Name: Imagen tridimensional de nociceptivos Fibras Nerviosas intraepidérmicas en biopsias de piel humana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Aprende a realizar inmunohistoquímica en biopsias de piel humana para visualizar fibras nerviosas intraepidérmicas nociceptivas mediante microscopía confocal y análisis tridimensional. Este método permite estudiar cambios morfológicos asociados a neuropatías dolorosas.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones K08 NS061039-01A2, el Programa de Investigación de Neurología y descubrimiento, y el Instituto A. Alfred Taubman de Investigación Médica de la Universidad de Michigan. En este trabajo se utilizó la Morfología y Análisis de Imágenes Core del Michigan Diabetes Research and Training Center, financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención 5P90 DK-20572 del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales. Los autores desean agradecer a Robinson Singleton y Gordon Smith (Universidad de Utah) por su generosa donación de muestras de piel humana para apoyar el desarrollo inicial de la técnica inmunohistoquímica biomarcador nociceptivo.

Parte A: La inmunohistoquímica Preparación de la placa de 96 pocillos y la prevención de la tinción de fondo biopsias en sacabocados de piel se recogen a partir de sujetos humanos y se incubaron durante 12-24 h en solución fijadora (2% de paraformaldehído con una solución de L-Lisina 0,75 M (pH 7,4) y 0,05 mM de peryodato de sodio) a 4 ° C como se ha descrito previamente 8. Las muestras son entonces cryoprotected en tampón fosfato salino (PBS) con 20% de glicerol a 4 º C durante hasta 1 semana, incrustado en un medio de montaje de temperatura óptima de corte (OCT), a continuación, se seccionó en 50 micras de espesor secciones en un criostato. El protocolo se describe a continuación está diseñado para 8 secciones de piel, el número máximo de secciones de piel posible someterse a técnicas de inmunohistoquímica de flotación libre en una placa de 96 pocillos. DÍA 1: 1. Prevención de la inmunorreactividad no específica en el estrato córneo <ol><li> Etiqueta de placa de 96 pocillos como se muestra en la Figura 1. </li&gt; <li> Añadir 150 l de Imagen FX-TI de señal (Image-TI), eficaz para el bloqueo de la tinción de fondo 11,12, en cada pocillo en la fila 1 de la placa de 96 pocillos. </li><li> Añadir 150 l de 1X PBS en cada pocillo en la fila 2 y 3 de la placa de 96 pocillos. </li><li> Adquirir dos secciones de 50 micras por paciente: una sección de la biopsia tomada en DL, una sección de la biopsia tomada en PT. Un asa de inoculación (LeLoop) se utiliza para transferir secciones de un enjuague a la siguiente para evitar daño morfológico. Transferir suavemente cada sección de 50 m, con un asa de inoculación, en un individuo y de la fila 1, que contiene imagen-IT. Incubar las secciones de imagen-IT durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador plana. </li><li> Enjuague secciones dos veces con PBS 1X (filas 2 y 3) durante 10 min a TA. Coloque la placa de bien en una mecedora plana entre enjuagues. </li></ol> 2. Preparación de 5% de BSA disolución de bloqueo y 1% de solución de enjuague <ol><li> Mientras que las secciones de biopsia están incubando en la imagen-IT, prepare 5% solución de bloqueoción (5% de BSA, TX-100, 0,3% solución 0,1 M de PBS-BSA al vórtice hasta que se disuelve completamente). </li><li> Añadir 150 l de solución de bloqueo BSA al 5% en cada pocillo de la fila 4. </li><li> El uso de un asa de