Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

Aquí se presenta una técnica experimental de microscopía intravital de fluorescencia para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos. Esta tecnología microscópica será valiosa para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad vascular y para poner a prueba los agentes farmacológicos bajo condiciones fisiopatológicas.

El objetivo general del siguiente experimento es visualizar la interacción típica entre plaquetas y neutrófilos en el endotelio activado durante la enfermedad vascular. Esto se logra mediante microscopía intravital de fluorescencia en tiempo real en ratones vivos para visualizar la microvasculatura dentro del músculo cremaster. Como segundo paso, se infunden anticuerpos marcados con fluorescencia y se inicia la inflamación o lesión ular para facilitar la visualización directa de las interacciones típicas resultantes entre los neutrófilos plaquetarios.

A continuación, se analizan los datos guardados para cuantificar el número de celdas y su dinámica. En última instancia, las interacciones típicas directas entre las plaquetas y los neutrófilos en el endotelio activado pueden evaluarse en función de la señal fluorescente de los anticuerpos infundidos en microscopía intravital en tiempo real. Nuestra técnica microscópica intravital puede proporcionar información sobre las interacciones en tiempo real entre las plaquetas y los neutrófilos en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos.

Esta tecnología también se puede aplicar a otros sistemas, como la evaluación de las interacciones de las células cancerosas y las células sanguíneas. Antes de comenzar el experimento, encienda el sistema de microscopio para el modelo de inflamación vascular. Inyección intra gruñona de TNF alfa tres horas antes de la inyección IP de los anestésicos.

Una vez confirmada la sedación mediante un pellizco del dedo del pie, se coloca un tubo de PE 90 en la tráquea del ratón para eliminar cualquier dificultad respiratoria. A continuación, canula un tubo de PE 10 en la vena yugular izquierda para la infusión de anticuerpos marcados con fluorescencia y anestésicos adicionales. A continuación, extraiga suavemente y haga incisión horizontal en la piel del escroto y coloque un tampón precalentado sobre el campo quirúrgico.

Ahora, presionando la parte inferior del abdomen con una pinza, extraiga con cuidado un testículo con la otra pinza en tamaño, el músculo domina el automóvil verticalmente y aplana el músculo sobre un deslizamiento de cubierta de vidrio en una bandeja de microscopio intravial sujetando el tejido periférico a la bandeja. Comience este paso infundiendo primero anticuerpos anti ratón conjugado DITE 4 88, anti ratón CD 42 C y Alexa piso 6 47 conjugado anti ratón GR one a través de la cánula yugular previamente configurada. Luego, en el conjunto de filtros del microscopio, marque la casilla de verificación para los canales que se expondrán y establezca el tiempo de exposición para cada captura de lapso de tiempo seleccionada.

Para establecer el número de puntos de tiempo entre 1000 y 1500 con un intervalo de 200 milisegundos para un tiempo total transcurrido de cinco minutos. Una vez que se hayan establecido todos los parámetros en la captura de imagen, seleccione iniciar para comenzar la captura con un aumento de 60x con una ventana de 157 micrómetros por 118 micrómetros. Monitoree las plaquetas gobernantes y adherentes a los neutrófilos durante cinco minutos en la mitad superior de un lugar inflamado de cremaster.

Para analizar la formación de trombos plaquetarios, vaya a máscara y seleccione crear. Luego, debajo de la herramienta de marco en la vista principal, haga clic en el icono de lápiz grande. Use el lápiz para colorear una región fuera del recipiente en la vista principal.

Para establecer una máscara de fondo, vaya a máscara, haga clic en copiar este plano, haga clic en copiar máscara. En el punto de tiempo actual, seleccione todos los puntos de tiempo y haga clic en Aceptar. Para calcular la señal de fondo, vaya a estadísticas y haga clic en estadísticas de máscara.

A continuación, en el ámbito de la imagen, haga clic en el lapso de tiempo 2D actual o en cuatro imágenes D en el ámbito de la máscara, seleccione la máscara completa en las entidades. En Fecha de captura, seleccione tiempo transcurrido. En Morph geometry, seleccione el área en píxeles y, en intensidad, seleccione la intensidad máxima.

Ahora haga clic en exportar. Abra el archivo de texto en un programa de hoja de cálculo y calcule el valor medio de la señal de fondo durante todo el período de grabación. Para determinar la intensidad de fluorescencia de fondo.

Después de calcular la intensidad de la fluorescencia de fondo durante el trombo plaquetario como se acaba de demostrar en el modelo de inflamación ular, vaya a la máscara, haga clic en el segmento, seleccione ajustar e y canal, e inserte el valor promedio de la señal de fondo en el clic bajo aplicar y bien. A continuación, vaya a estadísticas y haga clic en estadísticas de máscara. Ahora, en el alcance de la imagen, haga clic en el lapso de tiempo 2D actual o en cuatro imágenes D en el alcance de la máscara, seleccione la máscara completa en las características en la fecha de captura, seleccione el tiempo transcurrido en la geometría de la forma, seleccione el área en píxeles y en la intensidad, seleccione algo de intensidad.

