Name: La barra estabilizadora: Administración de Alcohol para moscas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Aprende a medir comportamientos inducidos por alcohol en Drosophila usando una barra para moscas accesible. Este protocolo evalúa sensibilidad al etanol y ritmos circadianos en investigación de neurociencia.

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El financiamiento para esta investigación fue proporcionado por el Programa de Premio de Neurociencia de la Universidad de Florida State College de Medicina y el apoyo del Departamento de Ciencias Biológicas de la FSU. Financiación adicional fue proporcionado por una subvención-en-Ayudas del Fondo de Investigación del Alcohol Beverage Fabricante.

1. Montaje de la barra estabilizadora Justificación y visión: El sistema está diseñado para administrar porcentajes controladas de vapor de alcohol a las moscas. Nota: La figura 1 presenta una visión esquemática de la barra estabilizadora puesta a punto, como se describe a continuación en tres etapas (montaje del flujo de aire, la configuración del alcohol y las botellas de agua, y el montaje de los viales de observación). En definitiva, un flujo de aire constante se divide en dos fracciones que se burbujea a través de alcohol y agua, respectivamente, se mezclan, y se administró a 4 viales de observación. <ol><li> Asamblea de la circulación de aire <ol><li> Conecte un pedazo corto de tubo de silicona flexible, ya sea la construcción de aire o un aireador de acuario para generar un flujo de aire constante y división usando conectores y. Conecte la primera rama en el regulador de caudal de aire que controla la cantidad total de aire a través del sistema (normalmente 1.000 ml / min durante 4 viales de observación). </li><li> Inserte un conector rápido en el segundo tubode manera que la corriente de aire se puede interrumpir en el comienzo del experimento sin afectar el flujo de aire calibrado. Añadir un conector en Y y conecte cada tubo de ramificación al regulador de flujo de aire. </li><li> Conecte la tubería a los reguladores de flujo de aire y luego conectar dos metros de flujo de aire. </li></ol></li><li> Puesta en marcha de las botellas de alcohol y agua <ol><li> Añadir tubo flexible a la salida de los medidores de flujo de aire e insertar un tubo delgado de vidrio (secciones de 1 ml pipetas de vidrio) con una curva de 90 ° en el extremo de cada tramo de tubo. Esto servirá como el flujo de aire de entrada en las botellas de agua y alcohol. </li><li> Coloque tapones de goma con 2 orificios a través de ellos en las botellas llenas con alcohol y agua. Mantenga ambas botellas a una temperatura de 2 º C constante superior a la temperatura del aire ambiente utilizando un baño de agua. En nuestros experimentos, la habitación del medio ambiente se mantiene a 25 ° C, mientras que el baño de agua es a 27 ° C. </li><li> Inserte la pipeta de vidrio directamente a la unaIR entrada a través del tapón de goma y se extienden en el líquido hasta aproximadamente 1 cm de la parte inferior de la botella. </li><li> Insertar una sección del codo de pipeta de vidrio en el orificio restante en el tapón de goma hasta el final del vidrio es al ras con la parte inferior del tapón dentro de la botella. Inserte esta salida de aire en otro tramo de tubería. </li><li> Reúne a las corrientes de aire usando conectores y y utilizar otra longitud de tubo de silicona para dirigir el flujo de aire a través de un frasco de mezcla vacío o botella con secciones de pipeta de vidrio dobladas insertados a través de un tapón de goma de dos agujeros. Utilice otro trozo de tubo de silicona para la corriente de aire de salida mixta. </li></ol></li><li> Asamblea de la Observación Vial <ol><li> Dividir la corriente de aire de salida que emerge de la mezcla matraz de 2-3x para obtener 4 o 8 corrientes más pequeñas de aire de modo que múltiples viales de observación pueden ser utilizados en cada experimento. Conecte el tubo de silicona flexible para los viales de observación. </li><li> Configure el observatien viales usando viales vacíos sellados con un tapón de caucho que contiene dos agujeros a través de tubos de vidrio que proporcionan una entrada y una salida para el vapor de alcohol. </li><li> Cubra el extremo del primer tubo de vidrio con una red y mantener la malla en su lugar con un pequeño trozo de tubo de plástico flexible. Inserte este tubo a través del primer agujero hasta que se extiende a aproximadamente la mitad de la longitud del vial. Si es necesario, use cinta de teflón para obtener un ajuste perfecto. </li><li> Inserte el segundo tubo de vidrio también con el final cubierto por la compensación hasta que esté alineada con el borde interior del tapón de goma. </li><li> Colocar los viales en posición horizontal sobre un trozo de papel blanco para maximizar el contraste con las moscas en condiciones de luz roja tenue. </li><li> Mezcle fracciones apropiadas de la corriente de aire burbujeado a través de alcohol y la corriente de aire burbujeado a través del agua. Vigilar la presión de aire de forma continua y hacer los ajustes necesarios para mantener la mezcla deseada de las corrientes de aire. Nota: El funcionamiento continuode varios ensayos Fly Bar en paralelo o incluso un solo ensayo en una habitación pequeña puede conducir a una acumulación apreciable de vapor de alcohol. Para evitar la liberación continua de vapor de alcohol que pueden potencialmente afectar el investigador en una habitación cerrada, un sistema adecuado debe ser puesto en el lugar que elimina adecuadamente vapor de alcohol generado durante el experimento. Para eliminar vapores de alcohol, conectar una pieza 6-12 pulgadas de tubo sobre el segundo tubo de vidrio que sobresale de cada vial, unirlos y dirigir a un sistema de embudo de vacío. Los investigadores también deben asegurarse de que la sala de pruebas experimental suficiente ventilación. