La evaluación de fenotipos neurodegenerativas en Drosophila Las neuronas dopaminérgicas mediante ensayos de Escalada y inmunotinción de todo el cerebro

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la neurodegeneración de las neuronas dopaminérgicas en drosófila transgénica. Esto se logra expresando primero los transgenes deseados bajo el control del promotor de tirosina hidroxilasa a través del sistema GAL four UAS. El segundo paso del procedimiento es recolectar moscas del genotipo deseado, separarlas por sexo y edad.

El tercer paso es probar la actividad trepadora de las moscas por eje geográfico negativo a medida que envejecen. El paso final es contar el número de neuronas dopaminérgicas de cerebros disecados recolectadas a diferentes edades. En última instancia, los resultados mostrarán cambios en el comportamiento locomotor del animal y en el tamaño de su población de neuronas dopaminérgicas.

Las implicaciones de este enfoque se extienden hacia la terapia de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson. Este enfoque puede ayudar a identificar genes neuroprotectores e intervenciones farmacológicas Para establecer el ensayo, seleccione moscas de la misma edad de los genotipos deseados. Sepáralos por género y agrúpalos aleatoriamente en cohortes de 20 a 30 animales.

Cada cohorte representa una muestra estadística. Mantener las cohortes en un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas para controlar los efectos de los ritmos circadianos en el comportamiento locomotor, y a una temperatura que pueda replicarse en la sala de pruebas. Cambie los viales de la cohorte cada dos o tres días y pruébelos semanalmente a una hora constante.

30 minutos antes de la prueba, anestesia a cada cohorte con dióxido de carbono y transfiéralos a un tubo de plástico etiquetado hecho de viales de comida vacíos unidos con cinta adhesiva. Las moscas deben estar despiertas después de cinco a 10 minutos, pero la recuperación completa de la anestesia varía con la edad y el genotipo y debe optimizarse. Ahora. Cree una escala de altura para ver detrás de los viales de prueba.

Marque distancias de entre uno y 20 centímetros en una hoja de papel blanco. A continuación, fije la báscula en su posición. Ahora alinee los tubos que se van a probar contra la escala a unos 20 o 30 centímetros de distancia.

Coloque una cámara digital con una vista cuadrada de los viales. Asegúrese de que las etiquetas de los tubos y la báscula estén claramente a la vista. Una vez posicionado, inicie la grabación y ponga en marcha un temporizador digital.

Ahora golpea un tubo durante unos segundos. Todas las moscas deben recoger el fondo del tubo. Asegúrate de hacer este paso de forma coherente con la misma duración y la misma fuerza durante todo el experimento.

Después de un minuto, repita el derribo nuevamente para el segundo de 15 intentos consecutivos. Cuando se hayan completado los 15 ensayos, devuelva las moscas a viales nuevos inspeccionando visualmente las películas. Para cada uno de los 15 ensayos realizados por cohorte, cuente el número de moscas por encima de la marca de dos centímetros.

Una vez transcurridos 10 segundos, se determina empíricamente la marca de los dos centímetros, es la distancia que recorren todos los controles después de 10 segundos en muchas de las edades que se están evaluando. Tome la puntuación promedio de los 15 ensayos y exprésela como un porcentaje de miembros de la cohorte que cruzaron la marca. El número de repeticiones estadísticas es igual al número de cohortes evaluadas para cada grupo, no por los 15 ensayos.

Evaluar la significación estadística entre los diferentes genotipos utilizando la prueba T de Student, el anova u otros métodos de análisis apropiados. Coloque las moscas en un plato de disección con etanol al 70% durante aproximadamente un minuto. Para eliminar la cera de la cutícula.

Luego, transfiera las moscas a otro plato de disección lleno de PBS helado y proceda a diseccionar el cerebro. Coloque la mosca con el lado ventral hacia arriba y, opcionalmente, retire las alas y las patas. Use un juego de pinzas para sujetar el cuerpo y otro para sujetar la cutícula debajo del ojo.

