Método ex vivo de Imágenes de Alta Resolución de Motilidad Cilia en roedores las vías respiratorias epitelio
August 8th, 2013
Se describe una técnica sencilla y fiable para la visualización y cuantificación de las vías respiratorias motilidad de los cilios y los cilios flujo generado a través del ratón tráquea. Esta técnica puede ser modificada para determinar cómo una amplia gama de factores que influyen en la motilidad de los cilios, incluyendo agentes farmacológicos, factores genéticos, exposición ambiental, y / o factores mecánicos, tales como la carga de moco.
El objetivo general de este procedimiento es visualizar y cuantificar la motilidad respiratoria de CLIA y el flujo generado por CLIA utilizando tráquea de ratón recién aislada. Esto se logra preparando primero una cámara de imágenes poco profunda. Los siguientes pasos del procedimiento son recolectar y montar el tejido traqueal para la obtención de imágenes.
A continuación, se muestra cómo visualizar y registrar la motilidad C y el flujo generado por CLIA utilizando un microscopio invertido con videografía de alta velocidad a través de un objetivo 100 XDIC. El paso final es analizar el video cuantificando la frecuencia de batido de CLIA y el flujo generado por CLIA utilizando el software Image J. En última instancia, los resultados pueden mostrar cambios en la motilidad respiratoria de CLIA y el flujo generado por CLIA a través de microscopía de video de alta velocidad.
La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que permite obtener imágenes reproducibles del epitelio del roedor para evaluaciones cuantitativas consistentes del movimiento ciliar. Esto se puede lograr en 20 a 30 minutos con un entrenamiento mínimo. Este método puede ayudar a abordar cuestiones clave relacionadas con los mecanismos celulares y moleculares que regulan la eliminación de muci en el eWAY, especialmente cuando se utiliza en combinación con diferentes modelos de ratones mutantes y modificados genéticamente.
Comience construyendo la cámara utilizada para contener las muestras de tráquea como base o piso de la cámara. Use un plato de cultivo de 35 milímetros con fondo de vidrio para la parte superior. Utilice láminas de silicona de 0,3 milímetros de grosor.
Coloque la lámina sobre un cubreobjetos de vidrio redondo de 18 milímetros y recorte el borde. A continuación, con un bisturí del centro de la silicona, corta un cuadrado de 10 milímetros. La cubierta de vidrio y la silicona forman la parte superior y los lados de la cámara de cultivo.
Se colocarán encima de la muestra que se coloca en la placa de cultivo. Después de sacrificar a un ratón de acuerdo con las directrices institucionales, aislar quirúrgicamente la tráquea. Recoja la tráquea en un plato de plástico cultivado de 35 milímetros con suficiente medio L 15 para sumergirla completamente.
Usando una disección roma, retire todo el tejido no traqueal alrededor de la tráquea. A continuación, con unas tijeras de microdisección, extirpe la laringe con el corte transversal justo debajo del cartílago cricoides. Ahora retire las ramas bronquiales primarias izquierda y derecha con un corte transversal justo por encima de la carina con pinzas finas.
Sostenga suavemente la tráquea. A continuación, con una pipeta de un mililitro, enjuague el lumen dos o tres veces con medio L 15 para eliminar la mucosidad y la sangre. A continuación, con unas tijeras de microdisección, haga un corte transversal para eliminar un segmento de tres o cuatro anillos de tráquea.
Luego, en el segmento traqueal pequeño, haga un corte longitudinal a través del medio del músculo de la traquesía. Por último, corte longitudinalmente a través de la mitad de los anillos de cartílago traqueal con tijeras de microdisección, dejando dos secciones de tejido de tráquea adecuadas para la obtención de imágenes. Después de la disección, transfiera los segmentos de tejido de la tráquea con el lado del lumen hacia abajo al centro del plato con fondo de vidrio con aproximadamente 100 microlitros de L 15.
Cuantificar el flujo generado por CLIA a 20 microlitros de una suspensión de 2.5% de microesferas fluorescentes por mililitro de medio L 15. Ahora coloque la cubierta de silicona y vidrio sobre la tráquea y empuje suavemente para asegurarla en su lugar. A continuación, a lo largo de los bordes, elimine el exceso de medios con una pipeta de un molino.
