Name: Método ex vivo de Imágenes de Alta Resolución de Motilidad Cilia en roedores las vías respiratorias epitelio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprende a visualizar y cuantificar la motilidad ciliar y el flujo generado por cilios en tráquea de ratón usando microscopía de alta velocidad. Este método ex vivo permite análisis reproducibles de la frecuencia y forma del latido ciliar.

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El proyecto fue apoyado por el NIH subvención U01HL098180 Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre o de los Institutos Nacionales de la Salud

1. Reactivos de configuración 1.1 disección y la imagen Mediano Medio L-15 de Leibovitz (L15) se complementa con FBS (10%) y penicilina-estreptomicina (100 unidades / ml de penicilina G sódica y 100 mg / ml de sulfato de estreptomicina) se utiliza tanto durante la cosecha y la formación de imágenes de muestras de tráquea. 2. Asamblea Cámara Cultura Walled Shallow La cámara se utiliza para mantener el tejido tráquea se muestra en la Figura 1. El suelo de la cámara es el cristal tocó fondo 35 mm de placa de cultivo. La parte superior y lateral de la cámara se genera mediante la colocación de una pequeña pieza de 0,3 mm de espesor láminas de silicona en el plato de cristal. El borde de la lámina se corta para encajar el plato de fondo redondo y el centro se recorta adicionalmente para formar una cámara central superficial (consulte los pasos 2.1 a 2.3). En la parte superior de este conjunto, un mm ronda cubreobjetos de vidrio 18 se coloca para generar un recinto adecuado para la imagen. <ol><li> Cubra completamente a mm ronda cubreobjetos 18 vidrio con un cuadrado de 0,3 mm de espesor láminas de silicona. </li><li> Con tijeras de disección afilados estándar recorte el exceso de láminas de silicona alrededor del borde de la hoja de la cubierta (que resulta en una capa circular de láminas de silicona). </li><li> Con un escalpelo afilado, recortar y eliminar una plaza central de láminas de silicona (aproximadamente 10 mm cuadrados) desde el centro de la hoja de la cubierta cubierta (formando así la parte superior y los lados de la cámara de imágenes). </li></ol> 3. Tráquea Cosecha y preparación <ol><li> La eutanasia a los ratones de conformidad con cuidado animal institucional local y utilizar comité y / o directrices gubernamentales y quitar la tráquea en un plástico de 35 mm de placa de cultivo estándar con medios suficientes L15 tejido a sumergir (autores han utilizado ratones justo antes del nacimiento en el día de gestación 16,5, a través animales recién nacidos, neonatal y adulto 2). </li><li> Quitar el tejido asociado no tráquea unida al exterior dela tráquea utilizando disección roma. </li><li> Retire la laringe con un corte transversal justo por debajo del cartílago cricoides con tijeras de disección micro (Figura 2, línea 1). </li><li> Quite las ramas bronquiales principales izquierdo y derecho con un corte transversal justo por encima de la carina con tijeras de disección micro (Figura 2A, línea 2). </li><li> Aplique suavemente la tráquea con unas pinzas finas y lave el lumen 2-3 veces con ~ 1 ml de medio que baña L15 con un Pipetman P1000 y P1000 punta para borrar cualquier moco y sangre. </li><li> Cortar un segmento de anillo de 3 a 4 de la tráquea con un corte transversal con tijeras de disección micro (Figura 2B, línea 1). </li><li> Cortar longitudinalmente a través del centro del músculo traqueal de este segmento de tráquea corta con tijeras de disección micro (Figura 2B, línea 2). </li><li> Cortar longitudinalmente a través del centro de los anillos cartilaginosos traqueales utilizando tijeras de disección micro (Figura 2C </strong&gt;, línea), dejando dos secciones de tejido traqueal adecuada