A continuación, separa la cabeza del cuerpo. A continuación, retire el probos tirando de él fuera de la cabeza. A continuación, sujete la cutícula de la cabeza en los bordes opuestos del nuevo orificio y tire en direcciones opuestas hasta que el cerebro se extraiga de la cápsula de la cabeza.

Ahora, con delicadeza, retire la cutícula restante de la superficie del cerebro. A continuación, retire todo el tejido traqueal lleno de aire. Esto evitará que el cerebro flote durante los siguientes pasos de incubación.

Prepare una pipeta de manipulación cerebral a partir de una punta de pipeta P 200. Corta unos milímetros y equilibra con 0.1%Triton X 100 en PBS. Transfiera los cerebros a un tubo de medio mililitro completamente lleno con 4% de PFA en PBS.

Fije los cerebros a temperatura ambiente durante 20 minutos con una rotación suave. Pasados los 20 minutos, utilice una pipeta P 1000 para sustituir el fijador por medio mililitro de tampón de lavado que sea 0,1%Triton X 100 en PBS. Mezcle por inversión y deje que los cerebros se incuben durante un minuto antes de reemplazar el tampón de lavado.

Después de un minuto, vuelva a colocar el tampón de lavado por segunda vez e incube los cerebros a temperatura ambiente durante 20 minutos. Luego reemplace el tampón de lavado por tercera vez e incube los cerebros durante otros 20 minutos. Ahora, retire el tampón de lavado y deje que los cerebros se incuben en medio milímetro de tampón de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente.

Después de una hora, agregue una dilución de uno a 100 del anticuerpo antit en la solución bloqueante. Déjalo incubar durante dos días a cuatro grados centígrados con una rotación suave. Para quitar el bloqueo, repita los lavados utilizados para quitar la fijación.

A continuación, equilibre el cerebro con medio mililitro de uno a 200 diluidos de anticuerpo secundario en solución bloqueante durante dos días a cuatro grados centígrados con una rotación suave. Unos días más tarde, retire el anticuerpo secundario utilizando el mismo procedimiento de lavado. Para preparar las correderas de montaje, agregue 2 gotas de 25 microlitros de papel de montaje a un cubreobjetos.

Coloque dos cubreobjetos en el medio de montaje con un espacio en el medio. Deje que los portaobjetos se sequen. Si el ancho del portaobjetos de montaje no se ajusta a la platina del microscopio confocal, use esmalte de uñas para colocar un cubreobjetos de 22 por 22 milímetros en el portaobjetos para que se ajuste correctamente.

Ahora reemplace la solución en la que se encuentran los cerebros con 50 microlitros de medios de montaje. Equilibre el cerebro con el medio de montaje pipeteando con una punta cortada P 200. A continuación, use una punta cortada P 200 para transferir los cerebros a la zanja.

En la corredera de montaje, oriente los cerebros para ver su cara anterior o posterior. A continuación, cúbralos con un cubreobjetos número 1,5 y, desde una esquina, rellene el espacio entre los cubreobjetos con medios de montaje para eliminar todo el aire. Deje que los portaobjetos se sequen y luego séllelos con esmalte de uñas antes de examinarlos.

La alfa-sinucleína humana se expresó en las neuronas DA utilizando el controlador TH GAL cuatro en el ensayo de escalada. Los machos que expresan este transgén exhibieron una disminución acelerada en relación con los controles de la misma edad y para volar como coex expresando el compañero de unión NRF 2D NA. Las hembras de Math S mostraron resultados similares comparando moscas macho de cuatro semanas de edad de diferentes genotipos.

Se utilizaron recuentos de neuronas DA basados en inmunofluorescencia para cuantificar el número de neuronas PPL uno. Se encontró una pérdida pequeña pero significativa de neuronas PPL one en moscas que expresaban alfa-sinucleína. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la neurodegeneración de las neuronas varg en zoa transgénicos mediante ensayos de CLA e inmunofluorescencia de tirosina aasa.

Gracias por mirar.