Name: Mecánica estimulación inducida por calcio Propagación de Ondas en monocapas de células: el ejemplo de las especies bovina células endoteliales corneales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprende a estudiar la propagación de ondas de calcio intercelular en monocapas de células endoteliales corneales bovinas mediante estimulación mecánica y microscopía confocal. Este método permite analizar la comunicación celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El trabajo de investigación realizado en el laboratorio fue apoyado por becas de la Fundación de Investigación - Flandes (FWO, números de concesión G.0545.08 y G.0298.11), el Programa Interuniversitario Polos de atracción (Política Científica de Bélgica, el número de concesión P6/28 y P7/13) y está incrustado en una comunidad de investigación FWO apoyado. CDH es un becario posdoctoral de la Fundación de Investigación - Flandes (FWO). Los autores están muy agradecidos a todos los miembros actuales y anteriores del Laboratorio de Señalización Celular y Molecular (Universidad Católica de Lovaina), Dr. SP Srinivas (Escuela de Optometría de la Universidad de Indiana, EE.UU.), el laboratorio del Dr. Leybaert (Universidad de Gante) y de procedimientos Dr. Vinken (VUB), que proporcionó útil para los debates, optimizado o estuvieron involucrados en el desarrollo de herramientas para el estudio de hemichannels conexina.

1. Aislamiento de células endoteliales de la córnea Antes de empezar: Aislar las células de los ojos frescos, obtenidos de un matadero local, tan pronto como sea posible después de la enucleación del ojo. Asegúrese de que el ojo fue enucleado de una vaca de máximos de 18 meses, cinco minutos después de la autopsia y conservados en solución salina equilibrada de Earle - solución de yodo al 1% a 4 ° C para su transporte al laboratorio. <ol><li> Tome el ojo de solución salina equilibrada de la Earle - solución de yodo al 1% y lo coloca en una placa de Petri (100 x 20 mm). </li><li> Esterilizar el ojo con una solución que contiene etanol al 70% y enjuague con solución salina equilibrada de Earle que contiene 1% de yodo. </li><li> Partir de este paso, trabajar en una campana estéril. Diseccionar cuidadosamente la córnea del ojo y colocarlo en una placa de Petri (35 x 10 mm) que contiene solución salina equilibrada de Earle, con la capa de células epiteliales hacia arriba. Retire con cuidado el sti tejido del iris restantell unido a la córnea, si es necesario. </li><li> Transferencia de la córnea a la Solución salina equilibrada de otra Earle que contiene una placa de Petri con la capa de células endoteliales hacia arriba y enjuague dos veces con solución salina equilibrada de Earle. </li><li> Transferir la córnea con la capa endotelial hacia arriba a un reloj de arena, que es un plato en forma de copa, y se cubre con medio de crecimiento. El medio de cultivo consiste en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco que contiene 25 mM de glucosa, 10% de suero fetal bovino, 6,6% de L-glutamina, 2,5 mg / ml de anfotericina-B y 1% de mezcla de antibiótico-antimicótico que contiene 10.000 unidades / ml de penicilina, 10 000 g / ml de estreptomicina, y 25 mg / ml de anfotericina B. </li><li> Retirar el medio con una pipeta de aspiración. </li><li> Aplicar 300 l de una solución de tripsina (0,5 g / L) a la capa endotelial de la córnea (todos los pasos que incluyen tripsina se realizan utilizando la misma concentración). </li><li> Coloque el reloj de arena que contiene la córnea en un plato de Petri cubierto y lo puso en el incubator durante 30 minutos a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Raspar suavemente las células endoteliales de distancia de la córnea con un pulido al fuego en forma de gancho pipeta Pasteur de vidrio en una campana estéril. </li><li> Aspirar la solución que contiene las células endoteliales y añadirlo a frascos de cultivo (25 cm 2), que contiene 4 ml de medio de cultivo. </li><li> Aplicar 300 l de medio de crecimiento a la córnea y repetir el raspado y añadir la solución que contiene las células endoteliales para el frasco de cultivo. </li><li> Repita este paso final (1,11) una vez más. </li><li> Coloque el matraces de cultivo que contiene las células endoteliales de la córnea en el medio de crecimiento en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Después de dos días, añadir 6 ml de medio de cultivo. </li><li> Actualizar el medio de cultivo cada dos días. </li></ol> 2. Cultivo Celular <ol><li> Retirar el medio de cultivo y se lavan las células dos veces con solución salina equilibrada de Earle, cuando confluencia se alcanza (dentro de About 10 días después del aislamiento). </li><li> Añadir 1,5 solución de tripsina ml a las células para separarlas y colocar el matraz en la incubadora (37 ° C, 5% de CO 2) durante 3 a 4 minutos. </li><li> Añadir 12 ml de medio de crecimiento. Pipetear los medios tres veces dentro y fuera de dispersar las células y contar las células. </li><li> Semillas de las células con una fracción variable dependiendo de la densidad de las células y los puso en la incubadora. Preparar dos diapositivas bien recámara (con un área de 4,2 cm 2) con un recuento de células de células 165 000 (densidad celular 39.286 por cm 2). Preparar 80 cm 2 frascos de cultivo de un nuevo paso a una densidad de 6.250 por cm 2, y añadir medio de cultivo nuevo hasta un volumen total de 25 ml. </li><li> Actualizar el medio cada dos días. </li><li> Confluencia de la capa de células que se alcanza después de 3 a 4 días. Usa las células para los experimentos. </li><li> Cuando confluencia de la capa de células en los matraces se alcanza, repita los pasos 2.1 a 2.6. Los cultivos de células hasta el paso 2 se puede utilizar fo experimentos. </li></ol> 3. La estimulación mecánica para inducir calcio Wave <ol><li> Cargue las células en el portaobjetos de cámara con 10 M Fluo-04 a.m. en buffer fosfato salino durante 30 minutos a 37 ° C mientras se agita suavemente. </li><li> Retire el Fluo-04 a.m. solución, lavar las células cinco veces con buffer fosfato salino, incubar las células con tampón fosfato salino y dejar las células durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente antes de la medición. </li><li> Excite a 488 nm con láser de argón y el uso divisor de haz HFT 488, recoge la emisión de fluorescencia a 530 nm utilizando un paso largo filtro de emisión LP 505, establece el agujero en el mínimo. Utilice un objetivo de 40X aceite de inmersión (Air, 1,2 NA). En experimentos con ARL-67156, utilice un objetivo de 10X (Aire, 0,3 NA). </li><li> Búsqueda de un campo en el que las células son confluentes en el microscopio confocal. </li><li> Posición de la pipeta de manera que está en 45 ° con respecto a la corredera de cámara y tocar la membrana celular.Provocar una breve estimulación mecánica (≈ 1 seg) a una sola celda. La estimulación mecánica consiste en una deformación aguda, de corta duración de la célula tocando brevemente menos de 1% de la membrana celular con una micropipeta de vidrio (diámetro de la punta &lt;1 m) acoplado a un nanopositioner cristal piezoeléctrico, operado a través de un amplificador que es montado en un micromanipulador. Las micropipetas de vidrio están hechos de un extractor de microelectrodo. Asegúrese de que la nanopositioner es operado por una tensión de entre 0,2 y 1,5 V durante la estimulación mecánica. Una tensión superior a 1,5 V puede causar daño celular. Para cada tipo de célula y condiciones, la tensión óptima para la estimulación mecánica y sin daño de la célula debe ser determinada cuidadosamente mediante la aplicación de una serie de tensiones a partir de bajo (0,2 V) a alto voltaje (1,5 V). La tensión es una medida de la fuerza de la estimulación ya que esta tensión determina la tensión mecánica y la tensión que se aplica a la membrana celular. Lala fuerza de la estimulación mecánica se puede calcular multiplicando la tensión mecánica con la zona. Dado que tanto la zona (&lt;3,14 m 2) y el estrés mecánico son muy bajos, la fuerza de la estimulación mecánica es baja. (Tenga en cuenta que cuando una célula se daña, las fugas de fluorescencia fuera de la célula y la célula se vuelve oscuro.) </li><li> Medir los cambios espaciales de la [Ca2 +] i tras la estimulación mecánica con el microscopio confocal. </li><li> Recoger y almacenar imágenes. </li><li> Dibuje una región poligonal de interés para definir el área de la superficie total de las células de respuesta (área activa, AA) usando el software del microscopio confocal. </li></ol>

