Name: Análisis de la proteína viral dirigida Nanopartículas Entregado a tumores HER2 + (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Aprende a analizar la entrega sistémica de nanopartículas HerDox dirigidas a tumores HER2+ mediante imagen óptica multimodal. Este método permite evaluar la penetración celular y cuantificar la acumulación tumoral in vivo.

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Este trabajo fue financiado por donaciones a LKM-K de los Institutos Nacionales de Salud / Instituto Nacional del Cáncer (R01CA129822 y R01CA140995). Dr. Medina-Kauwe gracias C. Rey, M. M-Kauwe y D. Revetto de apoyo.

1. Entrega Sistémica En vivo <ol><li> Mezclar suficiente Herdox con solución salina estéril para equiparar 0,2 ml de una mg / kg de dosis de Herdox por inyección de 0.004 para un 6-8 semanas ratón cojinete tumores de xenoinjertos subcutáneos de flanco bilaterales nu / nu viejos. </li><li> Dibujar suavemente la mezcla Herdox en una jeringa de insulina 3/10 cc con una aguja 29G, evitando las burbujas. </li><li> La anestesia se indujo mediante una breve exposición isoflurano en una cámara de inducción equipado con un sistema de barrido de gas (velocidades de flujo de oxígeno: 0,5-1 L / min, la concentración de isoflurano: 3-4% (o inferior). </li><li> Inyectar la mezcla entera en la vena de la cola de un ratón anestesiado (0,2 ml por inyección). Inyección IV también se puede realizar en un restringido, ratón sin anestesiar. </li><li> Repetir las inyecciones en el mismo ratón durante seis días más secuenciales, una vez por día. </li></ol> 2. Fluorescencia de imágenes en vivo La acumulación de Herdox fluorescencia en los tumores puedeser detectable por el último día de la inyección (Día 7) utilizando un generador de imágenes multimodo. Los siguientes procedimientos implican el uso de un sistema de macro-iluminación y detección personalizada (Figura 1) 8. <ol><li> Encienda el Multimodo En vivo Imager óptico. </li><li> Seleccione un filtro de paso de banda de emisión (590 nm ± 30 nm) adecuado para la detección de fluorescencia de la doxorubicina. </li><li> Encienda el láser de Argón Kriptón y coloque un filtro de paso de banda de excitación (488 nm ± 10 nm) en el camino óptico del láser. </li><li> Encienda el sistema de anestesia y luego se coloca un ratón en la cámara anestesiante (caudales de oxígeno: 0,5 a 1 L / min, la concentración de isoflurano: 3-4% (o menos) equipada con un sistema de recogida de gases. </li><li> Transferir el ratón desde la cámara de anestesiar a la cámara de imágenes del Multimodo En vivo Imager óptico cuando el ratón está anestesiado. </li><li> Coloque una ojiva sobre la nariz del ratón y abrir el flujo de administrar anestesia continuasia durante la adquisición de la imagen (caudales de oxígeno: 0,5-1 L / min, la concentración de isoflurano: 2-3% (o inferior). </li><li> Adquirir imágenes de fluorescencia utilizando un tiempo de exposición de 5 a 15 segundos. </li><li> Realizar el análisis y tratamiento de imágenes incluida la corrección de fondo o el ajuste de contraste. </li></ol> 3. Fluorescencia de imágenes ex vivo Herdox fluorescencia se pueden obtener imágenes de los tumores y los órganos específicos (incluyendo el hígado, riñón, bazo, corazón y músculo esquelético) cosechadas de los ratones sacrificados a las 24 horas después de la inyección final (Día 7) de Herdox. <ol><li> Encienda el Multimodo En vivo Imager óptico. </li><li> Seleccione un filtro de paso de banda de emisión (580 nm ± 20 nm) para la detección de fluorescencia doxorrubicina. </li><li> Encienda el láser de Argón Kriptón y coloque un filtro de paso de banda de excitación (488 nm ± 10 nm) en el camino óptico del láser. </li><li> Coloque los tumores y órganos específicos dispuestos en una placa de Petri en la cámara de imágenes of En el Imager óptica multimodo vivo. </li><li> Adquirir imágenes de fluorescencia de los tejidos utilizando un tiempo de exposición de 5 a 15 segundos. Un ejemplo de adquisición de imágenes de fluorescencia inicial se muestra en la