Name: La evaluación de fenotipos neurodegenerativas en Drosophila Las neuronas dopaminérgicas mediante ensayos de Escalada y inmunotinción de todo el cerebro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprende a evaluar la neurodegeneración de neuronas dopaminérgicas en Drosophila mediante ensayos de escalada e inmunotinción de tirosina hidroxilasa. Este método permite cuantificar cambios en el comportamiento locomotor y la población neuronal.

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Damos las gracias a Leo Pallanck para las poblaciones de moscas, Christine Sommers de asistencia técnica y Gerasimos P. Sykiotis útil para los debates. Este trabajo fue financiado por el NIH subvención T32CA009363 formación de MCB

1. Sobresalto inducida Ensayo geotaxis Negativo <ol><li> Seleccione moscas del genotipo deseado, separarlos por sexo, grupo al azar en las cohortes de 20 a 30 animales y voltear en nuevos frascos de alimentos cada 2-3 días, las pruebas de cada conjunto de moscas (es decir, las cohortes de edades similares, una cohorte / genotipo) al menos una vez a la semana. </li><li> Treinta minutos antes de la prueba geotaxis negativa, anestesiar a las moscas con CO 2 y colocarlos en pre-etiquetados tubos de plástico transparentes hechos con dos frascos vacíos de alimentos (véase la Tabla de Materiales) unidas por sus aberturas con cinta adhesiva transparente (dimensiones de la cámara de 19 cm x 2,85 cm). En nuestras pruebas usamos normalmente 25 moscas / tubo. Nota. El tiempo de recuperación de la anestesia puede variar desde unos pocos minutos a varias horas (por ejemplo, S / N) y debe ser optimizado para los genotipos específicos ensayados. </li><li> Marque diferentes alturas (de 1 a 20 cm) en una hoja de papel secante y cinta el papel sobre una superfi verticalese, perpendicular a la banca. </li><li> Colocar los tubos en primera plana del periódico: los tubos deben estar alineados y tan cerca como sea posible del papel para permitir la medición de altura exacta. </li><li> Coloque la cámara digital (ver la tabla &quot;Equipo Especial&quot;) delante de los tubos, a una distancia de 20-30 cm del papel, en un soporte (por ejemplo, una caja de puntas de pipeta), seleccione la opción &quot;película&quot; y empezar a grabación, en este momento también se debe iniciar un temporizador para realizar un seguimiento del tiempo entre ensayos consecutivos. </li><li> Permitir que las moscas para recoger en la parte inferior del tubo golpeando ligeramente el tubo de pocos segundos (por ejemplo, 10 segundos). Este paso se debe realizar constantemente (es decir, misma duración, la misma fuerza, el mismo operador) durante todo el experimento. </li><li> Movimientos Registro moscas con la cámara digital de 10 seg. </li><li> Repita los pasos 1.5 a 1.7 catorce veces a intervalos de un minuto. </li><li> Analizar los datos: <ol type="a"><li> Cuente el número de moscas que están por encima de la2 marca cm después de 10 segundos por inspección visual de las películas grabadas. Nota: En las condiciones de ensayo geotaxis comportamiento negativo de las moscas no duró más allá de los primeros 10 segundos después de la sorprendente (por ejemplo, las moscas empezaron a moverse en todas las direcciones 10 segundos después de asustarlos). La distancia mínima subió por las moscas de control (es decir, 1 semana de antigüedad moscas que expresan el conductor THGal4, véase la leyenda de la figura 1) en esta ventana de tiempo fue de 2 cm. Por lo tanto, se utilizó la marca de 2 cm como referencia para el análisis de las actividades de escalada de moscas de diferentes edades y genotipos 10 segundos después de iniciar el comportamiento. Estos parámetros pueden requerir el ajuste para tener en cuenta las diferencias en el comportamiento de las moscas a prueba (por ejemplo, debido a los diferentes antecedentes genéticos o las condiciones de laboratorio). Observe que en nuestras condiciones de ensayo, todos los genotipos probados realiza peor o similar a las moscas del genotipo control. </li><li> Tomar la media de los resultados de los quinceensayos. </li><li> Promedio Express como un porcentaje del número total de moscas en el tubo (= actividad de escalada%); el número de repeticiones (N) viene dado por el número de cohortes independientes ensayadas para cada genotipo </li><li> Evaluar la significación estadística entre los diferentes genotipos en el tiempo. Esto se puede lograr con la prueba de la t de Student (cuando se comparan dos genotipos) o un análisis de 2 vías ANOVA seguido de la prueba de Bonferroni post hoc (cuando se realizan comparaciones múltiples) utilizando softwares comerciales tales como GraphPad (GraphPad Software, Inc.La Jolla, CA, EE.UU.). </li></ol></li></ol> Nota Llevamos a cabo todos nuestros ensayos al mismo tiempo del día, a TA y bajo las mismas condiciones de luz. Mantener las moscas en un entorno de ciclo de 12 horas de luz / oscuridad es aconsejable controlar el efecto de los ritmos circadianos en el comportamiento locomotor de las moscas. 