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de los animales de experimentación Justificación y visión general: la cultura adecuada y vivienda de las moscas serán reducir la variabilidad en los datos. Esto se logra a través de la estandarización y la minimización del estrés experimentado por las moscas. Por esa razón, sin anestesia (CO 2 o alternativas) se utiliza During cualquiera de las siguientes etapas del protocolo. Por otra parte, las moscas deben ser emparejados por edad a través de experimentos y puntos temporales para minimizar la variabilidad como es la norma para otros análisis del comportamiento, incluyendo el aprendizaje y la memoria experimentos 17. Diversa luz: condiciones de oscuridad se pueden usar para sondear la función del reloj circadiano en la respuesta de comportamiento a etanol. Para determinar si existe un ritmo diurno, los experimentos pueden llevarse a cabo bajo un ciclo LD definido para medir el rendimiento en específico Zeitgeber Times (ZT). ZT 0 representa amanecer y se define como el tiempo de luces en virtud de ciclos LD, mientras ZT 12 es las luces de tiempo se apagan con un ciclo LD 12:12 h. Bajo condiciones constantes, el tiempo circadiano (CT) mide el tiempo para el animal en ausencia de señales del medio ambiente, es decir, el tiempo de funcionamiento libre, y se relaciona con el ciclo de arrastre LD anterior. En silvestres de tipo Drosophila, CT refleja la ZT anterior durante los primeros díass en condiciones constantes el período circadiano de funcionamiento libre y ritmos son ~ 24 hr. Para medir la modulación circadiana y eliminar efectos de luz agudas sobre el comportamiento, las moscas son arrastradas a la luz: oscuridad ciclos y luego se transfirieron a condiciones de oscuridad constante (DD) antes de los experimentos. Experimentos circadianos se llevan a cabo en el segundo día de DD para medir el rendimiento en específico circadiano Times (CT). En Drosophila, luz continua (LL) condiciones dan lugar a la disfunción circadiana con oscilaciones moleculares humedecidas o suprimidos de los genes circadianos básicos y alteración de los ritmos circadianos de comportamiento como lo demuestra la actividad locomotora arrítmica 18-21 y la memoria arrítmica a corto plazo 17. El protocolo se ha optimizado para estudios circadianos y se puede simplificar para otros experimentos. Todos los experimentos se llevan a cabo utilizando circadianos tenue luz roja (luz roja sobrecarga ambiente &lt;1 lux en el banco superior, pequeñas luces de color rojo utilizado a los 12 centímetros de tubos~ 1 lux de luz). <ol><li> Traseras de las moscas a 25 ° C bajo 12:12 h luz: Condiciones de arrastre oscuros (LD). </li><li> Recoger las moscas recién eclosed al final del período de luz del día en el día 1 y almacenarlos durante 24 horas en condiciones de LD en la celebración de los viales que contienen una pequeña cantidad de alimentos altos de concentración de agar para minimizar la adherencia de los alimentos. Nota: Para garantizar moscas sanas, normalmente desarrolladas se recogen, sólo utilizar moscas recogidas en los primeros días después de la eclosión comienza en un frasco de cultivo. </li><li> Recoger lotes de aproximadamente 30 (25-35) moscas utilizando un aspirador en el día 2 hacia el final del período de luz, y la transferencia a viales de retención frescas. </li><li> Utilice una fuente de luz potente para dirigir las moscas hacia el fondo del vial. Dentro de este rango, el número exacto de moscas en cada vial no es crítica como observaciones de comportamiento se presentan en porcentajes con el número total de moscas contadas al final de cada experimento. </li><li> Mantener moscas en condiciones DD a 25 ° C FOr dos días. </li><li> En el día del experimento, colocar todas las moscas alojados en diferentes condiciones o incubadoras distintas de la sala de comportamiento experimental en la habitación durante al menos 1 h antes del experimento. Aclimatación reduce la variabilidad debido a los cambios de temperatura o humedad. </li><li> Hacer observaciones a los seis puntos de tiempo de un día (CT 1, 5, 9, 13, 17 y 21) con el fin de probar para la modulación del comportamiento circadiano. </li><li> Comparar múltiples puntos de tiempo dentro de un único conjunto de experimentos de comportamiento para aumentar la robustez del diseño experimental y minimizar la variabilidad específica a un solo experimento. Por ejemplo, las observaciones de la TC 1 y TC 13 se pueden obtener de forma simultánea si dos incubadoras con los horarios de luz-oscuridad opuestos se utilizan para el arrastre. Nota: El procedimiento anterior describe la preparación de los animales experimentales para los ensayos realizados en condiciones circadiano de oscuridad constante. Diversa luz: condiciones de oscuridad se pueden usar para sondear la función del relojen las respuestas de comportamiento a alcohol. Para determinar si existe un ritmo diurno de los experimentos pueden llevarse a cabo en virtud de un ciclo de LD para medir el rendimiento en específico Zeitgeber Times (ZT). Además, el protocolo puede ser utilizado con moscas criados en condiciones de luz constantes para las pruebas de experimentos disfunción circadiano. Para los protocolos alternativos que ponen a prueba las moscas alojados en condiciones de luz, ensayos de comportamiento aún deben realizarse en condiciones de oscuridad. Las moscas deben ser transferidos a la oscuridad durante 1 hora antes de la prueba para minimizar la variabilidad del comportamiento debido a los efectos agudos de la luz sobre el comportamiento. </li></ol> 3. Observaciones del Comportamiento Justificación y visión: El siguiente protocolo de administración de alcohol se ha optimizado para las observaciones bajo condiciones tenue luz roja. El Lorr dos medidas de comportamiento y sedación representan dos puntos distintos de embriaguez mosca. Lorr representa un punto tardío de embriaguez que incorpora la pérdida of motor y el control postural, mientras que las medidas de sedación un punto final muy tardía de