inoculación, transferir secciones en pocillos individuales de solución de bloqueo BSA al 5%. Incubar las secciones de solución de bloqueo BSA 5% durante 1-2 horas a temperatura ambiente en un agitador plana. </li></ol> 3. Preparación de BSA al 1% solución de lavado y dilución de los anticuerpos primarios <ol><li> Mientras que las secciones están incubando en solución de bloqueo BSA al 5%, preparar la solución de enjuague 1% (1% de BSA, TX-100, solución de PBS-Vortex 0,1 M hasta 0,3% de BSA se disuelve completamente). </li><li> Mientras que las secciones están incubando en solución de bloqueo BSA al 5%, se diluye anticuerpos primarios en 1% de solución de lavado. <ol><li> Durante ocho secciones (8 x 150 l = 1,200 l) Se necesita un total de 1.200 l. Los anticuerpos primarios se componen de 1,500 l (aproximadamente 20% del volumen extra). </li><li> Las diluciones de los anticuerpos primarios: PGP, 1:500; Trk A,1:500 en BSA al 1% de solución de lavado. </li></ol></li></ol> 4. La incubación de las biopsias seccionados en el anticuerpo primario <ol><li> Añadir 150 l de anticuerpos primarios diluidos en los pocillos designados de la placa de 96 pocillos (fila 5). </li><li> Transferencia secciones de solución de bloqueo 5% (fila 4) en los pocillos de anticuerpos primarios designados (fila 5). </li><li> Selle la placa de 96 pocillos con parafilm y papel de aluminio para evitar que se sequen y exposición a la luz. </li><li> Incubar la placa de 96 pocillos O / N a 4 ° C en un agitador plana. </li></ol> DÍA 2: 5. Enjuague biopsias en BSA al 1% de solución de enjuague <ol><li> Añadir 150 l de solución de lavado BSA al 1% en cada pocillo en la fila 6, 7, y 8. </li><li> Enjuague secciones tres veces con solución de lavado BSA 1% (Filas 6, 7, y 8) durante 1 hora cada vez a temperatura ambiente. Cubra el plato bien con papel de aluminio y colocar en rocker plano entre enjuagues. </li></ol> 6. La dilución de anticuerpos secundarios &lt;ol&gt; <li> Mientras que las secciones se incubaron en el último enjuague de solución de lavado BSA al 1% (fila 8), diluir anticuerpos secundarios en solución de lavado BSA al 1%: <ol><li> Durante ocho secciones (8 x 150 l = 1,200 l) Se necesita un total de 1.200 l. La secundaria de anticuerpos se preparan en 1500 l (aproximadamente 20% del volumen extra). </li><li> Las diluciones de los anticuerpos secundarios: para PGP (Alexa Fluor 488 burro anti-conejo, 1:250), para Trk A (Alexa Fluor 647 burro anti-cabra, 1:250) en 1% BSA solución de lavado. </li></ol></li></ol> 7. La incubación de las biopsias seccionados en el anticuerpo secundario <ol><li> Añadir 150 l de anticuerpos secundarios diluidos en sus pocillos designados de la placa de 96 pocillos (Fila 9). </li><li> Transferencia secciones de solución de bloqueo 1% de BSA (Fila 8) en anticuerpo secundario bien (Fila 9). </li><li> Selle la placa de 96 pocillos con parafilm y papel de aluminio para evitar que se sequen y exposición a la luz. </li><li> Incubar las secciones de los anticuerpos secundarios designada O/ N a 4 ° C en un agitador plana. </li></ol> 8. Enjuague biopsias en BSA al 1% de solución de enjuague <ol><li> Añadir 150 l de solución de lavado BSA al 1% en cada pocillo en la fila 10, 11, y 12. </li><li> Enjuague secciones tres veces con solución de lavado BSA 1% (filas 10, 11, y 12) durante 1 hora cada vez a temperatura ambiente. Cubra el plato bien con papel de aluminio y colocar en una mecedora plana entre enjuagues. </li></ol> 9. Preparación de preparaciones microscópicas