Figura 2a. Repita el mismo mediante un placa Petri vacía, lo que servirá de fondo (Figura 2b). </li><li> Realizar el análisis y tratamiento de imágenes incluida la corrección de fondo o el ajuste de contraste. Un ejemplo de una imagen corregida se muestra en la Figura 2c, que resulta de la resta de la figura 2b de la Figura 2a. </li></ol> 4. In situ Imagen confocal de Tumores En la imagen confocal in situ permite la detección y el análisis de la acumulación tumor Herdox a nivel celular. <ol><li> Encienda una SPE microscopio confocal Leica. </li><li> Seleccione 488 luz láser nm para la excitación de la doxorrubicina y la emisión de longitudes de onda (560-620 nm) para la doxorrubicinadetección de fluorescencia. </li><li> Seleccionar un objetivo de 40X o 63X y aceite de inmersión gota en la lente del objetivo. </li><li> Extraer los tumores de los ratones recién sacrificados que hayan recibido previamente tratamientos Herdox y se burlan como se describe en el procedimiento 2. </li><li> Tumores Colocar en una placa de Petri en hielo para evitar la degradación del tejido y, a continuación, transferir los tumores a una cámara de T Delta de imagen confocal. </li><li> Adquirir confocal de imágenes de los tumores a profundidades focales secuenciales (tamaño de paso: 1 m, grueso: 20 micras). Un ejemplo de imágenes secuencialmente-adquiridos a lo largo del eje z se muestra en la Figura 3, panel izquierdo. </li><li> Realizar máxima intensidad z-proyección de las imágenes. Una proyección de intensidad máxima de z-apiladas imágenes se muestra en la Figura 3, panel derecho. </li><li> Cálculo de las intensidades medias de fluorescencia de la intensidad máxima Z -. Imágenes de proyección media de intensidades de fluorescencia de las imágenes sobre el campo de vista global fueron calculard utilizando ImageJ. </li></ol> 5. Spectral Imaging radiométrico y Análisis Imágenes espectrales y análisis radiométrico permite la discriminación entre Dox fluorescencia y autofluorescencia. <ol><li> De alimentación en un microscopio confocal de barrido de fluorescencia láser. </li><li> Adquirir 15 imágenes de los tumores Herdox tratadas y sin tratar a una profundidad especificada en el rango espectral de 510 a 650 nm, con un paso de 10 nm y excitación a 488 nm de luz usando un microscopio confocal Leica SPE. </li><li> Prepare una solución 100 mM de doxorrubicina. </li><li> Realice imagen espectral de la solución de doxorubicina 100 mM para obtener la firma espectral puro Dox fluorescencia (rango espectral: 510 a 650 nm, un tamaño de paso: 10 nm). Los resultados típicos de adquisición de la imagen de formación de imágenes espectrales y espectro de fluorescencia resultante representan como un gráfico se muestra en la Figura 4. </li><li> Adquirir la firma espectral autofluorescencia desde una imagen cube (rango espectral: 510 a 650 nm, un tamaño de paso: 10 nm) obtenida por imágenes espectrales de los tumores no tratados. Los resultados típicos de adquisición de la imagen de formación de imágenes espectrales y espectro de fluorescencia resultante representan como un gráfico se muestra en la Figura 5. </li><li> Generar cuatro firmas espectrales de referencia (autofluorescencia puro, 0.1.doxorubin 0.9. Autofluorescencia, 0.2. Doxorrubicina 0.8. Autofluorescencia, 0.3.doxorubin 0.7. Autofluorescencia) utilizando el programa que desarrollamos 9. Una curva típica que muestra cuatro firmas espectrales de referencia se muestra en la Figura 6. </li><li> Realizar la clasificación espectral de las imágenes tal como se define por las firmas espectrales de referencia a través de medida de la distancia euclidiana utilizando el programa que previamente desarrollado 9. </li><li> Realizar desmezcla espectral lineal de las imágenes mediante el uso de un programa de desmezcla espectral (plug-in en ImageJ) hemos desarrollado 7, 10, para la comparación con la imagen espectral y radiométrica análisis. Un ejemplo de separar fluorescencia Herdox de autofluorescencia por desmezcla espectral lineal se muestra en la Figura 7. </li></ol>