la intoxicación. Genotipo o modulación circadiana pueden afectar a estas dos medidas en forma diferente; por lo tanto, se puede desear examinar tanto. En resumen, las moscas se cargan en los viales, el número de moscas que muestran LORR o sedación se anotó cada 5 min durante la exposición al vapor de alcohol, y el número total de moscas contadas al final del experimento. <ol><li> Antes de iniciar el experimento, ejecute el aire a través del sistema (aire burbujeó a través de botellas de agua y alcohol) durante al menos 10 min y utilizar ese tiempo para calibrar los flujos de aire. </li><li> Desconecte la liberación rápida para detener el flujo de aire. Cargue las moscas en los viales, y vuelva a conectar el flujo de aire e iniciar los temporizadores. Nota: Si las moscas que no responden o moscas muertas se quedan en los viales de retención, esto podría ser indicativo de las condiciones de estrés. En general, estas condiciones se pueden aliviar por la vivienda menos moscas en los viales que sostienen o la disminución de la pegajosidad de alimentos utilizando una ligeraly una concentración más alta de agar durante la preparación de alimentos. Para los análisis de comportamiento óptimo y mínima variabilidad entre los experimentos, las moscas deben estar sanos antes de los experimentos. </li><li> Para el tiempo exacto, use un temporizador para realizar un seguimiento del tiempo total de la exposición al alcohol y el uso de un segundo temporizador de cuenta hacia atrás para marcar los intervalos de 5 minutos. </li><li> Coloque un pedazo de papel blanco bajo los viales para aumentar el contraste y la visibilidad volar, especialmente en condiciones de luz roja tenue. </li><li> Compruebe el flujo de aire con regularidad durante un experimento para mantener niveles constantes. Generalmente, una vez que los flujos de aire se han estabilizado, que permanecen estables durante la duración del experimento. </li><li> Cuente el número de moscas que han perdido su reflejo corregir una vez cada 5 minutos durante un periodo de 1 hora. Como la sensibilidad de alcohol varía entre los genotipos y las bases genéticas, puede ser deseable para llevar a cabo evaluaciones más frecuentes o para llevar a cabo el experimento durante un período de tiempo más largo. </li><li> Levante la slightl vialy de la superficie, y dirigir la luz de una linterna de luz roja hacia el papel detrás del vial. Mantenga las linternas rojas de mano a una distancia de al menos 12 pulgadas al vial experimental para mantener los niveles de luz no mayores de 1 lux para todos los experimentos en condiciones de luz roja tenue. </li><li> Medir los niveles de luz usando un medidor de luz para establecer estándares para todos los experimentos. </li><li> Determinar el número de moscas que han perdido su reflejo corregir mediante la aplicación de un grifo firme para el vial y contar cuántas moscas no logran enderezarse dentro de aproximadamente 4 seg. Las moscas que muestran Lorr aún pueden mover sus patas y alas, pero no pueden convertirse en posición vertical. </li><li> Al final de la sesión, contar el número total de moscas en cada vial. Nota: En ocasiones, una sola mosca puede quedar atrapado entre el tapón y el lado de carga cuando vuela en los viales experimentales. Como esto se hace en la oscuridad, no puede ser observado fácilmente por lo que es necesario contar el total de entumecidoer de moscas en el final del experimento para calcular correctamente porcentajes. </li></ol> Además, este procedimiento también puede ser usado para medir la sedación de moscas, que representa un criterio de valoración del comportamiento diferente. Mientras las moscas sedados han perdido su reflejo derecha, sedación requiere una mayor exposición al alcohol. En cuanto al comportamiento, la sedación puede ser caracterizado por la falta total de actividad motora evidente con las moscas que queda inmóvil en el vial después de la firma aa grifo al vial. Para la sedación, cuente el número de moscas que permanecen inmóviles sin piernas agitando después de la entrega de un toque firme del vial. Además, el vial se puede enrollar un lado a otro para determinar si las moscas individuales todavía conservan su reflejo de agarrar. 4. Análisis de Datos <ol><li> Determinar la LORR porcentaje en cada tiempo de evaluación basado en el número total de moscas en cada vial. </li><li> Estimar las diferencias entre los puntos de tiempo circadiano o cepas de calculating de la LORR 50% para cada muestra, que cae dentro de la porción lineal de la curva sigmoide (Ver Figura 2 a continuación). </li><li> Estadísticas alternativos: <ol><li> Si están previstas comparaciones entre los genotipos, es deseable analizar todo el curso de tiempo usando medidas repetidas ANOVAand para determinar el rango de puntos de tiempo que las diferencias son significativas con pruebas post-hoc (Figura 3). Para estas pruebas, se prefiere usar una un valor de 0,001. Esto permite que las diferencias en los tiempos de exposición individuales que deben evaluarse así como las diferencias entre los genotipos en la pendiente de la curva. </li><li> Las diferencias en la sensibilidad para se pueden determinar para tiempos específicos de la exposición al alcohol de una respuesta particular, como la sedación de la porción lineal de la gráfica (Figura 4). </li><li> Las diferencias entre las cepas o los puntos de tiempo circadiano pueden estimarse utilizando estadísticas F estándar y pruebas post-hoc. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Los costos del abuso de alcohol y alcoholismo para la sociedad es enorme, tanto en términos de costos humanos y económicos 29 30,31. Drosophila como modelo ofrece un sistema rápido y versátil de examinar rápidamente las respuestas de comportamiento de un gran número de personas y, como tal, se ha utilizado ampliamente para tanto el alcohol 5,7,32-34 y la investigación circadiano 35-37. Aquí, describimos un protocolo sencillo para la administración co...