y montaje Biopsias seccionados <ol><li> Mientras que las secciones de biopsia están incubando en el último enjuague de solución de lavado BSA 1% (fila 12), preparar portaobjetos. </li><li> Coloque 50 l de BSA al 1% de solución de lavado en una diapositiva a la vez. </li><li> Retire las secciones del 1% BSA solución de lavado (Fila 12) y colocarlo en la 50 l gota de solución de lavado BSA al 1% en el portaobjetos de un microscopio designado. Después de la optimización de la posición de la sección, eliminar el exceso de solución de lavado BSA al 1% con una pipeta de vidrio abombada, tomando las precaucionespara evitar el contacto de la muestra. </li></ol> NOTA: Asegúrese de que la sección no está doblada, la muestra debe ser plana contra la superficie del portaobjetos. <ol start="4"><li> Colocar 1 gota de reactivo prolongar Oro de montaje con DAPI cerca de la biopsia en el portaobjetos de un microscopio Antifade. Tome un microscopio mm cubreobjetos de 22x22 y suavemente colóquelo sobre una biopsia y una gota de prolongar antifade reactivo de oro con caída DAPI. Repita para cada sección. </li><li> Vamos portaobjetos seco O / N a temperatura ambiente en la oscuridad. </li></ol> NOTA: Quite las burbujas de aire utilizando una punta de pipeta. Limpie el exceso de prolongar Gold antifade reactivo. Parte B: Confocal de imágenes 10. Confocal de imágenes <ol><li> Señales de fluorescencia de imagen utilizando una FluoView 500 microscopio confocal de barrido con una inmersión en aceite (1,3 NA) objetivo y zoom dos veces con software versión 5.0 FluoView 40X láser Olympus. </li&gt; <li> Utilice Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 647 para excitar el 543-nm HeNe láser verde y el 633-nm láser HeNe rojo, respectivamente. La señal de Alexa Fluor 488 está representado por una mirada verde tabla de consulta (LUT) y el Alexa Fluor 647 por una LUT rojo. </li><li> Ajuste las aberturas confocal para cada detector a 400 micras para mejorar las señales. Exploraciones secuenciales deben ser tomadas con una resolución de 1024 x 1024 para maximizar la separación de señales. </li><li> Captura tridimensional z-serie utilizando 1,2 micras intervalos de z a paso (sobre la base de la unidad de escaneado óptima calculada por el software FluoView) con Kalman promedio (dos marcos). </li></ol> Parte C: La visualización tridimensional y animación 11. Tridimensional Visualización y animación (3D) <ol><li> Archivos Fluoview abiertas en software Imaris x64 (versión 7.3, Bitplane AG) para visualizar los conjuntos de imágenes en 3D. </li><li> Ajuste mostrará cuando sea necesario para mejorar el contraste de la señal específica del nervio. </li><li> Crear un surface para visualizar el límite dermo-epidérmica. Utilice la herramienta de contorno en el modo de dibujo para dibujar el contorno. </li><li> Asignar una superficie semi-transparente a la frontera con el fin de ver las señales fluorescentes subyacentes. </li><li> Captura imágenes fijas de las señales fluorescentes en 3D para crear imágenes instantáneas de la película en 3D. </li><li> Utilice la función de animación para crear una película en 3D. Las imágenes se pueden girar 360 grados varias veces para mostrar cada señal por separado y combinado (Figuras 2, 3 y 4). Establezca la animación para crear películas que consta de 200 cuadros animados a 15 fotogramas por segundo. Guarde cada película como archivo AVI prima. </li><li> Comprimir la última película AVI con el software VirtualDub (versión 1.9.4). </li></ol>