2. Inmunofluorescencia tirosina hidroxilasaEnsayo de Montes Whole Brain Soluciones y tampones Solución de fijación: 4% de paraformaldehído (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) Tampón de lavado: 0,1% de Triton X-100 en PBS El tampón de bloqueo: 0,1 M de Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M de NaCl, 0,1% de Triton X-100 y 0,5% de BSA Medios de montaje: Mowiol-DABCO (ver protocolo descrito en Harlow E, Lane D., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratorios Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE.UU., 10:418 (1988)) Procedimiento <ol><li> Ponga moscas en una placa de disección lleno de 70% de EtOH durante aproximadamente 1 min para eliminar la cera de la cutícula. </li><li> Transferencia vuela a otro plato de disección llena de helado de PBS. </li><li> Disección del cerebro: <ol type="a"><li> Coloque la marcha con el costado ventral (opcional: las alas y las piernas quitar). </li><li> Tire de la cabeza del cuerpo: utilice un conjunto de pinzas paraaferrarse al cuerpo y otro para aferrarse a la cutícula bajo la mirada para no dañar el cerebro </li><li> Retire la probóscide. </li><li> Espera a la cabeza de la cutícula en lados opuestos de la ranura izquierda abierta después de la eliminación de la trompa y tirar en direcciones opuestas hasta que el cerebro se elimina de la cápsula de la cabeza. </li><li> Retirar toda la cutícula del cerebro. </li><li> Quite todo el tejido traqueal lleno de aire, lo que evitará que el cerebro flotando en las siguientes etapas de incubación. </li></ol></li><li> Cortar unos milímetros de la punta de la punta de la pipeta P-200 y se equilibra con una solución al 0,1% de Triton X-100/PBS </li><li> Uso del preparado punta P-200 pipeta, transferir los cerebros a un tubo Eppendorf de 0,5 ml lleno con 0,5 ml de PFA al 4% / PBS y mantener en hielo hasta la disección es completa. </li><li> Fijar el cerebro a temperatura ambiente durante 20 min: aplicar una rotación suave, poniendo los tubos Eppendorf en un rack y colocar el bastidor en una nutator. </li><li> Quite el fijadorel uso de un P-1000 micro pipeta, añadir 0,5 ml de 0,1% Triton X-100/PBS, mezclar por inversión y dejar incubar durante 1 min; repetir este paso de lavado una vez. </li><li> Retire el buffer del segundo lavado, añadir 0,5 ml de 0,1% Triton X-100/PBS y dejar incubar a temperatura ambiente durante 20 min, repita este paso dos veces. </li><li> Retirar el tampón de lavado y dejar que los cerebros se incuban en tampón de bloqueo (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M de NaCl, 0,1% de Triton X-100 y 0,5% de BSA) durante 1 hora a TA. </li><li> Incubar el cerebro con una dilución 1:100 de anticuerpo anti-TH (vea la &quot;Tabla de reactivos específicos&quot;) en solución de bloqueo, durante dos días, a 4 ° C, con una rotación suave (vea el paso 2.6.). </li><li> Repita los pasos de lavado 2.7. y 2,8 .. </li><li> Equilibrar los cerebros con una dilución 1:200 de solución de bloqueo antibodyin secundaria, durante dos días, a 4 ° C, con rotación suave. </li><li> Repita los pasos de lavado 2.7. y 2,8 .. </li><li> Preparar los portaobjetos de montaje como se ilustra en la Figura 2A: <ol type="a"><li> Ladd 2 X 25 l gotas de medio de montaje a una cubierta de vidrio (24 x 60 mm,. no 1.5). </li><li> Coloque dos cubiertas de vidrio (tamaño 18 x 18 mm,. N º 2) en el soporte de montaje, dejando un hueco en el centro de la diapositiva y dejar secar. </li></ol> Nota. Compruebe el soporte de la muestra en el escenario de su microscopio confocal. Puede hacer que el vidrio de cubierta del mismo tamaño de un x 75 mm diapositiva 25 uniendo un x 22 mm 1,5 vidrio de cubierta 22 a uno de los extremos (utilizar esmalte de uñas y cinta). </li><li> Eliminar el tampón de lavado, se añaden 50 l de medio de montaje y permitir que los cerebros se equilibren con él la pipeta hacia arriba y hacia abajo. </li><li> El uso de un corte P-200 punta de pipeta (véase el paso 2.4) transferir los cerebros a la diapositiva en el espacio entre los dos cubreobjetos y cubrir con un cubreobjetos no. 1.5 (véase la figura 2, para orientar a los cerebros de la diapositiva ver 7). Nota: las muestras se montan entre dos cubiertas de vidrio para permitir la visualización tanto de la anterior y el posterior lado del cerebro. </li><li> Llenar todo el espacio entre los cubreobjetos con medio de montaje; pipeta de una esquina a eliminar todo el aire, dejar secar y sellar con esmalte de uñas. </li><li> Para evaluar el número de neuronas dopaminérgicas en un grupo específico adquirir una serie de secciones ópticas a lo largo del eje z con un paso de tamaño 1,0 micras usando un microscopio confocal (para la identificación anatómica de las agrupaciones dopaminérgicas en el cerebro adulto de Drosophila ver 7). </li></ol>