A continuación, transfiera la cámara a un microscopio invertido equipado con una óptica subjetiva y DIC de 100 x. Con una cámara de alta velocidad y un software de adquisición de vídeos, recopile vídeos de la motilidad de CLIA a más de 200 fotogramas por segundo a lo largo de los epitelios epiteliales de la tráquea ciliados del borde enroscado del músculo de las traqueas. Usando imágenes epifluorescentes FS e y una cámara CCD con poca luz, recopile películas de la microesfera fluorescente moviéndose a través de la superficie del epitelio de la tráquea ciliada.
El uso de estas películas procede con la cuantificación del flujo generado por CLIA: Las muestras se pueden visualizar hasta por una hora sin ninguna alteración notable en la función Celia Beat. Comience calculando las pulsaciones CLIA por minuto. Cargue las películas con imágenes DIC en el paquete de software Image J.
Sigue la técnica descrita por Aian Drummond. Utilice la herramienta de línea para dibujar una línea ráster. Cruzando la clia.
Haga un corte de resolución de esta línea para generar una imagen de tipo gráfico en la que el movimiento de CA a través de la línea genera un patrón de onda. Ahora cuenta el número de píxeles entre cada pico de onda a lo largo de esta línea. De este conteo.
Calcule las pulsaciones por minuto sabiendo que cada fotograma de la película está representado por un píxel a lo largo de la línea. A continuación, mida el flujo generado por C Cate. Cargue las películas de perlas fluorescentes en el paquete de software Image J.
Usando el plugin MT track J, rastree manualmente las perlas fluorescentes a través de la superficie del epitelio de la tráquea. El software calculará la velocidad y la direccionalidad de cada cuenta rastreada. Tenga en cuenta que la distancia desde los cilios de reborde puede influir fuertemente en la magnitud del flujo medido.
En este ejemplo, el movimiento de las perlas es rápido en la superficie de los cilios de las cuentas y cae hacia las perlas más alejadas en el medio de baño, para controlar esto, los trazos de las perlas solo deben recogerse a una distancia fija por encima del epitelio ciliado en todas las muestras para permitir que se realicen comparaciones correctas. Finalmente, para el flujo de fluido, rastree las cuentas el mayor tiempo posible. Es preferible utilizar cuentas que pasen por más de 10 celdas ciliadas para hacer estos cálculos.
Utilizando el protocolo descrito, los cilios de control de las vías respiratorias deben ser claramente visibles y visibles de manera coordinada. Del mismo modo, debe haber un flujo notable en la dirección del ritmo. Por lo general, la recopilación de películas DIC de alta velocidad permite la cuantificación de la frecuencia de batido C y proporciona buenas imágenes.
Para la evaluación cualitativa de la forma del ritmo CLIA. El seguimiento de las perlas fluorescentes proporciona una medición de la velocidad de flujo generada por CLIA. La direccionalidad se calcula dividiendo el desplazamiento total de una cuenta fluorescente por la longitud de la traza de una cuenta fluorescente.
Por lo tanto, una línea de trayectoria recta marca uno. Mientras que un camino serpenteante puntúa un valor mucho más bajo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar limpiar adecuadamente el músculo de las traqueosas de todo el tejido conectivo y adiposo circundante antes de cortar.
Como el enroscamiento del músculo de las traqueas después de haber sido cortado es esencial para posicionar el CLIA respiratorio para una visualización ideal. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los estudios farmacológicos, para responder a preguntas adicionales como ¿cómo o por qué los agentes farmacológicos modulan la actividad del C respiratorio?
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Visión general
Este artículo describe una técnica confiable para visualizar y cuantificar la motilidad de los cilios de las vías respiratorias y el flujo generado por los cilios utilizando la tráquea de ratón. El método permite evaluar varios factores que influyen en la motilidad de los cilios, incluyendo agentes farmacológicos y exposiciones ambientales.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología respiratoria
- Motilidad celular
Antecedentes
- Los cilios desempeñan un papel crucial en la función respiratoria.
- Comprender la motilidad de los cilios puede proporcionar información sobre la salud respiratoria.