para imágenes (una sola sección se muestra en la Figura 2D). </li></ol> 4. Imágenes Cilia <ol><li> Transferencia de segmentos de tejido de tráquea, secundarios lumen hacia abajo, sobre el medio de un mm de fondo de cristal placa de cultivo de 35 con 100-200 l de medio L-15. </li><li> Para cuantificar el flujo generado por los cilios añadir una pequeña cantidad de microesferas fluorescentes de 0,20 micras para el medio L-15 bañar la muestra de tejido tráquea (~ 1 x 10 11 partículas / ml o 20 l / ml de la suspensión de microesferas 2,5% acuosa Fluoresbrite). </li><li> Coloque la cámara de imágenes preparado previamente (Véase el Procedimiento 1-3 más arriba) en la parte superior de la muestra lado de la lámina de silicona tráquea hacia abajo, con la muestra de tráquea situado en el centro de la cámara de pared poco profunda formada por la ventana de corte en la lámina de silicona (Figura 1 ). </li><li> Empuje suavemente el cubreobjetos para asegurar en su lugar y retire cualquier exceso de L-15 medios de comunicación de la usin bordesga P1000 y P1000 punta Pipetman. </li><li> Monte el 35 mm con fondo de cristal placa de cultivo y muestra la tráquea en un microscopio invertido con la óptica 100X objetivos y DIC. </li><li> Utilizando una cámara de alta velocidad y software de adquisición de película recoge las películas de la motilidad ciliar a 200 + fotogramas por segundo a lo largo del epitelio traqueal ciliadas del ovillo borde del músculo traqueal (cuadro, E Figura 2D Esbozado: Ejemplo de una imagen fija del vídeo grabado) (Película complementario 1). </li><li> Utilizando imágenes de epifluorescencia con FITC y una cámara CCD con poca luz (Ver lista de equipo anterior), recoge películas de movimiento de microesferas fluorescentes en toda la superficie del epitelio traqueal ciliadas para permitir la cuantificación posterior de flujo generado cilios (Película complementaria 2). </li></ol> 5. La cuantificación de la motilidad de los cilios <ol><li> Cargar películas con imagen DIC en el paquete de software ImageJ y siguiendo la técnica descrita por Iain Drummond 13 utilice la herramienta de línea para dibujar una línea de trama que cruza el cilios. A &quot;Reslice&quot; de esta línea genera una imagen de tipo quimógrafo donde el movimiento de los cilios a través de la línea genera un patrón de onda. El número de píxeles entre cada pico de onda se les midió (un pixel = un fotograma de la película) de la cual se puede calcular el número de latidos por minuto (es decir Hz). </li><li> Para medir los cilios generado películas de cuentas fluorescentes de carga de flujo en el paquete de software ImageJ, y usar el plugin MTrackJ 14 para realizar un seguimiento de forma manual perlas fluorescentes través de la superficie de la tráquea epitelios y dejar que el software de generar la velocidad del grano y la direccionalidad para cada talón seguimiento. </li></ol> Se debe tener cuidado cuando se utiliza perlas fluorescentes para cuantificar el flujo como la distancia desde el cilios pueden influir fuertemente en la magnitud de flujo medida. El movimiento del talón en Suplementario Película 2 es un buen ejemplo de esto. En este ejemplo perlasel movimiento es rápido en la superficie de los cilios de latir y se reduce significativamente fuera de los granos más lejos en los medios de comunicación de baño. Para controlar esto, los trazados de talón sólo deben recogerse a una distancia fija por encima del epitelio ciliado en todas las muestras para permitir comparaciones correctas a realizar. Por último, para obtener datos representativos sobre el flujo de fluido, los granos deben ser rastreados por el mayor tiempo posible, preferimos utilizar pistas de talón que cubren las células ciliadas + 10 para el cálculo de flujo de fluido.

