A Novel Ex vivo Método de la cultura para el corazón de embriones de ratón

El objetivo general de este procedimiento es extirpar el corazón embrionario para su cultivo ex vivo. Esto se logra recuperando primero el cuerno uterino de una rata hembra embarazada. A continuación, se extrae un embrión y se prepara para la disección.

A continuación, se abre la pared torácica embrionaria para visualizar el corazón. Finalmente, se extirpa el corazón y se coloca en un pocillo de cultivo que contiene matrigel diluido. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren un corazón vivo y saludable a través de la observación bajo un microscopio de campo brillante.

La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos, como los cultivos oscilantes, es que el corazón se puede tratar con agentes locales, como una proteína conjugada con perla, o con agentes globales, como la adición de una pequeña molécula al matrigel. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia de las enfermedades cardiovasculares, ya que permite examinar los eventos dentro de segmentos especializados del corazón en el contexto de todo el órgano intacto. Después de sacrificar a una rata embarazada cronometrada en el día embrionario deseado, utilizando una técnica aprobada por su instituto, rocíe generosamente a la hembra con etanol al 70% antes de abrir la cavidad abdominal y recuperar y extirpar el cuerno uterino.

Coloque el cuerno uterino en una placa de Petri que contenga un XPBS frío y enjuague. Coloque el plato en hielo hasta que esté listo para diseccionar. A continuación, corte el cuerno uterino a través de la línea media para exponer los sacos embrionarios adjuntos.

Corta un saco embrionario y coloca un embrión en una segunda placa de Petri con PBS frío. Coloque el plato con el cuerno uterino sobre hielo. Después de decapitar el embrión, coloque el embrión boca arriba y córtelo.

Abra la pared torácica para visualizar el corazón y los pulmones. Dependiendo de la etapa, la pared torácica puede ser transparente. Si se va a realizar el genotipado, guarde la cola del embrión.

Con fórceps, levante cuidadosamente el corazón y corte los vasos que se encuentran debajo. Luego corta por encima de los grandes vasos para liberar el corazón. Si es necesario, retire los tejidos extraños.

Coloque el corazón en un pozo de un plato de 24 pocillos lleno de PBS frío y sentado sobre hielo. Repita la disección para aislar todos los corazones embrionarios. En una campana de flujo laminar, combine el gel de matri frío y el medio de cultivo deseado en una proporción de uno a uno mientras mantiene el gel de matri diluido en hielo.

Pipetear de 500 a 1000 microlitros de la solución en los pocillos de un cultivo de 24 pocillos. Póngalo en hielo. Escoja y coloque cuidadosamente los corazones extirpados en los pocillos individuales de la placa de cultivo que contiene matrigel.

Si la orientación de un corazón incrustado es crucial, use etanol al 70% para rociar generosamente un microscopio invertido y el espacio circundante. Luego, después de trabajar en la campana para colocar el corazón en el pozo de la estera, gel con hielo. Coloque la placa en una platina de microscopio y oriente rápidamente el corazón a medida que el gel mat comienza a solidificarse.

Coloque la placa de cultivo en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados y deje que el gel de matri se solidifique durante aproximadamente 30 minutos. Agregue un mililitro de cultivo precalentado, medio a cada pocillo que contenga un corazón. Los corazones pueden permanecer en cultivo durante al menos cuatro días.

Si lo desea, agregue un troquel fluorescente de célula viva, como cyto 16. Para visualizar el corazón en vivo, la fotografía se limitará al lado del corazón que sea visible en función de la posición en la que se incrustó. Si se van a realizar imágenes o secciones de montaje completo, retire el medio de cultivo.

Reemplácelo con formaldehído frío al 4% y coloque el plato sobre hielo durante 30 minutos. Después de que el matrigel se disuelva, reemplace el fijador y el matrigel con formaldehído fresco y fije los corazones durante la noche a cuatro grados centígrados. Lave los corazones con PBS o Triss y guárdelos a cuatro grados centígrados hasta nuevos análisis.

Cuando se cultiva ex vivo durante 24 horas, la vasculatura coronaria parece similar a un corazón extirpado de un embrión de edad comparable que se mantuvo en el útero, como se muestra aquí. El análisis hemat, toin y eoin de corazones extirpados en E 16.5 y cultivados ex vivo durante cuatro días demuestra que la morfología general, incluidas las paredes de las grandes arterias y el miocardio septal ventricular e interventricular del corazón, permanece intacta a pesar de la falta de circulación. La osteo coronaria es aparente como lo indica la punta de flecha.

Sin embargo, la fragmentación del ADN indicada con flechas y observada tanto con h como con d y DAPI es evidente en el miocardio compacto y alrededor de los grandes vasos. Además, el miocardio es menos denso en comparación con un corazón de un embrión E 18,5 que se desarrolló en el útero a pesar de que el corazón cultivado ex vivo todavía latía. Por lo tanto, hay limitaciones en cuanto a la cantidad de tiempo o la etapa en la que estos corazones pueden ser mantenidos.

Esta técnica de cultivo también se puede utilizar para marcar corazones con fluorescencia mientras están en cultivo después de la incubación con un colorante fluorescente específico endotelial, los corazones se cultivan durante 48 horas. En este caso, la visualización está limitada en función de la orientación del corazón y la opacidad del tejido. Las secciones histológicas posteriores a través del miocardio ventricular confirman que el cito-16 puede penetrar en las capas celulares externas para marcar los vasos subepicárdicos dentro de los ventrículos y colocalizarse con la selectina, como se demuestra aquí. Después de un cultivo ex vivo durante 30 horas, un corazón extirpado de un embrión E 14.5 muestra una contractilidad y un ritmo consistentes entre las aurículas y los ventrículos.

Al realizar esta técnica, es importante ser suave y cuidadoso al extirpar el corazón. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extirpar y cultivar un corazón de ratón embrionario.