Implementar Clamp dinámico con conductancias sinápticas y artificiales en células de ratón ganglionares retinianas

El objetivo general del siguiente experimento es investigar los efectos de los cambios en la proporción y el tiempo relativo de las entradas sinápticas excitatorias e inhibidoras en la actividad de picos de las neuronas utilizando células ganglionares de la retina como neuronas modelo. Esto se logra parcheando el cuerpo celular de una célula ganglionar en una retina de montaje completo, usando una pipeta de vidrio llena de una solución intracelular que se asemeja a la composición iónica fisiológica y amarillo de Lucifer para identificar morfológicamente el tipo de célula como un segundo paso usando una pinza dinámica, se inyecta un conjunto de formas de onda de conductancia excitatoria e inhibidora en el cuerpo celular, que producen un cambio en el potencial de membrana como respuesta. A continuación, se inyectan en el cuerpo celular diversas formas de onda de conductancia obtenidas de experimentos fisiológicos en condiciones de control o en presencia de fármacos para obtener las respuestas neuronales correspondientes.

Los resultados muestran los efectos de los cambios en la relación de excitación e inhibición sobre la actividad de aumento de las células ganglionares de la retina a partir de la inyección de corrientes compuestas por conductancias excitadoras e inhibidoras mediante registros dinámicos de pinzas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la pinza amperimétrica o la pinza amperimétrica, es que proporciona una herramienta interactiva mediante la cual la relación y el tiempo relativo de las conductancias sinápticas excitatorias e inhibidoras se pueden inyectar en las neuronas para investigar la influencia en las respuestas celulares. Esta metodología puede proporcionar información sobre la función de los circuitos de la retina, así como de cualquier otra red neuronal en el sistema nervioso central.

Comience este procedimiento configurando el sistema de reperfusión con 250 mililitros del medio de puntas carboxigenado en la configuración electrofisiológica. A continuación, unte uniformemente una fina capa de grasa para aspiradoras en el fondo de la cámara de perfusión. Séllalo con un cubreobjetos y asegúrate de que sea hermético.

A continuación, coloque una pequeña cantidad de grasa en los extremos superior e inferior de la cámara. La grasa mantendrá la rejilla en su lugar y evitará que presione demasiado fuerte sobre la retina. Ahora fije la cámara en la plataforma y alinee ambas aberturas después de eso.

Sacrificio de un animal por luxación cervical después de haber sido anestesiado con flúor. Retira rápidamente sus ojos con unas tijeras curvas pequeñas. Lávelos a fondo con líquido extracelular oxigenado por automóviles en un vaso de precipitados pequeño y colóquelos en una placa de Petri llena de líquido extracelular oxigenado por automóviles.

Bajo el microscopio de disección, haga un orificio de inserción con una aguja de calibre 19 en la córnea a unos dos milímetros del borde en ambos ojos. Este importante paso debe ser rápido para permitir la oxigenación de ambas riendas. Después de eso, retire una córnea con un pequeño par de tijeras de iris cortando paralelamente a su borde.

A continuación, retire el iris y la lente con un par de pinzas finas y repita los procedimientos para el otro ojo. Transfiera una copa ocular a un vaso de precipitados que contenga la solución extracelular oxigenada de la caja. Con la hoja del bisturí, corte un ocular por la mitad y separe suavemente la retina del epitelio pigmentario con una sonda de disección roma o tirando suavemente de ella.

A continuación, sostenga el borde del tejido retiniano desprendido cerca del aura serta con un par de pinzas finas y agarre el aura serta con otro par de pinzas finas. Tira de él hacia el centro de la retina. Este es un proceso delicado y puede llevar algunos intentos.

Si el aura tiene éxito, se eliminará el cuerpo ciliar de Serta y el humor vítreo y se reducirá la curvatura de la retina. A continuación, recorte los bordes y luego transfiera la retina a la cámara de perfusión con las células ganglionares hacia arriba. Mantenga el pañuelo en su lugar colocando la rejilla sobre las bolas de grasa.

Guarde el tejido restante con el otro ocular en la solución extracelular oxigenada de la caja para su uso posterior, monte la cámara de registro bajo un microscopio vertical. Ajuste inmediatamente la perfusión continua de la retina con una solución extracelular oxigenada de carbox A una velocidad de tres a cinco mililitros por minuto a 35,5 grados centígrados, asegúrese de que el electrodo de conexión a tierra esté en su lugar. Ahora encienda la fuente de luz del microscopio y concéntrelo en los cuerpos celulares de las células ganglionares a través de las 40 x del objetivo.

Localice el centro del orificio de montaje para la grabación. En este paso, fije una pipeta de vidrio de cinco a ocho mega ohmios en su soporte y muévala bajo el microscopio usando un manipulador de micrómetros bajo un objetivo de 40 x. Baje lentamente la pipeta hasta que forme un pequeño hoyuelo en la superficie de la membrana limitante interna.