<ol><li>Agadjanian, H., Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+Targeting+by+DNA+Capture+in+Viral+Protein+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy Targeting by DNA Capture in Viral Protein Particles.</a> Nanomedicine. 7 (3), 335-352 (2012).</li>
<li>Agadjanian, H., Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+detection+and+elimination+by+a+targeted+gallium+corrole%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Tumor detection and elimination by a targeted gallium corrole.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (15), 6105-6110 (2009).</li>
<li>Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+delivery+of+corroles+to+cells+via+noncovalent+conjugates+with+viral+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins.</a> Pharm. Res. 23 (2), 367-377 (2006).</li>
<li>Medina-Kauwe, L. K., Maguire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+gene+delivery+to+human+breast+cancer+cells+by+targeted+Ad5+penton+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Non-viral gene delivery to human breast cancer cells by targeted Ad5 penton proteins.</a> Gene Therapy. , 81753-81761 (2001).</li>
<li>Medina-Kauwe, L. K., Kasahara, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3PO%2C+a+novel+non-viral+gene+delivery+system+using+engineered+Ad5+penton+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">3PO, a novel non-viral gene delivery system using engineered Ad5 penton proteins.</a> Gene Therapy. , 8795-8803 (2001).</li>
<li>Rentsendorj, A., Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Typical+and+atypical+trafficking+pathways+of+Ad5+penton+base+recombinant+protein%3A+implications+for+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Typical and atypical trafficking pathways of Ad5 penton base recombinant protein: implications for gene transfer.</a> Gene Ther. 13 (10), 821-836 (2006).</li>
<li>Hwang, J. Y., Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodality+Imaging+In+vivo+for+Preclinical+Assessment+of+Tumor-Targeted+Doxorubicin+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Multimodality Imaging In vivo for Preclinical Assessment of Tumor-Targeted Doxorubicin Nanoparticles.</a> PLoS ONE. 7 (4), e34463(2012).</li>
<li>Hwang, J. Y., Wachsmann-Hogiu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multimode+Optical+Imaging+System+for+Preclinical+Applications+In+Vivo%3A+Technology+Development%2C+Multiscale+Imaging%2C+and+Chemotherapy+Assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">A Multimode Optical Imaging System for Preclinical Applications In Vivo: Technology Development, Multiscale Imaging, and Chemotherapy Assessment.</a> Mol. Imaging Biol. , (2011).</li>
<li>Hwang, J. Y., Gross, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+spectral+imaging+for+fast+tumor+detection+and+chemotherapy+monitoring+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Ratiometric spectral imaging for fast tumor detection and chemotherapy monitoring in vivo.</a> J. Biomed. Opt. 16 (6), 066007(2011).</li>
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<li>Hwang, J. Y., Moffatt-Blue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimode+optical+imaging+of+small+animals%3A+development+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+of+SPIE%22%5BJournal%5D)">Multimode optical imaging of small animals: development and applications.</a> Proc. of SPIE. 6411, (2007).</li>
<li>Ducros, M., Moreaux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+unmixing%3A+analysis+of+performance+in+the+olfactory+bulb+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spectral unmixing: analysis of performance in the olfactory bulb in vivo.</a> PLoS One. 4 (2), e4418(2009).</li>
<li>Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+unmixing+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biochem.+Eng.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear unmixing in light microscopy.</a> Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. , 95245-95265 (2005).</li>
</ol>

El autor, Daniel Farkas, es Presidente de espectral Imagen Molecular. El resto de autores no tienen intereses en conflicto.

Dox fluorescencia puede ser detectable in vivo utilizando el generador de imágenes multimodo cuando los tumores son subcutánea. Sin embargo, la dosis terapéuticamente eficaz de Herdox (0,004 mg / kg) está por debajo del umbral de detección después de una sola dosis. En contraste, después de 7 inyecciones diarias (1 vez al día durante 7 días), la acumulación del tumor y la retención de la partícula es suficiente para permitir la visualización de la fluorescencia Dox. Es de suma impor...