<ol><li>Lauria, G., Holland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+innervation%3A+changes+with+aging%2C+topographic+location%2C+and+in+sensory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy.</a> J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).</li>
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<li>Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+biopsy+as+a+tool+to+assess+distal+small+fiber+innervation+in+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Technol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy.</a> Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).</li>
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<li>Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+among+pain%2C+sensory+loss%2C+and+small+nerve+fibers+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes.</a> Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).</li>
<li>Lauria, G., Morbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+swellings+predict+the+degeneration+of+epidermal+nerve+fibers+in+painful+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies.</a> Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).</li>
<li>Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+nerve+fiber+density%2C+axonal+swellings+and+QST+as+predictors+of+HIV+distal+sensory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy.</a> Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).</li>
<li>Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+27%3A+Neural+plasticity+after+nerve+injury+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration.</a> Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).</li>
</ol>

No hay conflictos de intereses que declarar.

Medición de IENFD ha sido ampliamente utilizado para determinar el grado de neuropatías periféricas 13,14. En la actualidad, el protocolo más comúnmente utilizado sólo mide las densidades de las fibras nerviosas que penetran en la membrana basal de la epidermis; no toma en consideración de ramificación axonal y / o cambios morfológicos de los nervios. Además, no se ha demostrado el análisis IENFD actual para correlacionar IENFD con la presencia de dolor en PN 15. Hemos ...

En la actualidad, es una práctica común para los médicos para cuantificar la densidad de fibras nerviosas intraepidérmicos, (IENFD) a partir de biopsias de piel en sacabocados, que pueden ser utilizados para diagnosticar neuropatías de fibras pequeñas 3, 6-8. Las biopsias se toman de la pierna distal (DL), 10 cm por encima del maléolo lateral y el muslo proximal (PT), 20 cm por debajo de la espina ilíaca anterior 9. Todos IENF están etiquetados de usar el producto gen de la proteína 9.5 (PGP), un marcador neuronal bandeja 10-12. En la actualidad, es una práctica estándar para diagnosticar neuropatías de fibras pequeñas utilizando IENFD determinado por tinción de PGP con microscopía de campo claro 6. Además, varios grupos de investigación han utilizado protocolos de inmunofluorescencia para PGP inmunohistoquímica 7-9. Neuropatía de fibras pequeñas se asocia con el dolor neuropático. Para entender mejor el papel de IENF esencial para el procesamiento del dolor, se desarrolló una técnica para co-label total de IENF con fibras que generan dolor. Nocicepcióntiva IENF, específicamente Aδ y las fibras C, se pueden estudiar a través de la co-etiquetado de IENF con PGP y el marcador nociceptivo, tropomiosina-receptor-quinasa A (Trk A) 5. Trk A es el receptor de alta afinidad para el factor de crecimiento nervioso que es esencial para el desarrollo de la nocicepción. Las fibras nerviosas nociceptivas A-positivos Trk son fibras peptidérgicas que expresan la sustancia P (SP) y el péptido relacionado con el gen calcitonina (CGRP). Anteriormente, Lauria y sus colegas aplicaron la técnica de doble etiquetado para estudiar PN, co-etiquetado IENF PGP-positiva con un marcador de 10 nociceptivo. En nuestro estudio anterior, hemos demostrado que Trk IENF A positivo, pero no Trk IENF A negativo, se upregulated en un modelo animal de la neuropatía diabética dolorosa 5. Esta técnica de co-etiquetado proporciona la capacidad para comparar la cuantificación de IENFD nociceptivo al total de IENFD y la capacidad para estudiar los cambios morfológicos asociados con PN. La capacidad de visualizar nociceptivo IENF y compañerasre cuantificación de IENFD total a la IENFD nociceptivo podría proporcionar evidencia objetiva para la presencia de dolor, y, posiblemente, una idea de la severidad del dolor asociado con PN. Esta técnica es también aplicable a la piel de modelos animales. En comparación con estudios previos, el protocolo actual describe métodos para el análisis de imagen en 3D, la creación de la oportunidad de evitar errores que podrían ocurrir en el análisis de imagen 2D.