<ol><li>Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly,, Botella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine-dependent+neurodegeneration+in+Drosophila+models+of+familial+and+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).</li>
<li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li>
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<li>White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205(2010).</li>
<li>Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+pioneer+a+new+approach+to+drug+discovery+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease.</a> Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li>
<li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).</li>
</ol>

Declaramos que no tenemos intereses financieros en competencia.

Los ensayos descritos aquí proporcionar un enfoque útil para estudiar la función de genes específicos, las vías de señalización o compuestos pequeños en el mantenimiento de las neuronas DA en el envejecimiento, así como en diferentes bases genéticas de enfermedades vinculadas (revisado en 5). El comportamiento negativo de sobresalto geotaxis inducida de Drosophila se ha usado ampliamente como un funcional de lectura para la funcionalidad de las neuronas DA en diferentes f...

La especificidad de los ensayos descritos aquí se basa en el uso de una línea de la mosca Gal4 que explota las secuencias reguladoras del gen de la tirosina hidroxilasa para lograr la expresión específica en las neuronas dopaminérgicas 3. La tirosina hidroxilasa cataliza la primera y la tasa de limitación de paso en la síntesis de dopamina. TH inmunoreactividad en los adultos se superpone cerebro de la mosca con la de la dopamina, lo que hace TH un buen candidato para identificar las neuronas DA in vivo (véase, por ejemplo 6). Por otra parte, el patrón de expresión de THGal4 es más específico que el de otras líneas de Gal4 como DdcGal4, que contiene secuencias reguladoras del gen de la dopa decarboxilasa y conduce la expresión transgénica no sólo en las neuronas DA, sino también en las neuronas serotoninérgicas y subconjuntos de células gliales 3 . Feany y Bender (2000) observaron por primera vez que la expresión de pan-neuronal del gen de la α-sinucleína humana DP-ligado acelera la pérdida progresiva de la estacióncomportamiento rtle inducida geotaxis negativa en Drosophila. Hemos observado resultados similares usando la línea específica de neuronas DA THGal4 para conducir la expresiónde la α-sinucleína transgén 10 y utilizado esta funcionalidad de lectura para estudiar el papel neuroprotector de la vía Nrf2 en este Drosophila modelo de la EP 14. El ensayo específico que se describe aquí es una adaptación de 2 y 3. El cerebro de Drosophila contiene más de 100 neuronas DA, dispuestos en al menos 5 grupos diferentes (pPL1, pPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3) que se pueden visualizar en montajes de todo el cerebro por microscopía confocal (véase, por ejemplo 11 y 7). Es todavía es controvertido si o no el número de neuronas DA en el cerebro disminuye Drosophila con 9 años de edad, 11, sin embargo, la neurodegeneración dependiente de la edad se observó en las moscas que se han mutado genes PD-enlazadas / sobreexpresa para modelar enfermedades humanas5. La expresión de humano α-sinucleína en las neuronas DA tiene tal efecto y, por lo tanto, se ha utilizado como un modelo para la EP. A continuación se describe un ensayo para las neuronas DA cuentan en todo el cerebro se monta utilizando TH como marcador celular. Este ensayo ha sido adaptado de 13 y 10.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpo anti-tirosina hidroxilasa de conejo</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con TRITC de burro</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-026-152</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipamiento</td></tr><tr><td>Viales de poliestireno</td><td>VWR</td><td>89092-734</td><td>28.5 x 95 mm</td></tr><tr><td>Cámara digital</td><td>Canon</td><td>PowerShot A3100IS (modelo)</td><td>12.1 Megapíxeles 4X Zoom Óptico</td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio no. 1.5</td><td>VWR</td><td>48366 205 48393 252</td><td>Tamaños: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio no. 2</td><td>VWR</td><td>48368-040</td><td>Tamaño: 18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Platos de disección</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70543-01</td><td>Tamaño: 30 mm O.D.</td></tr><tr><td>Pinzas Dumostar No. 5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72705-01</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscopio</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000 (modelo)</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Leica</td><td>SP2 o SP5 (modelo)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabla de materiales.</td></tr></tbody></table>