A continuación, haga clic en exportar. Abra el archivo de texto en el programa de hoja de cálculo y calcule la intensidad de fluorescencia del trombo plaquetario. Para el análisis de la trombosis arteriolar, comience por infundir anticuerpos anti ratón conjugados DITE 4 88 CD 42 C ANDOR 6 47 anti GR uno conjugados contra el ratón, como se acaba de demostrar.

Después de hacer clic en iniciar el proceso de captura de imagen, haga doble clic en un punto de dos a tres micrómetros internamente de la pared del recipiente para disparar el láser. La lesión de las células endoteliales arteriolares provoca un cambio de forma visual que debería ser evidente en la imagen de campo claro seguido de la acumulación de plaquetas. Cinco minutos después de la lesión por láser, haga una pausa y cancele la captura.

Posteriormente, inicie una captura con 2.400 puntos de tiempo con un intervalo de 500 milisegundos para registrar las plaquetas adherentes y los neutrófilos rodantes y adherentes durante 20 minutos. Después de calcular la intensidad de la fluorescencia de fondo durante el trombo plaquetario de manera similar a en el modelo de inflamación ular, vaya a la máscara, haga clic en el segmento, seleccione fite y canal e inserte el valor promedio de la señal de fondo en el clic bajo aplicar y listo. Ahora, en el alcance de la imagen, haga clic en el lapso de tiempo 2D actual o en las imágenes 40 D en el alcance de la máscara, seleccione la máscara completa en las características en la fecha de captura, seleccione el tiempo transcurrido en Morpho, seleccione el área en píxeles y en intensidad, seleccione algo de intensidad.

A continuación, haga clic en exportar. Abra el archivo de texto en el programa de hoja de cálculo y calcule la intensidad de fluorescencia del trombo plaquetario. Para cuantificar los neutrófilos rodantes y adherentes, reproduzca el lapso de tiempo y cuente el número de células que se desplazan visiblemente.

El trombo plaquetario durante 20 minutos de rodadura se define como una disminución de la velocidad de los neutrófilos al interactuar con el trombo plaquetario durante al menos dos segundos. Los neutrófilos adherentes se definen como cualquier neutrófilo que permanece adherido al trombo plaquetario durante al menos dos minutos. Aquí, imágenes representativas de la aparición de señales fluorescentes asociadas con neutrófilos en rojo y plaquetas en verde.

Durante la inflamación ular, la flecha muestra la dirección del flujo sanguíneo en el vaso. Se determinó que el número de neutrófilos rodantes y adherentes en las células endoteliales inflamadas fue de 0,25 células por minuto y 18,5 células por cinco minutos, respectivamente. Los datos son representativos de la media más o menos el error estándar de la media de 30 Es diferentes en cuatro ratones de tipo salvaje.

Aquí se representa la señal fluorescente integrada mediana de las plaquetas en función del tiempo. Se encontró que la mayoría de las plaquetas en rojo se adhieren a los neutrófilos adherentes y rastreros en verde en lugar de a la pared del vaso inflamado. Ahora pasamos a las interacciones plaquetarias de los neutrófilos después de una lesión arteriolar inducida por láser.

Estas imágenes ilustran un solo neutrófilo en rojo y se indican con la flecha amarilla rodando sobre el trombo plaquetario en verde con un segundo neutrófilo en rojo e indicado por la flecha blanca que rueda rápidamente sobre las células endoteliales arteriolares, ambos en un intervalo de captura de cinco segundos Aquí, se muestra un solo neutrófilo nuevamente en rojo rodando y adhiriéndose a un trombo plaquetario en verde durante un intervalo de 15 segundos. La punta de flecha identifica los neutrófilos rodantes y adherentes y la flecha gris gruesa indica la dirección del flujo sanguíneo. Aquí, la señal fluorescente integrada mediana de las plaquetas se representa gráficamente en función del tiempo.

Se determinó que el número de neutrófilos rodantes y adherentes fue de 21,5 y 1,6 células durante 20 minutos, respectivamente. El rápido rodamiento inicial de los neutrófilos se produjo en las células endoteliales. Una vez que los neutrófilos entraron en contacto con el trombo plaquetario, la velocidad de rodadura de los neutrófilos en el trombo plaquetario cambió en un rango de 8,2 micrómetros por segundo y está mediada por la interacción de la pectina y la psgl L.

Los datos son representativos de la media más o menos, el error estándar de la media de 14 trombos diferentes en siete ratones de tipo salvaje cinco minutos después de la lesión por láser. El tamaño del trombo plaquetario permanece relativamente constante durante la toma de imágenes, y los neutrófilos ruedan y se adhieren al trombo. La señal fluorescente de las plaquetas circulantes es insignificante.

En comparación con el del trombo plaquetario, después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo configurar el sistema de microscopio intravital con ratones vivos, lo que le permite visualizar en tiempo real las interacciones heterotípicas entre plaquetas y neutrófilos en el endotelio activado dentro de la microvasculatura.