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-4</td><td>Para componer 1X PBS</td></tr><tr><td>Image-IT FX Signal</td><td>Invitrogen</td><td>I36933</td><td>Image-IT</td></tr><tr><td>Protein Gene Product 9.5 (Conejo policlonal)</td><td>AbD Serotec</td><td>7863-0504</td><td>PGP</td></tr><tr><td>Tropomiosina relacionada-Quinasa A (cabra policlonal)</td><td>R& D Systems</td><td>AF1056</td><td>Trk A</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 burro &alpha;-conejo</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>AF488 burro &alpha;-cabra</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 burro &alpha;-cabra</td><td>Invitrogen</td><td>A21447</td><td>AF647 burro &alpha;-cabra</td></tr><tr><td>Albúmina, de suero bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Triton X- 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>TX-100</td></tr><tr><td>Bucle no calibrado</td><td>LeLoop</td><td>MP 199025</td><td></td></tr><tr><td>placa de ensayo de infusión Loop de 96 pocillos</td><td>Corning Incorporated</td> Placa de <td>3603</td><td>pocillos</td></tr><tr><td>Reactivo antidecoloración Prolong Gold con DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Microscopio Cubierta de vidrio 22x22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td>Cubreobjetos</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Portaobjetos de microscopio</td></tr><tr><td>Olympus Fluoview Microscopio confocal de barrido láser</td><td>Olympus</td><td>FV500</td><td>Microscopio confocal</td></tr><tr><td>Temperatura óptima de corte</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>OCT</td></tr><tr><td>Criostato Leica</td><td></td><td>Leica CM1850</td><td>Criostato</td></tr></tbody></table>

imagen tridimensional de nociceptivos fibras nerviosas intraepidérmicas en biopsias de piel humana

Three-dimensional Imaging of Nociceptive Intraepidermal Nerve Fibers in Human Skin Biopsies

Un punzón de biopsia de la piel se utiliza comúnmente para cuantificar la densidad de fibras nerviosas intraepidérmicos (IENFD) para el diagnóstico de 1,2 polineuropatía periférica. En la actualidad, es una práctica común para recoger biopsias de piel 3 mm a partir de la pata distal (DL) y el muslo proximal (PT) para la evaluación de las polineuropatías dependiente de la longitud 3. Sin embargo, debido a la naturaleza multidireccional de IENFs, es un reto para examinar superposición de estructuras nerviosas a través del análisis de formación de imágenes de dos dimensiones (2D). Alternativamente, imágenes en tres dimensiones (3D) podría proporcionar una mejor solución para este dilema. En el presente informe, se presentan métodos para la aplicación de imágenes en 3D para estudiar la neuropatía dolorosa (PN). Con el fin de identificar IENFs, muestras de piel se procesan para el análisis de inmunofluorescencia de producto de gen de la proteína 9.5 (PGP), un marcador neuronal sartén. En la actualidad, es una práctica estándar para diagnosticar neuropatías de fibras pequeñas utilizando IENFD disuadirminada por inmunohistoquímica utilizando PGP microscopía de campo claro 4. En el estudio actual, se aplicó análisis de doble inmunofluorescencia para identificar IENFD total de, utilizando PGP, y IENF nociceptivo, a través del uso de anticuerpos que reconocen la tropomiosina-receptor-quinasa A (Trk A), el receptor de alta afinidad para el factor de crecimiento de los nervios 5. Las ventajas de IENF co-tinción con PGP y Trk A anticuerpos beneficia el estudio de la PN por tinción con claridad, fibras nociceptivas PGP-positivos. Estas señales fluorescentes se pueden cuantificar para determinar los cambios morfológicos y IENFD nociceptivas de IENF asociados con PN. Las imágenes fluorescentes se adquirieron por microscopía confocal y se procesaron para análisis en 3D. 3D-imagen proporciona capacidades de rotación seguir analizando los cambios morfológicos asociados a la PN. En conjunto, co-tinción fluorescente, la imagen confocal y análisis 3D se benefician claramente el estudio de la PN.