la evaluación de fenotipos neurodegenerativas en<em&gt; drosophila</em&gt; las neuronas dopaminérgicas mediante ensayos de escalada y inmunotinción de todo el cerebro

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster es una valiosa organismo modelo para estudiar el envejecimiento y los procesos patológicos degenerativos en el sistema nervioso. Las ventajas de la marcha como un sistema experimental incluyen su maleabilidad genética, vida corta y la posibilidad de observar y analizar cuantitativamente comportamientos complejos. La expresión de los genes vinculados a la enfermedad en poblaciones neuronales específicas del cerebro de Drosophila, se puede utilizar para modelar enfermedades neurodegenerativas humanas como el Parkinson y el Alzheimer 5. Las neuronas dopaminérgicas (DA) se encuentran entre las poblaciones neuronales más vulnerables en el envejecimiento del cerebro humano. En la enfermedad de Parkinson (PD), el trastorno del movimiento más común neurodegenerativa, la pérdida acelerada de neuronas DA conduce a una disminución progresiva e irreversible de la función locomotora. Además de la edad y la exposición a las toxinas ambientales, la pérdida de las neuronas DA se ve agravada por las mutaciones específicas en la codificacióno regiones promotoras de varios genes. La identificación de tales alelos asociada a la EP proporciona la base experimental para el uso de Drosophila como modelo para estudiar la neurodegeneración de las neuronas DA in vivo. Por ejemplo, la expresión del gen humano α-sinucleína PD-vinculados en Drosophila neuronas DA recapitula algunas características de la enfermedad humana, por ejemplo la pérdida progresiva de las neuronas dopaminérgicas y la disminución de la función locomotora 2. En consecuencia, este modelo ha sido utilizado con éxito para identificar posibles dianas terapéuticas en la EP 8. A continuación se describen dos ensayos que habitualmente se han utilizado para estudiar la neurodegeneración dependiente de la edad de las neuronas DA en Drosophila: un ensayo de escalada en base a la respuesta de sobresalto inducida geotaxis inmunotinción negativa y la tirosina hidroxilasa de todo el cerebro adulto monta para controlar el número de neuronas DA en las diferentes edades. En ambos casos, la expresión in vivo de t UASransgenes específicamente en las neuronas DA se puede lograr mediante el uso de una tirosina hidroxilasa (TH) de la línea controlador promotor Gal4-3, 10.

Hemos utilizado los ensayos descritos aquí para estudiar el papel de la vía Nrf2 protectora estrés en un modelo de Drosophila de la EP 14. Este modelo se basa en la expresión del gen de la α-sinucleína humana en las neuronas DA utilizando un TH Gal4 conductor 2, 10. La Figura 1 muestra un resultado representativo de un geotaxis negativos inducidos por sobresalto (escalada) de ensayo en las moscas macho que expresan diferentes transgenes bajo el...