Drosophila melanogaster demuestran las respuestas conductuales bifásicos al alcohol 1 que son análogas a las respuestas humanas a este fármaco 2,3. Tras la exposición inicial a bajas concentraciones de alcohol, moscas exhiben mayor actividad locomotriz, sustituida por una falta de coordinación motora, la pérdida del control postural y corregir reflejos (pérdida del reflejo: Lorr) y sedación (falta completa de la actividad motora en respuesta a la estimulación mecánica) como la exposición al alcohol progresa 4-9. El reloj circadiano endógeno es un fuerte modulador de la sensibilidad al alcohol y la toxicidad como se ha observado en ratones, ratas 10,11 12, y los seres humanos 13. Los recientes avances en la investigación de Drosophila han demostrado que el reloj circadiano modula la sensibilidad de alcohol aguda, pero no alcohol tolerancia 1. Los poderosos enfoques genéticos disponibles en Drosophila mutantes a través de estudios y manipulaciones transgénicas de espacialy temporal de la expresión génica proporciona un sistema que permite un rápido avance en la identificación de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a los comportamientos complejos. El uso de Drosophila como herramienta de investigación ha permitido avances sustanciales en la comprensión de la neurobiología del alcohol que se pueden traducir rápidamente a los mamíferos 14-16. Con el fin de facilitar la comprensión de los mecanismos moleculares a través de la que el reloj circadiano modula la sensibilidad al alcohol y para medir de manera uniforme las respuestas de comportamiento a través de puntos de tiempo circadianos, un protocolo de administración de alcohol adecuada para su uso en condiciones de luz roja tenue se requiere. Para Drosophila, el alcohol puede ser administrado a través de la suplementación de alimentos para la exposición crónica o de forma fiable a través de la administración de alcohol en forma de vapor para las exposiciones agudas. Aquí se describe un protocolo de administración de alcohol adecuado para la evaluación de la modulación circadiana de la pérdida de los reflejos de recuperación (Lorr) 1, así comosedación. Las moscas son arrastradas con 12 hr: 12 hr LD ciclos a temperatura constante y luego transferidos a un régimen de luz controlada durante 2-5 días, dependiendo de la pregunta experimental. Las moscas se expusieron a vapor de etanol en un dispositivo conocido como la barra estabilizadora. En este dispositivo, cantidades controladas de aire se burbujeado a través de agua y alcohol; los vapores se mezclan entonces y se dirigen en una carcasa vial de las moscas. Cada 5 minutos, las moscas se califican para el número que no puede mostrar corregir reflejos o se han convertido en sedado. LORR porcentajes para cada punto de tiempo se calculan y se comparan entre puntos de tiempo circadianos o entre cepas de moscas. La simplicidad y la confiabilidad de la entrega de alcohol mediante el suministro de alcohol Flybar combinado con opciones de análisis de comportamiento proporciona un beneficio significativo para los experimentos circadianos realizados en condiciones oscuras.