Tumor-targeting de la quimioterapia tiene el potencial de eliminar las células cancerosas en dosis más baja en comparación a las drogas no orientados, debido a que más de la terapia administrada se puede acumular en su destino previsto, en lugar de distribuir al tejido no tumoral. A medida que la última situación sería diluir la eficacia de la droga y por lo tanto requieren dosis más altas para ser eficaz, tumor-alcance tiene tanto ventajas terapéuticas y de seguridad más de un tratamiento no específico estándar. Orientación de la quimioterapia mediante encapsulación en nanopartículas auto-ensambladas permite que el fármaco permanezca sin modificar químicamente en contraste con fármacos que se unen covalentemente a moléculas de direccionamiento. Como tal vinculación tiene el potencial de alterar la actividad de ambos el medicamento y la molécula diana; montaje no covalente permite que la potencia del fármaco a ser retenido. Hemos demostrado anteriormente que la novela de tres componentes, complejos auto-ensamblado, Herdox, se dirige a los tumores HER2 + <em&gt; In vivo y provoca la ablación de tumores de crecimiento sin afectar al tejido normal, incluyendo el corazón 1. Herdox se forma a través de interacciones no covalentes entre la proteína de unión al receptor celular-penetración, HerPBK10, y el agente quimioterapéutico, doxorubicina (Dox), a través de un pequeño conector de ácido nucleico. HerPBK10 se une el factor de crecimiento epidérmico humano (HER) y desencadena la endocitosis mediada por el receptor 2-4, mientras que la penetración de membrana endosomal se lleva a cabo a través de la incorporación de derivados de adenovirus-pentón base de proteína de la cápside 4-6. Un dominio cargado positivamente en la proteína de unión de ácidos nucleicos permite a los 4, 5, a través del cual Dox ADN-intercalado puede ser transportado para la administración dirigida. Electrofílica, intercalación, y posiblemente interacciones oligomerización de proteínas facilitan autoensamblaje en redondo 10-20 nm partículas que son estables en la sangre y en el almacenamiento prolongado a temperaturas diferentes 1. Orientación preferencial a HER2 + células tumorales se ve facilitada por la afinidad de ligando de HER2 mejorada cuando se eleva. Nuestros estudios previos han demostrado que la administración sistémica de los rendimientos Herdox acumulación preferencial en los tumores de más de tejido no tumoral y en comparación con untargeted Dox 1, y la penetración en las células tumorales in vivo 7. Hemos observado que las liberaciones Herdox Dox después de la entrada de células tumorales, lo que permite la acumulación de Dox en el núcleo 1. Tumor-acumulación parece que se correlaciona con el nivel del receptor, como tumores relativamente bajos que expresan HER2 se acumulan menos Herdox comparación con aquellos con niveles comparativamente más altos HER2 1. Por otra parte, la concentración eficaz la muerte celular presenta una correlación inversa con HER2 visualización en líneas de células tumorales que expresan HER2 superficie celular diferentes niveles 1. Herdox presenta una ventaja terapéutica y la seguridad sobre Dox no directo, como el asesinato del tumor se produce en más de la dosis 10 veces menor en comparación con el untardrogas geted y produce ningún efecto adverso detectable en el corazón (detectado por ecocardiografía y tinción histológica) o tejido del hígado (detectado por tinción de TUNEL), en contraste con Dox no directo 1. A pesar de su derivación de una proteína de la cápside viral, HerPBK10 no exhibe inmunogenicidad detectable a niveles terapéuticos 2. Mientras que los anticuerpos pre-existentes a adenovirus conjunto pueden reconocer HerPBK10, no son capaces de impedir la unión de células 2. El volumen del tumor medido con el tiempo es un método estándar para evaluar la eficacia terapéutica de terapias dirigidas, y se ha empleado para evaluar la eficacia terapéutica de Herdox. Como complemento de este enfoque con in vivo y ex vivo de imágenes de fluorescencia de intensidad nos ha permitido evaluar mejor la eficiencia del objetivo 7. Hemos integrado específicamente en situ imagen confocal de los tumores extirpados con el análisis espectral de Dox fluorescencia para verificar que no Herdoxt sólo acumula en tumores in vivo, pero penetró en las células tumorales y Dox entregado en el citoplasma y el núcleo 7. El análisis espectral, además, nos ha permitido distinguir la fluorescencia Dox de autofluorescencia 7. Aquí se demuestra en mayor detalle nuestro enfoque para evaluar Herdox in vivo después de la administración sistémica, y lo más importante, para la evaluación de orientación a través de métodos y análisis de imágenes multimodo.