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<li>Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted+ciliated+epithelium+shows+slower+ciliary+beat+frequency+and+increased+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Respir.+J%22%5BJournal%5D)">Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia.</a> Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).</li>
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<li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+cell+and+particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).</li>
<li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li>
<li>Schwabe, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+ciliary+dyskinesia+associated+with+normal+axoneme+ultrastructure+is+caused+by+DNAH11+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations.</a> Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).</li>
<li>Shah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Bardet-Biedl+syndrome+proteins+alters+the+morphology+and+function+of+motile+cilia+in+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).</li>
<li>Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+effect+on+the+ciliary+beat+frequency+of+human+nasal+and+tracheal+ciliated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell+%2F+under+the+auspices+of+the+European+Cell+Biology+Organization%22%5BJournal%5D)">Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).</li>
</ol>

Los autores tienen nada que revelar.

Medición de la frecuencia de batido ciliar (CBF) es relativamente fácil de usar objetivos de microscopio de alta potencia y rápida adquisición de imágenes de hardware 13,15, y explica por qué las mediciones CBF forman la base de la mayoría de los estudios de investigación de la depuración mucociliar en la salud y la enfermedad. Sin embargo, mientras que la medición CBF es esencial para la comprensión de la depuración mucociliar, la medición de la CBF solo hace caso omiso de la importancia subyacente de tanto ...

Análisis de la función de cilios móviles en la vía aérea epitelios experimentalmente es importante para dilucidar los factores genéticos y ambientales que pueden afectar a la salud y el aclaramiento mucociliar pulmonar 1. El simple protocolo desarrollado para la formación de imágenes con el ratón vías respiratorias epitelios proporciona un método eficiente para interrogar a las vías respiratorias en la motilidad de los cilios modelos mutantes y ratón knockout y requiere solamente habilidades básicas del ratón en la disección del tejido traqueal y la formación de imágenes ex vivo de las vías respiratorias con la motilidad de los cilios videomicroscopy alta resolución. Este protocolo fue creado y perfeccionado durante una pantalla de mutagénesis ratón a gran escala para permitir una rápida evaluación de la función de los cilios móviles (frecuencia de batido ciliar, la forma de batido ciliar, el flujo generado cilios) en los mutantes con cardiopatía congénita asociada a heterotaxy 2-5. Las técnicas actuales utilizadas para estudiar las vías respiratorias cilios motilidad se pueden agrupar en ya sea el tipo ex vivo aguda o lonplazo ger en los enfoques experimentales in vitro. Experimentos agudos incluyen la visualización ex vivo de nasales / vías respiratorias humanas biopsias cepillo 6,7 y el análisis de las secciones transversales de las vías respiratorias simples 8. Los enfoques in vitro utilizan varias técnicas de cultivo celular para generar hojas de epitelio ciliado diferenciadas tales como en cultivos líquidos de interfaz de aire o cultivos en suspensión las vías respiratorias 9-11. Sin embargo, estas técnicas reciliation epitelios de las vías respiratorias requieren una inversión muy significativa en el tiempo y la formación antes de que las células epiteliales ciliadas utilizables se producen para la experimentación (4-6 semanas 9,10). Mientras que el análisis ex vivo aguda de las vías respiratorias epiteliales biopsias cepillo se utilizan comúnmente para los estudios clínicos humanos, este método no se puede utilizar en los estudios del ratón exacerbado debido a la lesión tisular mecánico 12. La técnica descrita en este protocolo para el análisis de los memorandos de entendimientoe las vías respiratorias epitelio traqueal no sólo es sencillo de ejecutar, pero no requiere de habilidades especiales de disección ni cualquier equipo especializado además de los estándar para la formación de imágenes por videomicroscopía. Hay muchas ventajas de este protocolo simple. En primer lugar, como el ratón la cosecha de tejidos tráquea es rápida y fácil de realizar, que permite una evaluación rápida de la función de los cilios las vías respiratorias en un gran número de ratones. Esto puede incluir el análisis aguda de los efectos a corto plazo de diferentes tratamientos en in vitro. En segundo lugar, siendo una técnica ex vivo, el epitelio de las vías respiratorias ciliado permanece unido a él que subyace tejidos de soporte y por lo tanto retener vías de señalización celular asociadas. Por lo tanto, en comparación con las vías respiratorias in vitro reciliated epitelios, esta preparación es una mejor representación de la natural en el entorno de tejido vivo. En tercer lugar, este protocolo permite la adquisición de un número de diferentes parámetros cuantitativos que pueden proporcionar la evaluación objetiva de los cilios móviles función. Por último, en contraste con otros métodos actuales para las vías respiratorias cilios visualización, este protocolo permite la visualización de los cilios en ángulos rectos a la dirección de batido ciliar, permitiendo vista de perfil de los cilios que es óptima para obtener imágenes de alta resolución de batido ciliar y la generación de ondas metachronal . Este protocolo puede ser modificado en un número de maneras de abordar una amplia gama de necesidades experimentales tales como el papel de los agentes farmacológicos, factores genéticos, exposición ambiental, y / o factores mecánicos, tales como la carga de moco en las vías respiratorias y la función de los cilios generación / mantenimiento de los vías respiratorias batido ciliar y la propagación de ondas metachronal.