<table><tbody><tr><td>Alcohol 190 grados</td><td>Varios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aireadores</td><td>Tienda</td><td></td> de mascotas local Utilizamos <td></td></tr><tr><td>tubos de silicona Whisper 60 de 1/8"</td><td>VWR</td><td>408060-0030</td><td></td></tr><tr><td>120&grados; Conector en Y</td><td>VWR</td><td>82017-256</td><td></td></tr><tr><td>Desconexiones rápidas</td><td>VWR</td><td>46600-048</td><td></td></tr><tr><td>Abrazaderas de tubo de plástico Productos</td><td>de última generación</td><td>132250000</td><td>Este o el siguiente</td></tr><tr><td>Regulador de aire en miniatura</td><td>McMaster-Carr</td><td>8727K11</td><td>Este o el anterior</td></tr><tr><td>Soporte de montaje del regulador de aire en miniatura</td><td>McMaster-Carr</td><td>9891K66</td><td></td></tr><tr><td>Caudalímetro Gilmont tamaño 12</td><td>VWR</td><td>29895-242</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas para herramientas</td><td>McMaster-Carr</td><td>1722A43</td><td>Para sujetar caudalímetros</td></tr><tr><td>Vial</td><td>VWR</td><td>89092-722</td><td></td></tr><tr><td>Tapón de goma con dos orificios</td><td>VWR</td><td>59585-186</td><td>Cabe en viales Tubos de</td></tr><tr><td>vidrio Pyrex de 5 mm</td><td>Trikinetics</td><td>PGT5x65</td><td>Se adapta mejor a</td></tr> la <tr><td>cinta de teflón</td> de tapón anterior<td>Ferretería</td><td></td><td>Para lograr un ajuste perfecto, en los tapones si es necesario</td></tr><tr><td>Tapón de goma con dos orificios</td><td>VWR</td><td>59582-122</td><td>Se adapta a nuestras botellas</td></tr><tr><td>Pipetas de vidrio desechables</td><td>VWR</td><td>53283-768</td><td>Cortar a medida y doblar por calentamiento</td></tr><tr><td>Malla de nailon muy fina</td><td>VWR</td><td>Varias</td><td></td></tr><tr><td>bombillas de 15 vatios</td><td>Ferretería</td><td></td><td>Luz</td></tr> <tr><td>roja cenitalFiltros fotográficos</td><td></td><td></td> de luz <td>roja segura Luz roja superior</td></tr><tr><td>Mini linternas con filtros rojos</td><td>Mag-light</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la barra estabilizadora: administración de alcohol para moscas

