Análisis Cuantitativo multiespectrales después de un trasplante de tejido fluorescente para la visualización de los Orígenes celulares, tipos y Interacciones

El objetivo del siguiente procedimiento es utilizar la interrogación multiespectral de composiciones celulares multiplexadas o de sistemas simulados para determinar las contribuciones de diversas poblaciones residentes en la médula ósea al desarrollo del estroma tumoral. Esto se logra primero trasplantando en un ratón receptor transgénico marcado con GFP células madre de médula ósea que expresan RFP. En el segundo paso, se inyectan en el mismo receptor las células tumorales de interés y, tras el injerto, se reseca el tumor, se incluye en parafina y se etiqueta con anticuerpos inmunofluorescentes.

A continuación, se crea una biblioteca espectral con todas las longitudes de onda utilizadas para adquirir imágenes de las secciones tumorales una vez que la biblioteca espectral está completa. En el paso final, se obtienen imágenes de los portaobjetos y se realiza un análisis de datos para permitir la identificación y asociación de los patrones de tinción de los marcadores celulares de interés. En última instancia, pueden identificarse entidades celulares o fenotipos novedosos basándose en la marcación múltiple de marcadores extracelulares y celulares para comprender mejor la composición de tejidos complejos, como el microambiente tumoral.

La principal ventaja de esta técnica frente a las técnicas estándar de inmunofluorescencia es que el análisis multispectral permite multiplexar siete o más fluoróforos en el mismo portaobjetos, lo que permite una interrogación mucho más precisa y detallada de la composición celular del microambiente tumoral o de un tejido en regeneración. Aunque este método puede proporcionar información sobre el origen y la composición del microambiente tumoral, también puede aplicarse a otros sistemas, como la medicina regenerativa, la biología del desarrollo y la biología inmunitaria. Demostrando este procedimiento junto con el Dr. Spa está Chris Booth, un ayudante de investigación en mi laboratorio. Debido a las restricciones de IU Cook en esta institución, discutiremos pero no mostraremos manipulaciones directas en ratones.

Estos procedimientos de médula ósea y nuestras técnicas de injerto de tumores se describen en nuestros trabajos previos, como células madre de niños y otros. 2009 Para comenzar, después de aislar las células de la médula ósea de las extremidades traseras contralaterales, resuspenda las células a 2 millones de células por 100 microlitros de PBS por ratón. Utilice una lámpara de calor para dilatar los vasos de un ratón receptor irradiado GFP y coloque el ratón en un dispositivo de sujeción para inyección en la vena de la cola.

Utilizando una aguja de calibre 29 con el bisel hacia arriba, inyecte sistémicamente las suspensiones celulares en la vena de la cola o en la vena retroorbital. Use gasa estéril para aplicar una ligera presión sobre la cola tras la inyección. Inyecte a un ratón 100 microlitros de PBS únicamente como control de engraftamiento el día de la inyección.

Re suspender las células tumorales de interés en PBS a 1 millón de células por 100 microlitros. Después de esterilizar el abdomen con etanol al 70 %. Sujete al ratón con una mano por la nuca y la cola, y luego, con la otra mano, sostenga la aguja con el bisel hacia arriba e inyecte las células tumorales en la cavidad interperitoneal del ratón receptor.

Después de 15 a 30 días, sacrificar a los ratones y extirpar el tumor de su abdomen. Luego, fijar los tumores en formalina al 10% durante 24 horas. A continuación, seccionar el tejido fijado en cortes de cinco a 10 micrómetros para procedimientos posteriores de tinción.

Después de fijar las secciones de tejido en parafina, incubar las muestras durante una hora a 56 grados Celsius. Luego, lavar las laminillas según la siguiente secuencia. Después del último lavado con etanol, enjuagar las laminillas con agua durante dos minutos. Sumergir y sacar lentamente la rejilla de tinción dentro y fuera del agua 10 veces.

A continuación, coloque el tampón de citrato sódico en el microondas para calentarlo. Después de hervir las muestras durante 20 minutos en tampón de citrato sódico, deje que se enfríen en el tampón durante 30 minutos. Luego lave con agua ionizada durante otros cinco minutos.

Luego, golpee suavemente la lámina para permitir que las gotas grandes de agua se deslicen, teniendo cuidado de no secar la sección de tejido. Utilice un bolígrafo con barrera hidrofóbica para delimitar las secciones alrededor de las secciones tumorales y, a continuación, coloque inmediatamente tampón de bloqueo sobre la muestra para evitar que la sección de tejido se seque. Después de una hora, incube las láminas con el anticuerpo primario de interés en una caja de cámara húmeda sobre un agitador rotatorio lento a cuatro grados durante la noche.

A la mañana siguiente, lave los portaobjetos dos veces en PBST durante 10 minutos cada vez con agitación suave mientras se lavan las secciones. Diluya los anticuerpos secundarios en una proporción de uno a 1000 de anticuerpo respecto al tampón de bloqueo. A continuación, incube las secciones en los anticuerpos secundarios apropiados en la caja de cámara húmeda cubierta con papel de aluminio sobre un agitador rotatorio lento a temperatura ambiente durante dos horas.