- Los factores que influyen en la función de los cilios incluyen elementos genéticos y ambientales.
- La microscopía de video de alta velocidad es una herramienta valiosa para analizar el comportamiento de los cilios.
Propósito del estudio
- Visualizar la motilidad de los cilios respiratorios utilizando la tráquea de ratón.
- Cuantificar el flujo generado por los cilios.
- Evaluar el impacto de varios factores en la motilidad de los cilios.
Métodos utilizados
- Preparación de una cámara de imagen poco profunda.
- Recolección y montaje de tejido traqueal para la imagen.
- Visualización y grabación de la motilidad de los cilios utilizando un microscopio invertido.
- Análisis de datos de video para cuantificar la frecuencia de latido de los cilios y el flujo utilizando el software Image J.
Resultados principales
- Visualización exitosa de la motilidad de los cilios respiratorios.
- Cuantificación del flujo generado por los cilios.
- Identificación de cambios en la motilidad de los cilios bajo diversas condiciones.
- Demostración de la efectividad de la microscopía de video de alta velocidad.
Conclusiones
- La técnica proporciona un método confiable para estudiar la motilidad de los cilios.
- Los resultados pueden informar sobre los efectos de diferentes factores en la salud respiratoria.
- Este método puede adaptarse para futuras investigaciones en estudios relacionados con los cilios.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This ex vivo method enables high-resolution, quantitative assessment of cilia motility and fluid flow in rodent airway epithelia, providing a reproducible platform for evaluating mucociliary clearance mechanisms. The technique supports target validation in respiratory biology by linking genetic or pharmacological perturbations to functional ciliary outputs, facilitating mechanistic de-risking in early discovery. Its compatibility with genetically engineered models and pharmacological studies enhances translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying changes in cilia beat frequency and waveform in response to genetic or pharmacological modulation.
- Operational Value: Provides a standardized, rapid (<30 min) assay for consistent quantitative assessment of ciliary function across experimental conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by delivering functional readouts that correlate with mucociliary clearance efficacy, reducing mechanistic ambiguity in target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable measurements (beat frequency, flow velocity, directionality) enabling reliable compound screening in airway epithelial models.
- Operational Value: Utilizes accessible instrumentation (inverted microscope, high-speed camera, ImageJ) and standardized sample preparation for assay scalability and cross-lab reproducibility.
- Strategic Value: Facilitates assay standardization and replication requirements essential for cross-functional collaboration in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by modeling mucociliary clearance in rodent trachea, enabling translational biomarker alignment with human respiratory pathophysiology.
- Operational Value: Supports continuity from discovery through preclinical validation by allowing longitudinal assessment of cilia function under varying conditions.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying functional outcomes of interventions on cilia-driven fluid flow, a key determinant of respiratory health.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical assessment, offering a functional readout that bridges molecular mechanism and physiological outcome in respiratory research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling visualization and quantification of cilia motility as a functional output of epithelial health.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs (beat frequency, flow metrics) that allow reliable comparison of compound or genetic effects on ciliary function.
- Analytics: Provides measurable, trackable parameters (beat frequency, bead velocity, directionality) that enable statistical comparison and data-driven decision-making.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling a core physiological process (mucociliary clearance) relevant to respiratory disease progression and therapeutic response.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for evaluating airway epithelial function across multiple projects, reducing redundant assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through direct, quantitative measurement of cilia-driven functional outputs.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via defined chamber preparation, mounting, and imaging protocols suitable for multi-user environments.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid, low-training-required assessment of cilia function, accelerating discovery timelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by linking target modulation to functional mucociliary clearance outcomes, informing advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microtissue dissection, microscopy, and image analysis using tools like ImageJ and MT Track J plugin.
- Dependent on high-speed video microscopy (200+ fps), DIC optics, and fluorescent bead-based flow quantification infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, bead concentration, and imaging depth to ensure comparability across studies.
- Adaptation considerations include tissue integrity, cilia viability over imaging duration (up to 1 hour), and controlling for bead-to-cilia distance in flow measurements.
- Practical limitations include dependency on fresh tissue isolation and potential variability in tracheal preparation affecting curl and imaging consistency.