<table><tbody><tr><td>Leibovitz' s L-15 Medium </td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>Rojo sin fenol </td></tr><tr><td>Suero fetal bovino </td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina </td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2x pinzas finas </td><td>Roboz</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección </td><td>Roboz</td><td>RS-5676</td><td></td></tr><tr><td>Micro tijeras de disección </td><td>Roboz</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí </td><td>Roboz</td><td>RS-9801-15</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipeta </td><td>Gilson, Inc</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P1000 puntas </td><td>Molecular BioProducts</td><td>2079E</td><td></td></tr><tr><td>18 mm cubreobjetos de vidrio redondos </td><td>Fisher Scientific</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo de plástico de 35 mm </td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>Fondo de vidrio Placas de cultivo de 35 mm </td><td>Warner Instruments</td><td>W3 64-0758</td><td></td></tr><tr><td>Lámina de silicona de 0,012" (0,3 mm) de espesor </td><td>AAA Acme Rubber Co</td><td>CASS-.012X36-63908</td><td></td></tr><tr><td>0.20 &mu; m diámetro Fluoresbrite YG Microesferas de carboxilato </td><td>Polysciences</td><td>09834-10</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido, con objetivo de aceite 100x y filtros DIC </td> La marca <td>Lecia</td><td>DMIRE2</td><td>no es crítico. </td></tr><tr><td>Lámpara de mercurio de 100 vatios, filtros epifluorescentes de excitación/emisión FITC</td> La marca <td>Lecia</td><td></td><td>no es crítica.</td></tr><tr><td>Etapa de microscopio Incubadora</td><td>Lecia 11521749</td><td></td><td>No es necesario si se obtienen imágenes de cilios a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Cámara de alta velocidad de campo claro </td><td>Vision Research</td><td>Phantom v4.2</td><td>La marca no es crítica. Debe ser más rápido que 125 fps</td></tr><tr><td>La cámara fluorescente de alta velocidad </td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-12</td><td>marca no es crítica. Debe ser más rápido que 10 fps</td></tr><tr><td>Software de análisis</td><td>de películas Institutos Nacionales de Salud</td><td>ImageJ con el</td><td></td> complemento MtrackJ</tr></tbody></table>

método ex vivo de imágenes de alta resolución de motilidad cilia en roedores las vías respiratorias epitelio

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

Se ha establecido una técnica ex vivo para la imagen del ratón vías respiratorias epitelios para el análisis cuantitativo de la función de los cilios inmóviles importante para conocer a fondo la función mucociliar. Recién cosechada ratón tráquea se corta longitudinalmente a través del músculo traqueal y se monta en una cámara de paredes poco profundas en un plato con fondo de cristal. La muestra tráquea se coloca a lo largo de su eje largo para tomar ventaja del músculo traqueal a rizarse longitudinalmente. Esto permite formación de imágenes de movimiento ciliar en la vista de perfil a lo largo de toda la longitud traqueal. Videos en 200 cuadros / seg se obtienen utilizando microscopía de contraste diferencial de interferencia y una cámara digital de alta velocidad para permitir el análisis cuantitativo de la frecuencia de batido ciliar y la forma de onda ciliar. Con la adición de perlas fluorescentes durante la formación de imágenes, los cilios de flujo de fluido generada también se puede determinar. El tiempo de protocolo se extiende por aproximadamente 30 min, con 5 min para la preparación cámara, 5-10 min para la muestramontaje y 10-15 minutos para videomicroscopy.

Control de los cilios vía aérea debe ser claramente visible y visto de superar en forma coordinada (Película suplementario 1, la reproducción de películas es más lento que el tiempo real de 15%), con un flujo notable en la dirección del batido ciliar (Película Suplementario 2; reproducción de la película es 100% tiempo real). La cuantificación de las películas cilios debe producir resultados similares a la observada en la Figura 3. Colección de películas DIC de alta vel...

Se describe una técnica sencilla y fiable para la visualización y cuantificación de las vías respiratorias motilidad de los cilios y los cilios flujo generado a través del ratón tráquea. Esta técnica puede ser modificada para determinar cómo una amplia gama de factores que influyen en la motilidad de los cilios, incluyendo agentes farmacológicos, factores genéticos, exposición ambiental, y / o factores mecánicos, tales como la carga de moco.