Se aplicó el protocolo actual para estudiar la morfología de IENF en PT y DL biopsias de piel de pacientes con PN. La piel, a partir de tres sujetos, se recogió en la Universidad de Utah para demostrar la patomorfología asociado con PN. Los temas incluyen: Caso 1: varón de 51 años de edad, con antecedentes de PN de la diabetes tipo 2 (duración: 14 meses, la puntuación de dolor: 51), y Caso 2: varón de 56 años de edad, con antecedentes de PN de la diabetes tipo 2 (duración: 108 meses, la puntuación de dolor: 47), y Caso ...

Con el fin de estudiar los cambios en las fibras nerviosas nociceptivas intraepidérmicos (IENFs) en neuropatías dolorosas (PN), hemos desarrollado protocolos que podrían examinar directamente los cambios morfológicos observados en tres dimensiones en IENFs nociceptivas. El análisis tridimensional de IENFs tiene el potencial para evaluar los cambios morfológicos de IENF en PN.

Imagen tridimensional de nociceptivos Fibras Nerviosas intraepidérmicas en biopsias de piel humana

A punch biopsy of the skin is commonly used to quantify intraepidermal nerve fiber densities (IENFD) for the diagnosis of peripheral polyneuropathy 1,2. ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar inmunohistoquímica en secciones de biopsia de piel humana para estudiar los cambios morfológicos de las fibras nerviosas intraepidérmicas asociadas con la neuropatía dolorosa mediante imágenes tridimensionales. Esto se logra primero realizando un protocolo de inmunohistoquímica en secciones flotantes durante tres días sobre secciones individuales de biopsia de piel humana. El segundo paso consiste en obtener imágenes de secciones de piel de 50 micrones de grosor utilizando un microscopio confocal.A continuación, los archivos de imagen de vista de flujo se procesan con el software MRS para crear un archivo de película tridimensional de las imágenes inmunofluorescentes originales. El paso final consiste en utilizar el software vdw o uno similar para comprimir el archivo de película. En última instancia, los resultados de imágenes tridimensionales permiten la posibilidad de estudiar los cambios morfológicos asociados con la neuropatía dolorosa.Actualmente, la densidad intraoperatoria de fibras nerviosas epidérmicas se utiliza como un método cuantitativo para diagnosticar neuropatía. La marcación simultánea de estas fibras nerviosas intradérmicas con el biomarcador nociceptivo tiene el potencial de arrojar luz sobre el dolor asociado con esta complicación. El protocolo actual de imágenes bidimensionales presenta múltiples limitaciones, incluida la superposición de fibras nerviosas.En contraste, la imagen tridimensional ofrece la oportunidad de realizar un análisis adicional de los cambios morfológicos asociados con la neuropatía, como el hinchazón y palidez axonal, así como la medición del volumen axonal. Es importante tener en cuenta que deben tomarse medidas para obtener imágenes de calidad que permitan generar animaciones tridimensionales significativas, ya que este método puede proporcionar información sobre la neuropatía dolorosa. Asimismo, puede aplicarse a otras muestras, como cultivos orgánicos gruesos o cultivos celulares tridimensionales, para examinar y medir cambios complejos en la morfología tridimensional.Después de fijar y seccionar biopsias de piel humana según se describe en la parte escrita de este protocolo, etiquete una placa de 96 pozos que se utilizará para la tinción como se muestra en esta imagen. Luego agregue 150 microlitros de señal ITFX a cada pozo de la fila uno de la placa de 96 pozos etiquetada y transfiera con pipeta 150 microlitros de PBS 1X a todos los pozos de las filas dos y tres. Utilice un asa de inoculación para transferir una sección de 50 milímetros tomada de la biopsia de la pierna distal de un paciente a uno de los pozos que contiene la imagen.Luego, transfiera una sección de 50 milímetros tomada de la región proximal cinco del mismo paciente al siguiente pocillo que contiene imagen. Repita este procedimiento con las secciones de la pierna distal y del muslo proximal de otros tres pacientes. Incube las secciones en imagen sobre un agitador horizontal durante 30 minutos; mientras