The FlyBar: Administering Alcohol to Flies

Moscas de la fruta (Drosophila melanogaster) son un modelo establecido para la investigación del alcohol y de la biología circadiana. Recientemente, se demostró que el reloj circadiano modula la sensibilidad al alcohol, pero no la formación de la tolerancia. Aquí se describe el protocolo en detalle. El alcohol se administró a las moscas usando la barra estabilizadora. En esta configuración, el vapor de alcohol saturado que se mezcla con aire humidificado en proporciones fijas, y se administró a las moscas en cuatro tubos de forma simultánea. Las moscas se crían en condiciones estandarizadas con el fin de minimizar la variación entre las repeticiones. Tres días de edad moscas de diferentes genotipos o tratamientos se utilizan para los experimentos, de preferencia, haciendo coincidir las moscas de dos puntos diferentes de tiempo (por ejemplo, CT 5 y CT 17) hacer comparaciones directas posible. Durante el experimento, las moscas están expuestos durante 1 hora con el porcentaje predeterminado de vapor de alcohol y el número de moscas que exhiben la pérdida del reflejo de enderezamiento (Lorr) o sedción se contabilizan cada 5 min. Los datos se pueden analizar usando tres enfoques estadísticos diferentes. La primera consiste en determinar el momento en el que el 50% de las moscas han perdido su reflejo de enderezamiento y utilizar un análisis de la varianza (ANOVA) para determinar si existen diferencias significativas entre los momentos. La segunda es determinar las moscas porcentuales que muestran Lorr después de un número especificado de minutos, seguido de un análisis de ANOVA. El último método es el de analizar la serie entera veces utilizando estadística multivariante. El protocolo también se puede utilizar para experimentos no circadianos o comparaciones entre los genotipos.