<table><tbody><tr><td>Microscopio confocal de barrido láser de fluorescencia</td><td>Leica</td><td>SPE</td><td></td></tr><<tr><td>em>In Vivo Generador de imágenes ópticas Imágenes</td><td>moleculares espectrales</td><td>multimodo In Vivo Generador de imágenes</td><td></td>óptico</tr><tr><td>Doxorrubicina-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4035</td><td></td></tr><tr><td>Ratón desnudo (NU/NU), hembra, 6-8 semanas</td><td>Charles River</td><td>Código de cepa 088</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-435 células tumorales humanas HER2+</td><td>NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository</td><td>0507292</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de insulina de 3/10 cc U-100 con aguja de fijación permanente Ultra-FineIV de 29G x 1/2"</td><td>Cámara</td> BD <td>309301</td><td></td></tr><tr><td>Delta T </td><td>Bioptechs</td><td>04200417B</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de la proteína viral dirigida nanopartículas entregado a tumores her2 +

Analysis of Targeted Viral Protein Nanoparticles Delivered to HER2+ Tumors

La nanopartícula HER2 + del tumor-específica, Herdox, exhibe acumulación tumoral-preferencial y la ablación de tumores de crecimiento en un modelo animal de cáncer de HER2 +. Herdox está formado por no covalente de auto-ensamblaje de una proteína de penetración celular específica del tumor con el agente de quimioterapia, doxorubicina, a través de un pequeño conector de ácido nucleico. Una combinación de electrofílico, intercalación y las interacciones oligomerización facilitar autoensamblaje en redondo 10-20 nm partículas. Herdox muestra una estabilidad en la sangre, así como en el almacenamiento prolongado a temperaturas diferentes. El suministro sistémico de Herdox en ratones portadores de tumores da como resultado la muerte de las células del tumor, sin efectos adversos detectables en el tejido no tumoral, incluyendo el corazón y el hígado (que se someten a daño marcado por la doxorubicina no dirigidos). HER2 elevación facilita orientación a las células que expresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano, por lo tanto, los tumores se presentan niveles elevados de HER2 presentan una mayor acumulación de Herdox en comparación con las células de expresióncantar niveles más bajos, tanto in vitro como in vivo. La intensidad de fluorescencia de imagen combinada con el análisis y confocal espectral situ nos ha permitido verificar en el tumor vivo focalización y la penetración de células tumorales de Herdox después de la administración sistémica. A continuación te detallamos los métodos de evaluación de tumor de la orientación a través de imágenes multimodo después de la administración sistémica.

La Figura 1 muestra el prototipo de imágenes in vivo óptica, que fue construido para el propósito de la adquisición de imágenes bajo múltiples modalidades, incluyendo la intensidad de fluorescencia, espectral, curso de la vida, 2-fotón confocal, intra-vitales, y en imágenes de bioluminiscencia. Además, la alta cámara sensible enfriada y líneas de láser de alta potencia incorporado en este sistema los rendimientos de imágenes de fluorescencia de mayor contraste en comparación con los si...

Este artículo detalla los procedimientos para el análisis de imágenes ópticas de las nanopartículas de tumor específico, Herdox. En particular, se describe aquí el uso detallada del dispositivo de formación de imágenes multimodo para la detección de tumor de la orientación y la evaluación de la penetración del tumor.

Análisis de la proteína viral dirigida Nanopartículas Entregado a tumores HER2 +

The HER2+ tumor-targeted nanoparticle, HerDox, exhibits tumor-preferential accumulation and tumor-growth ablation in an animal model of HER2+ cancer. ...