Lave las laminillas dos veces en PBST durante cinco minutos con agitación suave y protéjalas de la luz. Luego, tiña la laminilla dappy única y las laminillas de análisis con DPI durante un minuto, manteniendo las laminillas cubiertas durante la incubación. Coloque una cubreobjetos sobre cada muestra y selle los bordes de cada cubreobjetos con endurecedor de uñas.

Ahora, para realizar la imagen multispectral, utilice un objetivo de inmersión en aceite para obtener una imagen inicial de la portaobjetos de análisis y determinar los tiempos de exposición adecuados para cada uno de los rangos espectrales en la biblioteca espectral. Por ejemplo, esta tabla describe los protocolos sugeridos para la biblioteca espectral según el número de fluoróforos utilizados en el experimento. A continuación, obtenga una imagen del portaobjetos sin tinción para utilizarla como fondo espectral en la biblioteca espectral de este experimento.

Seguiente imagen, la preparación sin teñir para obtener la imagen de fondo para la biblioteca espectral. Ahora, capture imágenes de cada preparación control individual teñida con cuatro marcadores, guardando las imágenes con el nombre del anticuerpo secundario utilizado para cada preparación. Una vez completada la biblioteca espectral, recolecte imágenes de las regiones de interés en la preparación de análisis para analizar las imágenes de los tejidos tumorales.

Primero, importe una selección representativa de las imágenes de matices adquiridas utilizando el software inform. Luego, abra la biblioteca espectral segura según las indicaciones del programa. A continuación, identifique las regiones de tejido de interés que se analizarán.

Identifique células individuales en función de la tinción con DAPI. El citoplasma se identificará automáticamente en función de la forma del núcleo. Ahora seleccione la lectura de intensidad fluorescente deseada para cada parámetro fluorescente y luego combine las imágenes adquiridas, permitiendo que el software procese los datos utilizando el algoritmo propuesto.

Una vez finalizado el procesamiento de la imagen, combine los archivos resultantes. A continuación, utilizando esta técnica de imagen multiespectral para analizar y graficar tumores en este modelo de ratón transgénico con trasplante de médula ósea, se identificaron mediante citometría de flujo componentes tumorales estromales de origen medular tres semanas después del trasplante. Luego, seis semanas después de la inyección inicial, se analizaron secciones de los tumores ováricos inyectados sin etiquetar tras crear una biblioteca espectral con portaobjetos de control de un solo color; se analizaron imágenes de la sección del tumor ovárico teñida con GFP DPI y otros dos marcadores.

Es posible añadir más marcadores. Por ejemplo, aquí se muestran, mediante el software indicado, la biblioteca espectral y la imagen correspondiente de una sección de tumor con seis marcadores más una tinción nuclear. Las regiones de tejido de interés dentro de la sección de tumor son clasificables, como se muestra en las imágenes representativas que se presentan aquí.

Por ejemplo, esta imagen demuestra la clasificación de segmentos de tejido seguida por la segmentación de las células. Basado en la resolución del tinción nuclear (dpi). La cuantificación de las marcas fluorescentes puede entonces medirse en el núcleo y el citoplasma de cada célula y exportarse para análisis posteriores.

El algoritmo de segmentación de tejidos es capaz de identificar aún más subtipos de tejidos basándose en la arquitectura tisular y no únicamente en la identificación del fluorocromo, proporcionando una herramienta analítica más robusta para clasificar la tinción en regiones tisulares distintas. En esta imagen, el ordenador fue entrenado para identificar cinco subregiones basándose en los patrones arquitectónicos dentro del tejido. El fondo se define por el espacio en blanco.

El tumor hemolítico se define por la abundancia de glóbulos rojos dentro del tejido. El tumor se define por células densamente pobladas. La grasa se define por grandes compartimentos celulares vacíos y simétricos, y los músculos por un patrón estriado.

Mediante este método, se puede analizar una población de células doble positiva basándose en un umbral determinado de intensidad fluorescente. Por ejemplo, para células positivas para GFP y actina de músculo liso alfa positivas, como se muestra aquí para detección espectral adicional más allá de cuatro colores, consulte los documentos vinculados de consejos y trucos para la multiplexación de cinco o más sondas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la calidad de las imágenes depende en gran medida de los controles adecuados de un solo color utilizados.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la hibridación fluorescente in situ para responder preguntas adicionales, tales como los compartimentos celulares y el microambiente tisular del tumor. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de nuestra técnica de simulación, la interrogación multiespectral de componentes multicelulares y, al completar este procedimiento, debería tener un conocimiento detallado de cómo identificar múltiples dianas celulares en un solo portaobjetos. Cómo cuantificar esas dianas celulares y tener una buena comprensión de la evolución del estroma tumoral o del tejido regenerativo, o de su tejido de interés.