A continuación se describen dos ensayos que se han establecido para estudiar la neurodegeneración dependiente de la edad de las neuronas dopaminérgicas (DA) en<em&gt; Drosophila</em&gt;: La escalada / ensayo geotaxis negativo sobresalto inducida que permite estudiar los efectos funcionales de las neuronas DA degeneración y la inmunomarcación tirosina hidroxilasa, que se utiliza para identificar y contar las neuronas DA en montajes de todo el cerebro.

La evaluación de fenotipos neurodegenerativas en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las neuronas dopaminérgicas mediante ensayos de Escalada y inmunotinción de todo el cerebro

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la neurodegeneración de los neuronas dopaminérgicas en drosophila transgénica. Esto se logra primero expresando los transgenes deseados bajo el control del promotor de la tirosina hidroxilasa a través del sistema GAL cuatro UAS. El segundo paso del procedimiento es recolectar moscas del genotipo deseado, separarlas por género y envejecerlas.El tercer paso es probar la actividad de escalada de las moscas por el eje geo negativo a medida que envejecen. El paso final es contar el número de neuronas dopaminérgicas de cerebros diseccionados recolectados a diferentes edades. En última instancia, los resultados mostrarán cambios en el comportamiento locomotor del animal y en el tamaño de su población de neuronas dopaminérgicas.Las implicaciones de este enfoque se extienden hacia la terapia de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson. Este enfoque puede ayudar a identificar genes neuroprotectores e intervenciones farmacológicas. Para configurar el ensayo, seleccione moscas emparejadas por edad de los genotipos deseados. Sepárelas por género y agrúpelas al azar en cohortes de 20 a 30 animales.Cada cohorte representa una muestra estadística. Mantenga las cohortes en un ciclo de 12 horas de luz y oscuridad para controlar los efectos de los ritmos circadianos en el comportamiento locomotor, y a una temperatura que pueda replicarse en la sala de pruebas. Cambie los viales de la cohorte cada dos o tres días y pruébelos semanalmente a una hora constante.30 minutos antes de la prueba, anestesiar cada cohorte con dióxido de carbono y transferirlas a un tubo de plástico etiquetado hecho de viales de comida vacíos unidos con cinta adhesiva. Las moscas deberían estar despiertas después de cinco a 10 minutos, pero la recuperación completa de la anestesia varía según la edad y el genotipo y debe optimizarse. Ahora. Cree una escala de altura para ver detrás de los viales de prueba.Marque distancias entre uno y 20 centímetros en un pedazo de papel blanco. Luego asegure la escala en posición. Ahora alinee los tubos a probar contra la escala a unos 20 a 30 centímetros de distancia.Coloque una cámara digital con una vista cuadrada de los viales. Asegúrese de que las etiquetas de los tubos y la escala estén claramente a la vista. Una vez posicionado, inicie la grabación y comience un temporizador digital.Ahora golpee un tubo durante unos segundos. Todas las moscas deberían recoger el fondo del tubo. Asegúrese de hacer este paso consistentemente con la misma duración y misma fuerza durante todo el experimento.Después de un minuto, repita el knockdown nuevamente para el segundo de 15 ensayos consecutivos. Cuando se completen los 15 ensayos, devuelva las moscas a viales frescos inspeccionando visualmente los videos. Para cada uno de los 15 ensayos realizados por cohorte, cuente el número de moscas por encima de la marca de dos centímetros.Después de que hayan transcurrido 10 segundos, la marca de dos centímetros se determina empíricamente, es la distancia que todos los controles cruzan después de 10 segundos en muchas de las edades que se están probando. Tome la puntuación promedio de los 15 ensayos y exprésela como un porcentaje de los miembros de la cohorte que cruzaron la marca. El número de repeticiones estadísticas es igual al número de cohortes probadas para cada grupo, no por los 15 ensayos.Evalúe la significancia estadística entre diferentes genotipos utilizando una prueba T de estudiante, anova u otros métodos de análisis apropiados. Coloque las moscas en un plato de disección con 70% de etanol durante aproximadamente un minuto. Para quitar la cera de la cutícula.Luego transfiera las moscas a otro plato de disección lleno de PBS helado, y proceda a diseccionar el cerebro. Coloque la mosca con el