El objetivo general de este procedimiento es detectar y analizar la administración sistémica in vivo de la nanopartícula dirigida al tumor HeroX mediante imágenes ópticas multimodales. Primero, se inyecta la nanopartícula en la vena de la cola de un ratón con tumor y se adquieren imágenes de fluorescencia utilizando un sistema de imagen óptica multimodal. Tras la eutanasia, se extraen el tumor y los órganos y se vuelven a imaginar para detectar las partículas fluorescentes dentro de las células tumorales.Posteriormente se realiza la imagen confocal in situ. El análisis de las imágenes obtenidas demuestra un direccionamiento y una penetración cuantificables de los her docs en los tumores tras la administración sistémica. Una ventaja importante de las técnicas de imagen multimodal frente a las técnicas existentes, como el modo de imagen único, es que proporcionan información múltiple y complementaria que puede mejorar el análisis y la cuantificación de la administración en tumores.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la administración de fármacos, como si un fármaco dirigido no solo se entrega a los tumores, sino que en realidad penetra en las células tumorales. La demostración del procedimiento estará a cargo de la Dra. J Yun Wang, antigua becaria posdoctoral en mi laboratorio, y Janet Markman, una estudiante de posgrado actual en este protocolo. De seis a ocho semanas de edad.Se utilizan nuevos ratones con tumores xenoinjertados subcutáneos bilaterales en el flanco. Prepárese para la administración sistémica mezclando suficiente HeroX con solución salina estéril para obtener 0,2 mililitros de una dosis de 0,004 miligramos por kilogramo de HeroX por inyección. Aspire suavemente 0,2 mililitros de la mezcla de HeroX en una jeringa de insulina de tres décimas de cc equipada con una aguja de calibre 29.Tenga cuidado para asegurarse de que no haya burbujas tras la anestesia. Inyecte toda la mezcla en la vena de la cola tras la inyección. Presione la cola para evitar la pérdida de sangre desde el sitio de inyección.Después de que deje de sangrar, limpie el sitio de inyección con un hisopo estéril y devuelva al ratón a la jaula. Repita la inyección en el mismo ratón durante seis días consecutivos más. Una vez al día, se puede detectar la acumulación de fluorescencia de HeroX en los tumores hasta el último día de inyección.Día siete, utilizando un imagenador multimodal. Los procedimientos aquí descritos emplean un sistema de imagen óptica con capacidades de intensidad de fluorescencia, fluorescencia espectral, vida media y obtención de imágenes confocales intravital. Se muestra aquí el prototipo del imagenador óptico in vivo.La cámara de alta sensibilidad refrigerada y las líneas láser de alta potencia incorporadas en este sistema producen imágenes de fluorescencia con mayor contraste en comparación con los sistemas ópticos de imagen comerciales, especialmente para la detección in vivo de la fluorescencia de doxorrubicina. Encienda el imagenador óptico in vivo multimodal en el software. Seleccione un filtro de paso de banda de emisión adecuado para la detección de fluorescencia de doxorrubicina.Encienda el láser y coloque un filtro de paso de banda de excitación en la trayectoria óptica del láser. Después de anestesiar un ratón en la cámara de anestesia con isoflurano, transfiéralo a la cámara de imagen del imagenador óptico multimodal in vivo. Coloque un cono nasal sobre la nariz del ratón y abra el flujo para administrar anestesia continua.Durante la adquisición de imágenes, adquiera imágenes de fluorescencia utilizando un tiempo de exposición de cinco a 15 segundos. La fluorescencia de su doc puede visualizarse en tumores y órganos específicos, incluyendo hígado, riñón, bazo, corazón y músculo esquelético obtenidos de ratones sacrificados 24 horas después del último día de inyección. Encienda el imagenador óptico in vivo de modo múltiple.Como antes, coloque entonces los tumores y órganos específicos dispuestos en una placa de Petri. Dentro de la cámara de imagen del imagenador óptico multimodal in vivo, adquiera imágenes de fluorescencia de los tejidos utilizando un tiempo de exposición de cinco a 15 segundos. Luego repita las mismas adquisiciones utilizando una placa de Petri vacía, que servirá como fondo tras la adquisición.Realice análisis y procesamiento de imágenes, incluyendo corrección del fondo o ajuste del contraste. La imagen confocal in situ permite la detección y el análisis de la acumulación tumoral en el rebaño a nivel celular. Utilizando un microscopio confocal.Seleccione luz láser de 488 nanómetros para la excitación de la doxorubicina y longitudes de onda de emisión de 560 a 620 nanómetros. Para la detección de fluorescencia de doxorubicina, seleccione un objetivo de 40 x o 63 x y coloque una gota de aceite de inmersión sobre él. Coloque los tumores del ratón sacrificado en una placa de Petri para evitar la degradación del tejido.Luego transfiera los tumores a una