Método ex vivo de Imágenes de Alta Resolución de Motilidad Cilia en roedores las vías respiratorias epitelio

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y cuantificar la motilidad respiratoria de CLIA y el flujo generado por CLIA utilizando tráquea de ratón recién aislada. Esto se logra primero preparando una cámara de imagenización poco profunda. Los siguientes pasos del procedimiento consisten en extraer y montar el tejido traqueal para la imagenización.Luego, se muestra cómo visualizar y registrar la motilidad por motilidad C y el flujo generado por CLIA utilizando un microscopio invertido con videografía de alta velocidad a través de un objetivo 100 XDIC. El paso final consiste en analizar el video cuantificando la frecuencia de latido de CLIA y el flujo generado por CLIA mediante el software Image J. En última instancia, los resultados pueden mostrar cambios en la motilidad respiratoria de CLIA y en el flujo generado por CLIA mediante microscopía de video de alta velocidad.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que permite la obtención de imágenes reproducibles del epitelio traqueal de roedores para evaluaciones cuantitativas consistentes del movimiento ciliar. Esto puede lograrse en un lapso de 20 a 30 minutos con una formación mínima. Este método puede ayudar a responder preguntas clave relacionadas con los mecanismos celulares y moleculares que regulan la eliminación de moco en la vía respiratoria, especialmente cuando se utiliza en combinación con diferentes modelos de ratones modificados genéticamente y ratones mutantes.Comience construyendo la cámara utilizada para sostener las muestras de tráquea como base o piso de la cámara. Utilice una placa de cultivo de 35 milímetros con fondo de vidrio para la parte superior. Utilice una lámina de silicona de 0,3 milímetros de espesor.Coloque la lámina sobre un cubreobjetos circular de vidrio de 18 milímetros y recorte el borde. Luego, con un escalpelo, corte desde el centro del silicona un cuadrado de 10 milímetros. El cubreobjetos de vidrio y el silicona forman la parte superior y los lados de la cámara de cultivo.Se colocarán encima de la muestra que se coloca en la placa de cultivo. Después de sacrificar un ratón de acuerdo con las directrices institucionales, aislar quirúrgicamente la tráquea. Recolectar la tráquea en una placa de cultivo plástica de 35 milímetros con suficiente medio L 15 para sumergirla completamente.Mediante disección romo, elimine todos los tejidos no traqueales alrededor de la tráquea. A continuación, usando tijeras de microdisección, elimine la laringe con un corte transversal justo por debajo de la cartílago cricoides. Ahora elimine las ramas bronquiales primarias izquierda y derecha con un corte transversal justo por encima de la carina usando pinzas finas.Sujete suavemente la tráquea. Luego, utilizando una pipeta de un mililitro, enjuague la luz dos o tres veces con medio L-15 para eliminar cualquier moco y sangre. A continuación, usando tijeras de disección microquirúrgicas, realice un corte transversal para extraer un segmento de tres o cuatro anillos de tráquea.Luego, en el pequeño segmento traqueal, realice un corte longitudinal a través de la mitad del músculo traqueal. Por último, corte longitudinalmente por la mitad de los anillos cartilaginosos traqueales utilizando tijeras de microdisección, dejando dos secciones de tejido traqueal adecuadas para la imagenología. Tras la disección, transfiera los segmentos de tejido traqueal con la luz hacia abajo al centro del recipiente con fondo de vidrio con aproximadamente 100 microlitros de L-15.Para cuantificar el flujo generado por CLIA con 20 microlitros de una suspensión al 2,5 % de microesferas fluorescentes por mililitro de medio L 15. Ahora coloque la cubierta de silicio y vidrio sobre la tráquea y presiónela suavemente para asegurarla en su lugar. Luego, a lo largo de los bordes, retire cualquier medio en exceso con una pipeta de un mililitro.Ahora transfiera la cámara a un microscopio invertido equipado con un objetivo de 100 x y óptica DIC. Utilizando una cámara de alta velocidad y un software de adquisición de videos, recolecte películas de la motilidad de CLIA a 200 o más cuadros por segundo a lo largo del epitelio traqueal ciliado del borde enrollado del músculo traqueal. Mediante imágenes fluorescentes FS e epi y una cámara CCD de poca luz, recolecte películas de la microesfera fluorescente moviéndose a través de la superficie del epitelio traqueal ciliado.Utilizando estas películas, continúe con la cuantificación de las muestras de flujo generadas por CLIA. Las muestras pueden ser observadas durante hasta una hora sin