Modulación circadiano de alcohol de sensibilidad usando la LORR 50% como marcador. Un ejemplo representativo que muestra la modulación circadiano en la sensibilidad de alcohol durante el día se presenta en la Figura 2. LORR se midió a los seis puntos de tiempo durante el 2 º día de DD en Canton-S y el 50% LORR se determinó para cada punto de tiempo. El análisis mostró un efecto significativo de la hora del día (ANOVA: F 5,45 = 7,39, p &lt;0,001...

Drosophila ha surgido como un sistema modelo significativo para la disección de las bases celulares y moleculares de las respuestas de comportamiento al alcohol. Aquí se presenta un protocolo para la recogida de datos de sensibilidad de alcohol en un contexto circadiano que se puede aplicar fácilmente a otros experimentos y es muy adecuado para la investigación de pregrado.

La barra estabilizadora: Administración de Alcohol para moscas

Fruit flies (Drosophila melanogaster) are an established model for both alcohol research and circadian biology. Recently, we showed that the circadian ...

El objetivo general de este procedimiento es medir los comportamientos inducidos por el alcohol en Drosophila, utilizando un montaje económico y de fácil ensamblaje, adecuado para investigaciones de pregrado o investigadores nuevos en estudios circadianos. Esto se logra primero ensamblando la barra para moscas, lo que permite comparaciones simultáneas de múltiples grupos de moscas.El siguiente paso del procedimiento consiste en cultivar drosófilas bajo ciclos definidos de luz y oscuridad y recolectar moscas de edad equivalente para el experimento. Luego, las moscas se exponen a concentraciones determinadas de vapor de alcohol y se recopilan los datos. En última instancia, la medición de la pérdida del reflejo de deambulación o de la sedación puede mostrar diferencias en la sensibilidad al alcohol entre grupos, ya sea según la hora del día o la genética.La demostración visual de este método es fundamental porque los pasos de observación son difíciles de aprender debido a las dificultades para observar el comportamiento y a la luz roja tenue, así como para determinar qué vuelos han perdido su reflejo de escritura y cuáles no. Primero ensamble la barra para moscas. Comience por armar el flujo de aire.Conecte un tramo corto de tubo de silicona flexible a una toma de aire del edificio o a un aerador de acuario para proporcionar flujo de aire. Divida el flujo de aire con un conector en Y. Conecte la primera rama a un regulador.Controlará la cantidad total de aire que pasa a través del sistema. Conecte la segunda rama a un conector rápido. Esto permitirá interrumpir la corriente de aire según sea necesario sin afectar el flujo de aire calibrado.Agregue un conector en Y y conecte cada tubo ramificado a un regulador de flujo de aire. Luego conecte cada regulador a un medidor de flujo de aire. Ahora corte pipetas de vidrio de un mililitro y doble un ángulo recto en cada sección.Estos funcionarán como tubos rígidos en forma de codo en el montaje. Inserte la pipeta de vidrio recta para la entrada de aire a través de un orificio y extiéndala dentro del fluido hasta un centímetro por encima del fondo. Inserte un tramo en forma de codo de vidrio a través del otro orificio hasta que entre ligeramente en la botella.Utilice estas salidas para unir el flujo de aire de cada botella en un conector en Y. Mediante tubos flexibles, conecte los medidores de flujo de aire a la sección recta de una pipeta. Estos servirán como entradas de aire en las dos botellas de solución.Agua o alcohol, mantenga ambas botellas de solución en un baño de agua ajustado a dos grados superior a la temperatura ambiente. Tape las botellas con tapones de goma que tengan dos orificios con tubos de silicona. Conecte el otro extremo de la Y a una botella con un tapón de goma de dos orificios.La corriente de aire proveniente de este frasco mezclador suministrará alcohol y agua en forma de vapor a los viales de observación. Divida la corriente de aire de salida del frasco mezclador en dos o tres partes para obtener cuatro u ocho corrientes de aire más pequeñas, una para cada vial de observación.Continúe utilizando tubo de silicona. Los viales de observación son viales para moscas vacíos sellados con un tapón de goma de dos orificios, uno de entrada y otro de salida para el vapor de alcohol. Tubos de vidrio encajan en los orificios del tapón.Cubra los extremos del tubo de vidrio con una malla. Sostenga la malla en su lugar utilizando un pequeño trozo de tubo plástico flexible. Inserte este tubo a través del primer orificio hasta que se extienda aproximadamente hasta la mitad de la longitud del frasco.Si es necesario, use cinta de teflón para lograr un ajuste firme. Inserte el segundo tubo de vidrio con la malla hasta que quede al ras con el borde interno del tapón de goma. Mezcle las fracciones apropiadas de las dos corrientes de aire que burbujearon a través de alcohol o agua.Monitoree continuamente la presión del aire y realice ajustes según sea necesario para mantener la mezcla deseada de alcohol y vapor de agua en la botella de mezclado. Para este tipo de experimento, asegúrese siempre de que el cuarto esté adecuadamente ventilado. Para minimizar la variación entre réplicas, es necesario prestar la máxima atención a las condiciones de cría de las moscas.Las moscas deben cultivarse en condiciones de baja densidad con un ciclo de luz muy específico y sincronizado para que se puedan comparar entre sí individuos de la misma edad y cohorte. Acérquese a las moscas al anochecer. Recopile animales recién emergidos y almacénelos durante 24 horas en frascos de mantenimiento con una pequeña cantidad de alimento con alta concentración de agar, al mismo tiempo.Al día siguiente, subdivida las moscas recolectadas en cohortes de aproximadamente 30 moscas utilizando un aspirador y transfiera las cohortes a viales frescos para evaluar la modulación circadiana del comportamiento. Prepare suficientes cohortes para probar cada condición en seis puntos de tiempo equidistantes durante el día de prueba, a fin de evaluar el comportamiento de modulación circadiana. Además, mantenga las moscas en oscuridad constante a 25 grados Celsius durante dos días antes de la prueba.Independientemente del diseño experimental, una hora antes como mínimo del ensayo conductual, traslade las moscas a la sala experimental de comportamiento iluminada únicamente con luz roja tenue. Realice los experimentos bajo luz roja tenue para que la estimulación fotónica no afecte los resultados. Antes del experimento, haga pasar aire a través del sistema durante al menos 10 minutos y calibre los flujos de aire.Bajo los frascos de observación, coloque una hoja de papel blanco para aumentar la visibilidad de las moscas mediante un mayor contraste. Una vez que el flujo de aire se haya estabilizado, desconecte el acoplamiento rápido y cargue un grupo de 30 moscas en cada frasco de observación.En cada ejecución de la barra de moscas, pruebe cada condición experimental. Esto aumentará la robustez del experimento y minimizará el impacto de las variaciones diarias. Una vez que se hayan cargado todos los frascos de observación, vuelva a conectar el flujo de aire y active los temporizadores.Utilice un temporizador para controlar el tiempo total de exposición al alcohol y use el otro para contar intervalos de cinco minutos durante todo el ensayo. Supervise los flujos de aire y realice los ajustes necesarios para que permanezcan constantes. Por lo general, los flujos de aire se estabilizan cada cinco minutos utilizando una lámpara de luz roja.Cuente el número de moscas que han perdido su reflejo de escritura. Mantenga la lámpara a al menos 12 pulgadas de los frascos. Dé un golpe firme al frasco y cuente cuántas moscas no logran escribirse a sí mismas dentro de aproximadamente cuatro segundos.Estas moscas pueden seguir moviendo sus patas y alas, pero no podrán enderezarse por sí mismas. Si la mosca no mueve ninguna extremidad, está completamente sedada. Esto puede calificarse como un criterio distinto a la ausencia del reflejo de retorcimiento.La sesión durará aproximadamente una hora; al finalizar, cuente el número total de moscas en cada muestra utilizando el protocolo descrito. Se midió una modulación circadiana en la sensibilidad al alcohol. Se evaluó la ausencia del reflejo de escritura en seis puntos temporales durante el segundo día de oscuridad en Canton S; la hora del día tuvo un efecto significativo sobre el tiempo.La mitad de las moscas no lograron escribirse a sí mismas. Se midió el porcentaje de moscas de los cantones sedadas tras 40 minutos con vapor de alcohol al 30 % en el día subjetivo CT cinco y en la noche CT 17.Se encontró que significativamente menos moscas fueron sedadas durante el día subjetivo en comparación con la noche. El empleo de una serie temporal ilustró diferencias en el reflejo de escritura y la sedación cuando se compararon moscas Canton s con moscas que portaban la mutación white 1 1 1 8. En el fondo genético Canton S, las moscas white 1 1 1 8 mostraron un mejor reflejo de escritura en respuesta al vapor de etanol que las Canton S. También se encontraron diferencias entre los mutantes white 1 1 1 8 y las moscas de tipo silvestre en la tasa de sedación.La diferencia se debe muy probablemente a los niveles alterados de enemigos biogénicos con la mutación blanca 1 1 1 8. Por lo tanto, es necesario controlar las respuestas conductuales debidas a la mutación blanca 1 1 1 8 presente en muchas líneas transgénicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo administrar alcohol a moscas utilizando el establo de moscas.Es esencial que las moscas se recojan de manera metódica y que las observaciones en la luz roja tenue se estandaricen lo más posible.