cámara delta T para la obtención de imágenes confocales. Adquiera imágenes confocales de los tumores a profundidades focales secuenciales con un tamaño de paso de un micrómetro y un grosor de 20 micrómetros. A continuación se muestra un ejemplo de imágenes adquiridas secuencialmente a lo largo del eje Z.Genere proyecciones Z de intensidad máxima de las imágenes. Luego, utilizando ImageJ o un programa similar, calcule las intensidades medias de fluorescencia de las imágenes de proyección Z de intensidad máxima para la relación del campo total de visión. La imagen espectral métrica y su análisis permiten discriminar entre doxorrubicina, fluorescencia y autofluorescencia.Utilizando un microscopio confocal láser de barrido con fluorescencia, adquiera 15 imágenes de los tumores tratados y no tratados con HeroX a una profundidad específica dentro del rango espectral de 510 a 650 nanómetros, con un tamaño de paso de 10 nanómetros y excitación con luz de 488 nanómetros, empleando un microscopio confocal Leica SPE. A continuación, prepare una solución de doxorrubicina de 100 micromolar en solución salina. Realice la imagen espectral de la solución de doxorrubicina de 100 micromolar.Para obtener la firma espectral pura de la fluorescencia de doxorrubicina, adquiera la firma espectral de autofluorescencia del cubo de imágenes mediante la obtención de imágenes de tumores no tratados. Una vez que se hayan recopilado todos los datos, genere firmas espectrales de referencia, realice la clasificación espectral de las imágenes y lleve a cabo la descomposición espectral lineal de dichas imágenes para obtener una evaluación cuantitativa de la acumulación de her doc en los tumores.Se obtuvieron imágenes de fluorescencia confocal a diferentes profundidades focales in situ, seguido de la proyección Z de intensidad máxima de las imágenes y la adquisición de la intensidad media de fluorescencia de la imagen proyectada. La alta fluorescencia tumoral mostrada en esta imagen es típica tras la administración sistémica de her docs e indica su capacidad de targeting preferencial hacia el tumor. La fluorescencia detectada en el músculo esquelético es atípica y puede deberse a anomalías en el procedimiento de inyección.Cualitativamente, esta imagen tiene un fondo bajo. Para el análisis cuantitativo, se realiza una corrección de fondo utilizando un recipiente vacío como se muestra aquí. La imagen corregida resultante presenta una señal de fondo más alta en el borde de la imagen en comparación con la original, porque la imagen de fondo tiene intensidades más bajas en el borde de la imagen.Las imágenes apiladas que se muestran a la izquierda son representativas de los escaneos confocales de tejido tumoral obtenidos a profundidades secuenciales de un micrómetro. La imagen de la derecha muestra la compilación de las imágenes apiladas de la izquierda. La imagen compilada contiene la información de acumulación de HeroX sobre las profundidades Z indicadas en cada píxel, y por lo tanto, el promedio de las intensidades de fluorescencia refleja cuantitativamente la acumulación general de herd doc en tumores a diferentes profundidades.Para distinguir la fluorescencia del doxorrubicina de la autofluorescencia en tumores y discriminar cuantitativamente ambos con métricas de alta relación de especificidad, se realiza imágenes espectrales y su análisis. Esta imagen muestra las firmas espectrales puras del doxorubicin.La intensidad de fluorescencia del área delimitada por la línea punteada en las longitudes de onda de emisión indicadas genera un histograma que muestra el perfil de doxorrubicina en el espectro de longitud de onda de 510 a 650 nanómetros. Aquí se muestra la firma espectral pura de la autofluorescencia. La fluorescencia emitida por un tumor no tratado en las longitudes de onda de emisión indicadas produce una pendiente que representa el perfil de emisión de autofluorescencia. Referencia.Las firmas espectrales también se crearon mezclando diferentes proporciones de las firmas espectrales puras. Mediante el programa, desarrollamos cada referencia. La firma espectral aquí representa la fluorescencia relativa de sus muelles acumulados en tumores con respecto a la autofluorescencia.Después de obtener las firmas espectrales de los acopladores y la autofluorescencia, las señales de los acopladores se separan mediante desmezcla espectral lineal. La figura muestra la imagen combinada de autofluorescencia y sus acopladores antes de la desmezcla espectral y la imagen separada de sus acopladores después de la desmezcla espectral. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo combinar la intensidad de fluorescencia, el sistema Comfort Car y las modalidades de imagen espectral para mejorar el análisis y la cuantificación de la administración tumoral.No olvide que trabajar con doxorrubicina puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de doble guante y el cambio frecuente de guantes durante la realización de este procedimiento.

