Análisis Cuantitativo multiespectrales después de un trasplante de tejido fluorescente para la visualización de los Orígenes celulares, tipos y Interacciones

El objetivo del siguiente procedimiento es utilizar la interrogación multiespectral de composiciones celulares multiplex o imitar para determinar las contribuciones de varias poblaciones residentes de médula ósea al desarrollo del estroma tumoral. Esto se logra trasplantando primero un ratón receptor transgénico marcado con GFP con RFP que expresa células madre de médula ósea. En el segundo paso, las células tumorales de interés se inyectan en el mismo receptor y, después del injerto, se secciona el tumor extirpado, se incrusta en parafina y se marca con anticuerpos inmunofluorescentes.

A continuación, se crea una biblioteca espectral de todas las longitudes de onda utilizadas para adquirir imágenes de las secciones tumorales una vez que se completa la biblioteca espectral. En el paso final se obtienen imágenes de los portaobjetos, se realiza un análisis de datos que permite la identificación y asociación de los patrones de tinción de los marcadores celulares de interés. En última instancia, se pueden identificar nuevas entidades o fenotipos celulares a partir del marcaje múltiple de marcadores extracelulares y celulares para comprender mejor la composición de tejidos complejos, como el microambiente tumoral.

La principal ventaja de esta técnica sobre las técnicas estándar de inmunofluorescencia es que el análisis multiespectral permite multiplexar siete o más fluoro cuatro en el mismo portaobjetos, lo que permite una interrogación mucho más precisa y detallada de la composición celular del microambiente tumoral o de un tejido regenerativo. Aunque este método puede proporcionar información sobre el origen y la composición del microambiente tumoral, se puede aplicar a otros sistemas como la medicina regenerativa, la biología del desarrollo y la biología inmunitaria. Demostrando este procedimiento junto con el Dr. Spa está Chris Booth, un asistente de investigación en mi laboratorio. Debido a la restricción de IU Cook en esta institución, discutiremos pero no mostraremos ninguna manipulación directa de ratones en ratones.

Estos procedimientos de médula ósea y nuestras técnicas de injerto tumoral se pueden encontrar en nuestro trabajo anterior, como las células madre de kid y otras. 2009 Para comenzar Después de aislar las células de la médula ósea de las extremidades traseras en espejo, Resus suspende las células a 2 millones de células por cada 100 microlitros de PBS por ratón. Utilice una lámpara de calor para dilatar los vasos de un ratón GFP receptor irradiado y coloque al ratón en una restricción de inyección de vena de cola.

Usando una aguja de calibre 29, con el lado biselado hacia arriba, inyecte sistémicamente las suspensiones celulares en la cola o en la vena retroorbital. Use una gasa estéril para aplicar una ligera presión en la cola después de la inyección. Inyecte un ratón con 100 microlitros de PBS solo como control de injerto el día de la inyección.

Re suspender las células tumorales de interés en PBS a 1 millón de células por cada 100 microlitros. Después de esterilizar el abdomen con etanol al 70%. Use una mano para sujetar al ratón por el pescuezo y la cola, y luego, con la otra mano, sostenga el lado bisel de la aguja hacia arriba e inyecte las células tumorales en la cavidad interperitoneal del ratón receptor.

Después de 15 a 30 días, se practica la eutanasia a los ratones y se extirpa el tumor del abdomen. A continuación, fije los tumores en formina al 10% durante 24 horas. A continuación, seccione el tejido fijado en rodajas de cinco a 10 micrómetros para los procedimientos de tinción posteriores.

Después de fijar las secciones de tejido en parafina, hornee las muestras durante una hora a 56 grados centígrados. Luego lave los portaobjetos de acuerdo con la siguiente secuencia Después del último lavado con etanol, enjuague los portaobjetos con agua durante dos minutos. Sumergir lentamente y subir la rejilla de tinción dentro y fuera del agua 10 veces.

A continuación, coloque el tampón de citrato de sodio en el microondas para calentar. Después de hervir los portaobjetos durante 20 minutos en tampón de citrato de sodio, deje que las muestras se enfríen en el tampón durante 30 minutos. Luego lavar con agua ionizada durante otros cinco minutos.

A continuación, golpee el portaobjetos para dejar que se deslicen las gotas grandes de agua, tenga cuidado de no secar la sección de tejido. Use una pluma de barrera hidrofóbica para marcar las secciones alrededor de las secciones del tumor y luego coloque inmediatamente un tampón de bloqueo en la muestra para evitar que la sección de tejido se seque. Después de una hora, incube los portaobjetos con el anticuerpo primario de interés en una caja de cámara de humedad en un agitador de rotación lenta a cuatro grados durante la noche.

A la mañana siguiente, lave los portaobjetos dos veces en PBST durante 10 minutos cada vez agitando suavemente mientras se lavan las secciones. Diluir los anticuerpos secundarios en una proporción de uno a 1000 anticuerpo por tampón de bloqueo. A continuación, incubar las secciones en los anticuerpos secundarios apropiados en la caja de la cámara de humedad cubierta con papel de aluminio en un agitador de rotación lenta a temperatura ambiente después de dos horas.