lado ventral hacia arriba y opcionalmente retire las alas y las patas. Utilice un juego de pinzas para sujetar el cuerpo y otro para sujetar la cutícula debajo del ojo.Luego tire de la cabeza del cuerpo. A continuación, retire la probósid por tirando de ella de la cabeza. Luego agarra la cutícula de la cabeza en los bordes opuestos del nuevo agujero y tira en direcciones opuestas hasta que se retire el cerebro de la cápsula de la cabeza.Ahora, delicadamente, retire el resto de la cutícula de la superficie del cerebro. Luego retire todo el tejido traqueal lleno de aire. Esto evitará que el cerebro flote durante los siguientes pasos de incubación.Prepare una pipeta de manejo de cerebro de una punta de pipeta P 200. Corte unos milímetros y equilibre con 0.1% Triton X 100 en PBS. Transfiera los cerebros a un tubo de medio mililitro completamente lleno con 4% PFA en PBS.Fije los cerebros a temperatura ambiente durante 20 minutos con rotación suave. Después de 20 minutos, use una pipeta P 1000 para reemplazar el fijador con medio mililitro de tampón de lavado siendo 0.1% Triton X 100 en PBS. Mezcle por inversión y permita que los cerebros incuben durante un minuto antes de reemplazar el tampón de lavado.Después de un minuto, reemplace el tampón de lavado una segunda vez e incube los cerebros a temperatura ambiente durante 20 minutos. Luego reemplace el tampón de lavado por tercera vez e incube los cerebros durante otros 20 minutos. Ahora, retire el tampón de lavado y deje que los cerebros incuben en medio milímetro de tampón de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente.Después de una hora, agregue una dilución de uno a 100 de antit anticuerpo en solución de bloqueo. Déjelo incubar durante dos días a cuatro grados Celsius con rotación suave. Para quitar el bloqueo, repita los lavados utilizados para quitar el fijador.Luego equilibre los cerebros con medio mililitro de una dilución de uno a 200 de anticuerpo secundario en solución de bloqueo durante dos días a cuatro grados Celsius con rotación suave. Unos días después, retire el anticuerpo secundario utilizando el mismo procedimiento de lavado. Para preparar las diapositivas de montaje, agregue 2 gotas de 25 microlitros de medio de montaje a un portaobjetos.Coloque dos portaobjetos en el medio de montaje con un espacio en el medio. Permita que las diapositivas se sequen. Si el ancho de la diapositiva de montaje no se ajusta al escenario del microscopio confocal, use esmalte de uñas para colocar un portaobjetos de 22 por 22 milímetros en la diapositiva para que se ajuste correctamente.Ahora reemplace la solución en la que se encuentran los cerebros con 50 microlitros de medio de montaje. Equilibre los cerebros con el medio de montaje pipeteando con una punta P 200 cortada. Luego, use una punta P 200 cortada para transferir los cerebros a la zanja.En la diapositiva de montaje, oriente los cerebros para ver su lado anterior o posterior. Luego cúbralos con un portaobjetos número 1.5 y desde una esquina, llene el espacio entre los portaobjetos con medio de montaje para eliminar todo el aire. Permita que las diapositivas se sequen y luego séllelas con esmalte de uñas antes de su examen.La alfa-sinucleína humana se expresó en neuronas DA usando el controlador TH GAL cuatro en el ensayo de escalada. Los machos que expresan este transgén exhibieron un declive acelerado en relación con los controles emparejados por edad y con moscas que coexpresan el compañero de unión de NRF 2D NA. Las hembras Math S mostraron resultados similares comparando moscas macho de cuatro semanas de diferentes genotipos.Se utilizaron conteos de neuronas DA basados en inmunofluorescencia Th para cuantificar el número de neuronas PPL uno. Se encontró una pérdida pequeña pero significativa de neuronas PPL uno en moscas que expresan alfa-sinucleína. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la neurodegeneración de las neuronas varg en

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Los ensayos para medir el comportamiento de las funciones del aparato locomotor, el aprendizaje y las habilidades de memoria...

Locomotor ensayo, aprendizaje, memoria y déficit en Drosophila Los modelos de neurodegeneración

Este video describe un método simple para cuantificar la locomoción de la mosca y muestra el ensayo de escalada realizado. El ensayo de escalada con mosca es una prueba general de la función motora que se basa en una respuesta geotaxis negativa.