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Se presenta un nuevo enfoque para cuantificar la localización de las nanopartículas en los vasos sanguíneos de los tumores humanos transplantados con dinámica y en tiempo real de imágenes intravital en un modelo de embrión aviar.

Evaluación de la absorción de nanopartículas en los tumores en tiempo real utilizando intravital imagen

Nanopartículas de plantas virales (VNPs) son prometedoras plataformas para aplicaciones en biomedicina. A continuación, se describen los procedimientos para la propagación de plantas VNP, purificación, caracterización y bioconjugación. Finalmente, mostramos la aplicación de VNPs para la recalada del tumor y la formación de imágenes mediante un modelo de xenotrasplante de ratón y de imágenes de fluorescencia.

Las nanopartículas virales para<em&gt; En vivo</em&gt; Imágenes de tumores

Un protocolo para el análisis de nanopartículas de seguimiento (NTA) y de alto rendimiento de citometría de flujo para evaluar las nanopartículas poliméricas de suministro de genes se describe. NTA se utiliza para caracterizar la distribución del tamaño de partícula de nanopartículas y la distribución de partículas por plásmido. De alto rendimiento de la citometría de flujo permite una evaluación cuantitativa eficacia de la transfección de una biblioteca de biomateriales de suministro de genes.

La evaluación de la administración de genes nanopartículas poliméricas por nanopartículas de análisis de seguimiento y de alto rendimiento Citometría de Flujo

Un ejemplo de un fármaco de nano a base de ácido polimálico se presenta hacia el diseño racional de la medicina personalizada que es aplicable al cáncer. En él se describe la síntesis de un fármaco nano para tratar el cáncer de mama HER2-positivo humano en un ratón desnudo.

Biopolímeros Nano basados ​​en ácido polimálico de Focalización de múltiples Marcadores tumorales: una oportunidad para la medicina personalizada?

Aquí se describe un protocolo para la síntesis de nanopartículas magneto-plasmónica con un fuerte momento magnético y un fuerte en el infrarrojo cercano (NIR) absorbancia. El protocolo también incluye conjugación de anticuerpos a las nanopartículas a través de la fracción Fc para diversas aplicaciones biomédicas que requieren orientación específica molecular.

Nanoclusters Síntesis de Immunotargeted Magneto-plasmónica

Péptidos virales derivados juntados a conjugados de anticuerpos (ACs) es un enfoque ganando impulso debido a la posibilidad de entregar cargas moleculares con la acumulación de células de tumores aumentado. Utilizando métodos comunes para evaluar verbal de péptido, AC y acumulación intracelular de carga útil y tumor targeting, este protocolo ayuda a los investigadores durante las fases de desarrollo inicial clave.

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Aquí presentamos un protocolo para probar la eficacia de las terapias dirigidas seleccionadas en base a la composición genómica de un tumor. El protocolo describe la identificación y validación de reordenamientos estructurales del ADN, injerto de tumores de los pacientes en ratones y pruebas de respuestas a los fármacos correspondientes.

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