Lave los portaobjetos dos veces en PBST durante cinco minutos agitándolos suavemente y protéjalos de la luz. A continuación, tiñe el portaobjetos y los portaobjetos de análisis con DPI durante un minuto, manteniendo los portaobjetos cubiertos durante la incubación. Colocando un cubreobjetos sobre cada muestra, selle los bordes de cada cubreobjetos con endurecedor de uñas.

Ahora, para realizar las imágenes multiespectrales, use un objetivo de aceite para tomar una imagen inicial del portaobjetos de análisis para obtener los tiempos de exposición adecuados para cada uno de los rangos espectrales en la biblioteca espectral. Por ejemplo, este esquema de tabla sugiere protocolos de bibliotecas espectrales basados en el número de pisos cuatro utilizados en el experimento. A continuación, imagine la diapositiva sin manchar de la diapositiva de fondo en la biblioteca espectral de este experimento.

Siguiente imagen, la diapositiva sin manchar para lograr la imagen de fondo para la biblioteca espectral. Ahora tome una imagen de cada portaobjetos teñido de un solo piso de control, guardando las imágenes bajo el nombre del anticuerpo secundario utilizado para cada portaobjetos. Una vez completada la biblioteca Sospechoso, recopile imágenes de las regiones de interés en la diapositiva de análisis para analizar imágenes de los tejidos tumorales.

En primer lugar, importe un surtido representativo de las imágenes de matices adquiridas utilizando el software de información. A continuación, abra la biblioteca espectral segura según las indicaciones del programa. A continuación, identifique las regiones tisulares de interés que se van a analizar.

Identifique las células individuales en función de la tinción DAPI. El citoplasma se identificará automáticamente en función de la forma del núcleo. Ahora elija la lectura de intensidad fluorescente de su elección para cada parámetro fluorescente y luego haga coincidir las imágenes adquiridas, dejando que el software procese los datos utilizando el algoritmo propuesto.

Una vez finalizado el procesamiento de la imagen, combine los archivos resultantes. A continuación, utilizando esta técnica de imagen multiespectral para analizar y graficar los tumores en este modelo de ratón de trasplante de médula ósea transgénico, se discernieron los componentes tumorales del estroma que son de origen de médula ósea mediante citometría de flujo tres semanas después del trasplante de médula ósea. Luego, seis semanas después de la inyección inicial, se analizaron las secciones de los tumores de ovario inyectados sin marcar, después de crear una biblioteca espectral con portaobjetos de control de un solo color, se analizaron imágenes de la sección del tumor de ovario teñida con GFP DPI y otros dos marcadores.

Es posible añadir más marcadores. Por ejemplo, aquí, la biblioteca espectral y la imagen adjunta de una sección tumoral con seis marcadores más una tinción nuclear se muestran utilizando el software informado. Las regiones tisulares de interés dentro de la sección tumoral se pueden clasificar como se muestra en las imágenes representativas que se muestran aquí.

Por ejemplo, esta imagen muestra la clasificación de los segmentos de tejido seguida de la segmentación de las células. Basado en tinción nuclear dpi. A continuación, la cuantificación de las etiquetas fluorescentes puede medirse en el núcleo y el citoplasma de cada célula y exportarse para su posterior análisis.

El algoritmo de segmentación de tejidos es capaz de identificar aún más los subtipos de tejidos en función de la arquitectura del tejido y no únicamente de la identificación del fluorocromo, lo que proporciona una herramienta analítica más robusta para clasificar la tinción en distintas regiones de tejido. En esta imagen, la computadora fue entrenada para identificar cinco subregiones en función de los patrones arquitectónicos dentro del tejido. El fondo está definido por un espacio en blanco.

El tumor hemolítico se define por la abundancia de glóbulos rojos dentro del tejido. El tumor se define por las células densamente pobladas. La grasa está definida por los grandes compartimentos celulares vacíos simétricos y los músculos definidos por un patrón estriado.

Con este método, se puede analizar una población de células doble positivas en función de un umbral de intensidad fluorescente determinado. Por ejemplo, para las células GFP positivas y las células alfa lisas de actina positivas, como se muestra aquí para una detección espectral adicional más allá de cuatro colores, consulte los documentos de consejos y trucos vinculados para multiplexar cinco o más sondas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la calidad de las imágenes depende en gran medida de las diapositivas de control de color únicas adecuadas utilizadas.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la hibridación fluorescente in situ, para responder a preguntas adicionales, como los compartimentos celulares y el tejido del microambiente tumoral. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de nuestra técnica de mímica, la interrogación multiespectral de componentes multicelulares, y al completar esto, debe tener una comprensión profunda de cómo identificar múltiples objetivos celulares en una diapositiva. Cómo contar esos objetivos celulares de Unix y tener una buena comprensión de la evolución del estroma tumoral o del tejido regenerativo, o del tejido de interés.