ninguna alteración notable en la función ciliar. Comience calculando los latidos de CLIA por minuto. Cargue las películas obtenidas con microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) en el paquete de software Image J.Siga la técnica descrita por Aian Drummond. Utilice la herramienta de línea para dibujar una línea raster. Cruzando el cilios latiente.Realice una rebanada espacial de esta línea para generar una imagen de tipo gráfico en la que el movimiento del CA a través de la línea produzca un patrón de onda. Ahora cuente el número de píxeles entre cada pico de onda a lo largo de esta línea. A partir de este conteo.Calcule los latidos por minuto sabiendo que cada cuadro de la película está representado por un píxel a lo largo de la línea. A continuación, mida el flujo generado por C Cate. Cargue las películas de microesferas fluorescentes en el paquete de software Image J.Utilice manualmente el complemento MT track J para rastrear las microesferas fluorescentes a lo largo de la superficie del epitelio traqueal. El software calculará la velocidad y la direccionalidad de cada microesfera rastreada. Tenga cuidado en notar que la distancia respecto a los cilios con microesferas puede influir fuertemente en la magnitud del flujo medido.En este ejemplo, el movimiento de las perlas es rápido en la superficie de los cilios aislantes y disminuye para las perlas más alejadas en el medio de baño; para controlar este efecto, los rastreos de las perlas deben recolectarse únicamente a una distancia fija por encima del epitelio ciliado en todas las muestras, para permitir comparaciones correctas. Finalmente, para el flujo de fluido, realice el seguimiento de las perlas durante el mayor tiempo posible. Es preferible utilizar perlas que atraviesen más de 10 células ciliadas para realizar estos cálculos.Utilizando el protocolo descrito, los cilios de las vías respiratorias de control deben ser claramente visibles y observarse de manera coordinada. Asimismo, debería haber un flujo notable en la dirección del latido. Típicamente, la recopilación de películas DIC de alta velocidad permite la cuantificación de la frecuencia del latido C y proporciona buenas imágenes.Para la evaluación cualitativa de la forma del latido de CLIA. El seguimiento de las microesferas fluorescentes proporciona una medición de la velocidad de flujo generada por CLIA. La direccionalidad se calcula dividiendo el desplazamiento total de una microesfera fluorescente entre la longitud del rastro de una microesfera fluorescente.Por lo tanto, una trayectoria recta obtiene una puntuación de uno, mientras que un recorrido sinuoso obtiene un valor mucho más bajo. Al realizar este procedimiento, es importante recordar limpiar adecuadamente el músculo tráqueo de todos los tejidos conectivo y adiposo circundantes antes de cortar.Dado que el rizamiento del músculo traqueal después de que ha sido cortado es esencial para posicionar la CLIA respiratoria para una visualización óptima. Tras este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como estudios farmacológicos, con el fin de responder preguntas adicionales, como cómo o por qué modulan los agentes farmacológicos la actividad C respiratoria?

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Fuente: Al Omran, A. J., et al. Imágenes en vivo de los cilios ependimarios en los ventrículos laterales del cerebro de ratón. J. Vis. Exp. (2015).  Este video muestra una técnica de imagen en vivo utilizando microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) para observar el latido de los cilios ependimarios en secciones sagitales del cerebro de ratón. Los cilios ependimarios impulsan el líquido cefalorraquídeo (LCR), y su actividad se registra en secciones del cerebro mantenidas en...

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Microscopía intravital es una poderosa herramienta que permite obtener imágenes diferentes procesos biológicos en los animales vivos. En este artículo, presentamos un método detallado para obtener imágenes de la dinámica de las estructuras subcelulares, tales como los gránulos de secreción, en las glándulas salivales de ratones vivos.

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El análisis de microscopía de video de alta velocidad es una herramienta relativamente fácil de realizar, rápida, rentable y, en manos experimentadas, una herramienta considerablemente confiable para el diagnóstico de primera línea de la discinesia ciliar primaria, que debe estar disponible en todos los centros involucrados en el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades pulmonares graves.

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