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Investigación

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Neurociencia

Una prueba sencilla para medir los efectos sedantes del alcohol...

Una manera sencilla de medir la sensibilidad de etanol en las moscas

Este video describe cómo realizar una inyección de moscas adultas vivas e incluye un protocolo de ejemplo en el que se inyectan partículas marcadas y azul de tripano en el abdomen de las moscas para analizar la fagocitosis.

Inyección de moscas Drosophila adultas: un método de administración de compuestos o etiquetas

Este video muestra la nanoinyección de suspensión bacteriana en la cavidad del cuerpo de la mosca, lo que resulta en la multiplicación e infección bacteriana. La respuesta inmunitaria de la mosca elimina algunas bacterias, mientras que otras escapan a la eliminación inmunitaria y sobreviven dentro del huésped causando una infección.

Infección de moscas con suspensión bacteriana mediante un nanoinyector

Este video muestra una técnica para infectar Drosophila mediante la introducción de una bacteria patógena directamente en su cavidad corporal. Este método evita las barreras epiteliales y otros mecanismos de defensa pasiva, lo que permite la inducción de una infección sistémica. Tras la infección, la respuesta inmunitaria resultante se evalúa mediante el seguimiento de la mortalidad de la mosca y la realización de ensayos posteriores.

Una técnica de punción séptica para introducir una infección bacteriana sistémica en moscas

Los ensayos sencillos para medir la sensibilidad al etanol y la tolerancia rápida en Drosophila facilitan el uso de este organismo modelo para investigar estos importantes comportamientos relacionados con el etanol. Aquí, se describe un ensayo relativamente simple y escalable para medir la sensibilidad al etanol y la tolerancia rápida en moscas.

Un ensayo de conducta Barato, escalable para medir etanol Sedación La sensibilidad y la tolerancia rápida en<em&gt; Drosophila</em

Aquí se describe el uso de varias herramientas caseras para transferir, enfriar y matar drosophilaadulta, así como para limpiar viales de cultivo de vidrio y recoger huevos. Estas herramientas son fáciles de hacer y son bastante eficientes en el manejo de Drosophila.

Herramientas caseras simples para manejar moscas de la fruta—Drosophila melanogaster

Los métodos actuales para medir la sensibilidad al alcohol en Drosophila están diseñados para probar grupos de moscas. Presentamos un ensayo simple, de bajo costo y de alto rendimiento para evaluar la sensibilidad a la sedación del alcohol en un gran número de moscas individuales. El método no requiere herramientas especializadas y se puede realizar en cualquier laboratorio utilizando materiales comunes.

Método de alto rendimiento para medir el tiempo de sedación del alcohol de la Drosophila melanogaster individual

El ensayo Flypub mide los comportamientos que la mosca de la fruta Drosophila melanogaster muestra bajo la influencia del etanol. El ensayo puede ser fácilmente dominado por los experimentadores en todos los niveles y aplicado a varios estímulos vaporizados, facilitando el abuso de sustancias y estudios de adicción.

Flypub para estudiar la desinhibición conductual inducida por etanol y la sensibilización

La mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) es ampliamente utilizada para la investigación biológica y toxicológica. Para ampliar la utilidad de las moscas, desarrollamos un instrumento, el serial anesthesia array, que expone simultáneamente múltiples muestras de moscas a anestésicos generales volátiles (VGA), lo que permite investigar los efectos colaterales (tóxicos y protectores) de los VGA.

La matriz de anestesia en serie para la investigación de alto rendimiento de agentes volátiles utilizando Drosophila melanogaster

Este artículo describe el mantenimiento en laboratorio (incluyendo el apareamiento y la alimentación) de la mosca díptera inferior Bradysia (Sciara) coprophila.

Mantenimiento de laboratorio de la mosca díptera inferior Bradysia (Sciara) coprophila: un nuevo/viejo organismo modelo emergente

Aprende a medir comportamientos inducidos por alcohol en Drosophila usando una barra para moscas accesible. Este protocolo evalúa sensibilidad al etanol y ritmos circadianos en investigación de neurociencia.

La barra estabilizadora: Administración de Alcohol para moscas

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