las secciones de biopsia están incubando en imagen, prepare una solución bloqueadora al 5 % y vortexee la solución hasta que el BSA se disuelva completamente. Transcurridos los 30 minutos, continúe con el siguiente paso.Transfiera las secciones al PBS en la fila dos y agite durante 10 minutos, seguido de un lavado en el PBS en la fila tres durante 10 minutos. Nuevamente con agitación, añada con pipeta 150 microlitros de BSA al 5 %, una solución bloqueadora, en cada pocillo de la fila cuatro y transfiera las secciones a estos pocillos. Incube las secciones en la solución bloqueadora de BSA al 5 % durante una a dos horas a temperatura ambiente en un agitador plano. Durante esta incubación, prepare la solución de lavado al 1 %, mezclando en vórtex hasta que la BSA se disuelva completamente, y luego diluya los anticuerpos primarios a la concentración requerida en esta solución.Luego, agregue 150 microlitros de anticuerpos primarios diluidos en los pocillos de la fila cinco de la placa de 96 pocillos. Y tras transcurrir el período de incubación, transfiera las secciones desde la solución de bloqueo hacia los pocillos correspondientes de anticuerpos primarios. A continuación, selle la placa con parafilm y papel de aluminio para evitar la desecación y la exposición a la luz, e incube durante toda la noche a cuatro grados Celsius sobre un agitador plano. Al día siguiente, agregue 150 microlitros de solución de lavado de BSA al 1 % en cada pocillo de las filas seis, siete y ocho, y pase las secciones a través de estos lavados durante una hora con agitación a temperatura ambiente, asegurándose de que la placa esté protegida de la luz durante cada lavado. Mientras las secciones están incubando en el último lavado con solución de lavado de BSA al 1 %, diluya los anticuerpos secundarios en la solución de lavado de BSA al 1 % según las instrucciones de la parte escrita de los protocolos.Una vez transcurrido el tiempo de incubación, añada 150 microlitros de anticuerpos secundarios diluidos en los pozos designados de la fila nueve de la placa de 96 pozos, transfiera las secciones a estos pozos y cubra la placa con paraformo y papel de aluminio, e incube durante la noche a cuatro grados Celsius en un agitador plano. Al día siguiente, añada 150 microlitros de solución de lavado al 1% BSA en cada pozo de las filas 10, 11 y 12, y lave las secciones en esta solución durante una hora cada vez, como antes.Mientras las secciones de biopsia se incuban en el último lavado de la solución de lavado al 1% de BSA, prepare portaobjetos colocando por separado 50 microlitros de la solución de lavado al 1% de BSA sobre cada portaobjeto. Retire la sección del último lavado y colóquela en la gota de 50 microlitros de la solución de lavado al 1% de BSA sobre el portaobjeto designado. Después de optimizar la posición de la sección, elimine el exceso de la solución de lavado al 1% de BSA con una pipeta de vidrio con pera, tomando precauciones para evitar tocar la muestra.Coloque una gota de reactivo de montaje prolongado con oro anti fade con un DPI cerca de la biopsia sobre el portaobjetos del microscopio. Luego tome un cubreobjetos de vidrio de 22 por 22 milímetros y colóquelo suavemente sobre la biopsia y la gota de reactivo de montaje. Elimine cualquier burbuja de aire utilizando la punta de una pipeta y retire el exceso de reactivo prolongado con oro.Reactivo Antifa. Repita para cada sección y deje secar las laminillas de microscopio durante la noche a temperatura ambiente y en la oscuridad al día siguiente. Observe las señales fluorescentes utilizando un microscopio confocal, específicamente un microscopio confocal de barrido láser Olympus Flow View 500 con un objetivo de inmersión en aceite de 40x y aumento de dos veces, empleando el software Flow View versión 5.0.Utilice Alexa piso 4 88 y Alexa piso 6 47 para excitar el láser verde de helio-neón de 543 nanómetros y el láser rojo de helio-neón de 633 nanómetros, respectivamente. Ajuste las aberturas confocales para cada detector a 400 micrones para realzar las señales. Las escaneos secuenciales deben realizarse con una resolución de 10 24 por 10 24.Para maximizar la separación de la