos. A continuación, se muestran imágenes representativas de la apariencia de las señales fluorescentes asociadas con neutrófilos en rojo y plaquetas en verde.Durante la inflamación ular, se muestra la flecha que indica la dirección del flujo sanguíneo en el vaso. El número de neutrófilos que ruedan y de neutrófilos adheridos en células endoteliales inflamadas se determinó en 0,25 células por minuto y 18,5 células por cinco minutos, respectivamente. Los datos son representativos de la media más o menos el error estándar de la media de 30 Es diferentes en cuatro ratones de tipo silvestre.Aquí se representa gráficamente la señal fluorescente integrada mediana de las plaquetas en función del tiempo. Se encontró que la mayoría de las plaquetas en rojo se adhieren a los neutrófilos adherentes y migratorios en verde, en lugar de a la pared del vaso inflamado. Ahora pasamos a las interacciones entre plaquetas y neutrófilos tras la lesión arteriolar inducida por láser.Estas imágenes ilustran un único neutrófilo en rojo, indicado con la flecha amarilla, rodando sobre el trombo plaquetario en verde, con un segundo neutrófilo en rojo, indicado por la flecha blanca, rodando rápidamente sobre las células endoteliales arteriolares, ambos durante un intervalo de captura de cinco segundos. Aquí, se muestra nuevamente un único neutrófilo en rojo rodando y adhiriéndose a un trombo plaquetario en verde durante un intervalo de 15 segundos. La punta de flecha identifica los neutrófilos que ruedan y los adheridos, y la flecha gris gruesa indica la dirección del flujo sanguíneo. Aquí, la señal fluorescente integrada mediana de las plaquetas se representa como una función del tiempo.Se determinó que el número de neutrófilos rodantes y adherentes fue de 21,5 y 1,6 células durante 20 minutos, respectivamente. Los neutrófilos presentaron un rodaje rápido inicial sobre las células endoteliales. Una vez que los neutrófilos entraron en contacto con el trombo plaquetario, la velocidad de rodaje de los neutrófilos sobre el trombo plaquetario cambió, con un rango de 8,2 micrómetros por segundo, y está mediada por la interacción de la pectina y el PSGL-1.Los datos son representativos de la media más o menos el error estándar de la media de 14 trombos diferentes en siete ratones de tipo salvaje cinco minutos después de la lesión con láser. El tamaño del trombo plaquetario permanece relativamente constante durante la adquisición de imágenes, y los neutrófilos ruedan y se adhieren al trombo. La señal fluorescente procedente de las plaquetas circulantes es despreciable.En comparación con el del trombo plaquetario, después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar el sistema de microscopía intravital con ratones vivos, lo que le permitirá visualizar en tiempo real las interacciones heterotípicas entre plaquetas y neutrófilos sobre el endotelio activado dentro de la microvasculatura.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video, demostramos la visualización en tiempo real de las interacciones entre las células sanguíneas y el endotelio en las venas mesentéricas de un modelo de ratón inyectado intraperitonealmente con lipopolisacárido.

Microscopía intravital para analizar las interacciones entre células sanguíneas y endoteliales en un modelo de ratón con inflamación

Para estudiar la interacción de las bacterias con los vasos sanguíneos sometidos a esfuerzo cortante, se describe una cámara de flujo y un modelo de microscopía mesentérica intravital in vivo que permiten diseccionar los factores bacterianos y del huésped que contribuyen a la adhesión vascular.

In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

Esta aplicación simplificada de la microscopía intravital de las venas del mesenterio en ratones se puede utilizar en diferentes modelos de inflamación para observar las interacciones leucocito-endotelial y plaqueta-leucocito.

Interacciones intravital microscopía de leucocitos endoteliales y plaquetas de leucocitos en mesenterial venas en ratones

Detallamos un protocolo para monitorizar el comportamiento de neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas en estado estacionario e inflamatorio utilizando microscopía confocal intravital en ratones anestesiados.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

En este trabajo se describe un modelo experimental de la hemostasia que mide simultáneamente la función plaquetaria y la coagulación. Plaquetas y fibrina de fluorescencia se mide en tiempo real, y la tasa de adhesión plaquetaria, la tasa de coagulación, y el inicio de la coagulación se determinan. El modelo se utiliza para determinar las propiedades procoagulantes de plaquetas bajo flujo en concentrados para la transfusión.

Una Cámara de microfluidos Modelo de Flujo de Transfusión de Plaquetas y hemostasia Medidas de deposición de plaquetas y la formación de fibrina en tiempo real

Este trabajo describe un método basado en microscopía de fluorescencia para el estudio de la adhesión plaquetaria, la extensión y la secreción bajo flujo. Esta plataforma versátil permite la investigación de la función plaquetaria para la investigación mecánica sobre trombosis y hemostasia.

Imágenes de células vivas de desgranulación plaquetaria y secreción bajo flujo

Presentamos un modelo de enfermedad vascular in vitro para investigar interacciones sanguíneas enteras con endotelio derivado del paciente. Este sistema permite el estudio de las propiedades trombogénicas de las células endoteliales primarias en diversas circunstancias. El método es especialmente adecuado para evaluar la trombogenicidad in situ y la terapia de anticoagulación durante diferentes fases de la coagulación.

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Describimos aquí el método para obtener imágenes de megacariocitos y proplatados en la médula del hueso del cráneo de ratones vivos utilizando microscopía de dos fotones.

In Vivo Imágenes de dos fotones de megacariocitos y proplatatos en la médula ósea del cráneo del ratón

El reclutamiento de leucocitos y plaquetas constituye un componente esencial necesario para el crecimiento efectivo de las arterias colaterales durante la arteriogénesis. La microscopía multifotónica es una herramienta eficiente para rastrear la dinámica celular con alta resolución espacio-temporal in vivo y menos fototoxicidad para estudiar el reclutamiento y extravasación de leucocitos durante la arteriogénesis.

Imágenes intravitales multifotónicas para la monitorización del reclutamiento de leucocitos durante la arteriogénesis en un modelo de extremidades posteriores murinas

Se puede evaluar la función plaquetaria bajo flujo y se puede modelar la reanimación hemostática simulada utilizando un dispositivo microfluídico, que tiene aplicaciones en medicina traumatológica y transfusional.

Microfluídica en la evaluación de la función plaquetaria

Aprende a visualizar interacciones plaqueta-neutrófilo en endotelio activado usando microscopía intravital de fluorescencia en ratones vivos. Este método permite estudiar la inflamación vascular y la formación de trombos en tiempo real.

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos (Video) | JoVE Journal

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

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