Ensayo de escalada con mosca: un método para probar la locomoción general en Drosophila melanogaster

Presentamos un ensayo de geotaxis negativo optimizado, barato y fiable en Drosophila melanogaster como modelo para trastornos neurodegenerativos. Al ser más sensible a los defectos locomotores leves, este ensayo ayudará a detectar posibles interacciones genéticas y objetivos farmacológicos.

Análisis cuantitativo de los Defectos de escalada en un modelo de Drosophila de enfermedades neurodegenerativas

Drosophila se utiliza ampliamente como un sistema modelo para estudiar la neurodegeneración. Este protocolo describe un método por el cual la degeneración, como se determina por la formación de vacuolas en el cerebro, se puede cuantificar. También minimiza los efectos debido al procedimiento experimental por el procesamiento y control de seccionamiento y moscas experimentales como una muestra.

La histología de masas para cuantificar la neurodegeneración en<em&gt; Drosophila</em

Este protocolo describe la disección y el immunostaining del adulto de Drosophila melanogaster los tejidos del cerebro. Específicamente, este protocolo destaca el uso de setas neuronas cuerpo y fotorreceptor Drosophila como subconjuntos neuronal de ejemplo que pueden utilizarse con precisión para descubrir principios generales subyacentes a muchos aspectos del desarrollo neuronal.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Este protocolo paso a paso analiza el comportamiento de geotaxis negativa de Drosophila mediante un sistema automatizado de varios cilindro que aloja cientos de moscas y sincroniza su acción por un motor eléctrico. Sobre sincronización, es analizar comportamiento mosca geotaxis negativa, grabados digitalmente y analizados usando el software RflyDetection diseñado.

Un ensayo Geotaxis negativa iterativo rápido automatizado para analizar comportamiento escalar adulto en un modelo de Drosophila de la neurodegeneración

Hemos desarrollado un flujo de trabajo sencillo y adaptable para extraer datos cuantitativos de estudios biológicos celulares basado en la proyección de imagen de la fluorescencia de la agregación de la proteína y autofagia flujo en sistema nervioso central de Drosophila modelos de neurodegeneración.

Biología celular cuantitativa de neurodegeneración en Drosophila mediante análisis imparcial de fluorescencia etiquetas proteínas con ImageJ

Presentamos un protocolo utilizando un enfoque genético directo para la detección de mutantes que exhiben neurodegeneración en Drosophila melanogaster. Incorpora un ensayo de escalada, análisis histológico, mapeo genético y secuenciación de ADN para identificar en última instancia nuevos genes relacionados con el proceso de neuroprotección.

En Vivo Forward Genetic Screen para Identificar Nuevos Genes Neuroprotectores en Drosophila melanogaster

Este estudio presenta un protocolo simplificado para el procesamiento de tejidos que involucra decapitación, fijación, criosección, tinción de fluorescencia, inmunotinción e imágenes, que puede extenderse a imágenes confocales y multifotónicas. El método mantiene una eficacia comparable a las disecciones complejas, evitando la necesidad de habilidades motoras avanzadas. El análisis cuantitativo de imágenes ofrece un amplio potencial de investigación.

Criosección directa de cabezas de Drosophila para mejorar la tinción de fluorescencia cerebral y la inmunotinción

El protocolo presenta un método rentable y de alto rendimiento para evaluar la neurotoxicidad en la mosca de la fruta a través de la cuantificación de la disfunción locomotora como alternativa a los modelos tradicionales de mamíferos. Su objetivo es evaluar los efectos neurotóxicos de compuestos farmacéuticos, agentes ambientales o modificaciones genéticas utilizando un modelo sensible, reproducible y éticamente favorable.

Análisis conductual de la disfunción locomotora en Drosophila melanogaster como lectura de la neurotoxicidad

Aprende a evaluar la neurodegeneración de neuronas dopaminérgicas en Drosophila mediante ensayos de escalada e inmunotinción de tirosina hidroxilasa. Este método permite cuantificar cambios en el comportamiento locomotor y la población neuronal.

La evaluación de fenotipos neurodegenerativas en Drosophila Las neuronas dopaminérgicas mediante ensayos de Escalada y inmunotinción de todo el cerebro (Video) | JoVE Journal

La evaluación de fenotipos neurodegenerativas en

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