señal, capture series tridimensionales en Z utilizando intervalos de paso Z de 1,2 micrómetros basados en la unidad de escaneo óptima, calculada por el software de vista de flujo con promediado de dos cuadros de Kalman; primero abra los archivos de vista de flujo en el software MRSX 64 o similar. Para visualizar los conjuntos de imágenes 3D, ajuste la visualización según sea necesario para realzar el contraste de la señal específica del nervio. Cree una superficie para visualizar el límite dérmico-epidérmico.Utilice la herramienta de contorno en modo dibujo para trazar el límite. Asigne una superficie semitransparente al límite con el fin de visualizar las señales fluorescentes subyacentes y capturar imágenes fijas de las señales fluorescentes en 3D. Para crear imágenes instantáneas de la película en 3D, utilice la función de animación para crear una animación de película en 3D configurada para generar películas compuestas por 200 fotogramas, animadas a 15 fotogramas por segundo.Guarde cada película como un archivo A VI sin comprimir y comprima la película A VI final con el software VirtualDub o similar. Este video muestra imágenes tridimensionales de fibras nerviosas intraepidérmicas nociceptivas. Esta primera imagen muestra fibras nerviosas intraepidérmicas positivas para PGP marcadas en verde, que representan el total de fibras nerviosas intraepidérmicas, y también fibras nerviosas intraepidérmicas positivas para Tack a marcadas en rojo, que representan las fibras nerviosas intraepidérmicas nociceptivas.Y finalmente, la imagen emergente muestra fibras nerviosas nociceptivas intraepidérmicas positivas para PGP en una muestra de piel del caso uno; la barra de escala representa 20 micrones. El siguiente video muestra imágenes tridimensionales de inflamaciones axónicas en fibras nerviosas intraepidérmicas de neuropatías dolorosas. Pueden observarse inflamaciones axónicas indicadas por puntas de flecha a lo largo de las fibras nerviosas intraepidérmicas marcadas con PGP mediante una señal verde dentro del plexo subdérmico.En una muestra de piel del caso dos, la barra de escala representa 10 micrones. Esta imagen 3D muestra la ramificación axonal en las fibras nerviosas intraepidérmicas de una neuropatía dolorosa. Puede observarse la ramificación axonal indicada por puntas de flecha a lo largo de las fibras nerviosas intraepidérmicas marcadas con PGP mediante una señal verde en una muestra de piel del caso tres.La barra de escala representa 20 micrones. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en cuatro días, con tres horas y media cada día para inmunohistoquímica y 35 minutos por muestra para imágenes confocales y animación 3D. Al intentar este procedimiento, es importante recordar transferir y montar adecuadamente los tejidos, tomando precauciones para evitar romper o rasgar las muestras del espécimen siguiendo este procedimiento. Otros métodos, como el análisis tridimensional de tric para la evaluación de la innovación cutánea, pueden realizarse para responder preguntas adicionales.¿Tiene, por ejemplo, la ramificación de las fibras nerviosas abdominales un papel importante en el desarrollo de la neuropatía dolorosa?

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

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Estudio in bioensayo para la medición específica de tejido de mediadores inflamatorios y nociceptivos

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Determinar el calor y el umbral de dolor mecánico en la piel inflamada de los sujetos humanos

Identificación de inmuno periféricos subtipos de fibras nerviosas sensoriales (y la detección de la expresión de proteínas en ella) son fundamentales para la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la sensación periférica. A continuación se describen los métodos para la preparación de las muestras de los tejidos periféricos / visceral, como los huesos y la piel del miembro, por inmunotinción específica de las fibras nerviosas sensoriales periféricas.

Preparación y tejido de fibras inmunotinción ratón nerviosas sensoriales que inervan la piel y los huesos de extremidades

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