Haga avanzar con cuidado la pipeta hasta que atrape una pequeña cantidad de tejido y, a continuación, muévala hacia arriba o hacia los lados para abrir un pequeño orificio y exponer los cuerpos celulares de las células ganglionares. Ahora llene una pipeta limpia con ocho a 10 microlitros, una solución intracelular a base de potasio con amarillo Lucifer. Insértelo en el soporte, conectado a la etapa principal del amplificador, y asegúrese de que el electrodo de cloruro de plata clorado esté sumergido.

Seleccione una celda con un cuerpo de celda grande. Baje lentamente la punta de la pipeta con presión positiva para hacer un pequeño hoyuelo en la superficie de la membrana. Luego deténgase y libere la presión para obtener un sello giga.

Una vez que se logra un sello giga, aplique suavemente presión negativa para romper la membrana con el fin de lograr una configuración de abrazadera de parche de celda completa. Este procedimiento es un paso delicado. Si se aplica demasiada presión negativa, la conexión tiene fugas.

Si es demasiado poco, la membrana permanece intacta. Con el tiempo, el amarillo Lucifer llenará la célula, lo que permitirá la visualización de la morfología de la célula si es estable. Esta configuración debe durar 30 minutos o más.

Ahora realice una prueba de voltaje de corriente desde menos 75 milivoltios hasta 35 milivoltios positivos cada 10 milivoltios usando patch master y proceda a las pruebas posteriores. Solo si hay una corriente de sodio mayor que un nanoamperio. A continuación, abra la vista de laboratorio y ejecute el programa neuro acuma escrito a medida.

Establezca el número de repetición en ocho. A continuación, ajuste los potenciales de inversión de las conductancias excitatoria e inhibitoria a cero y menos 75 milivoltios respectivamente. Seleccione un par coincidente de conductancias excitatorias e inhibidoras para la prueba y la traza de conductancia excitatoria verde y la traza roja de conductancia inhibitoria aparecerán en el panel inferior.

Después de eso, regrese al maestro de parches y seleccione el modo de pinza actual. Cambie inmediatamente el amplificador al modo de pinza amperimétrica en neuro acuma. Presione el botón de grabación.

La respuesta celular con ráfaga de potenciales de acción aparecerá en el panel superior. Luego inyecte corriente en la celda con baja conductancia. Primero, si se observa poca o ninguna respuesta, aumente la corriente en pequeños incrementos hasta que produzca una respuesta fuerte.

La inyección excesiva de corriente puede matar la célula. Una vez finalizadas las pruebas. Seleccione un nuevo par de formas de onda de conductancia y repita los procedimientos para todos los pares de conductancias fisiológicas y artificiales.

Después de grabar, retraiga con cuidado la pipeta para que el cuerpo celular permanezca intacto. Después, fije inmediatamente el tejido y el formaldehído al 4% durante 30 minutos, seguido de tres lavados de 10 minutos con tampón de fosfato molar 0,1, refrigere y realice la tinción de anticuerpos al día siguiente o dentro de una semana cuando esté listo. Teñir contra las células ganglionares rellenas de amarillo Lucifer a temperatura ambiente con una IgG primaria de conejo amarillo anti Lucifer a una dilución de 1 a 10.000 durante cinco días.

Luego, al sexto día, pernoctando con la IgG secundaria anti conejo de cabra, agregue una dilución de uno a 500 Al final monte la retina en húmedo en medios de conservación fluorescentes. Coloque el cubreobjetos y séllelo con esmalte de uñas. Tome imágenes confocales de la morfología celular utilizando un microscopio confocal Leica SPECT dos.

Aquí están las respuestas de una célula ganglionar a la inyección de formas de onda de conductancia excitadora e inhibidora obtenidas de los experimentos de control indicados en verde y rojo respectivamente. Y aquí están las respuestas a la inyección de formas de onda de conductancia registradas después de la aplicación de tetrodatoxina en el baño. Aquí están las respuestas de otra célula ganglionar a varios pares de brazos de formas de onda de conductancia.

Las relaciones entre la conductancia excitatoria y la conductancia inhibitoria se cambiaron de uno a cero a uno a dos. A medida que aumentaba el grado de inhibición, la respuesta de la célula disminuía, y aquí están las respuestas de una célula ganglionar al mismo nivel de excitación en el que variaba el inicio de la inhibición. Delta T representa la diferencia de tiempo entre el inicio de las conductancias inhibitoria y excitatoria.

A medida que se reducía el retraso de la inhibición, la respuesta de la célula se debilitaba. Este procedimiento es una técnica poderosa que ayuda a revelar las interacciones entre la exci tres y la entrada de sinaps inhibitoria que genera la salida neuronal.