Los autores tienen nada que revelar.

En este manuscrito, se describe un método simple para medir intercelular Ca 2 + de propagación de la onda en monocapas de células endoteliales corneales bovinas primarias, proporcionando una estimulación mecánica localizada y controlada utilizando una micropipeta. Mecánicamente células estimuladas responden con un aumento local de IP intracelular 3 y Ca 2 +, ambos de los cuales son moléculas de señalización intracelulares esenciales que impulsan intercelular Ca 2 + en la propa...

La comunicación intercelular y la señalización son fundamentales para la coordinación de los procesos fisiológicos en respuesta a los agonistas extracelular en el tejido y 1,2 a nivel de todo el órgano. La forma más directa de comunicación intercelular es creada por la aparición de uniones. Gap cruces son las placas de los canales de salida brecha, que son canales proteicos formados por la cabeza a la cabeza de acoplamiento de dos (Cx) hemichannels conexina de células adyacentes 3,4 (Figura 1). Gap cruces permiten el paso de pequeñas moléculas de señalización con un peso molecular de menos de 1,5 kDa, incluyendo Ca 2 + o IP 3 5, causando y la modulación de Ca 2 +-liberación de los almacenes intracelulares de las células vecinas 6 (Figura 2). Canales de salida brecha están fuertemente regulados por intra e intermolecular interacciones de las proteínas y los procesos de señalización celular, como la modificación redox yfosforilación 7. Gjs facilitar la respuesta coordinada de células conectadas, actuando como un sincitio química y eléctrica. Por ejemplo, la propagación del potencial de acción cardíaco a través de los miocitos auriculares y ventriculares está mediada por canales GJ Cx basados ​​en 85. Cxs no sólo tienen un papel como canales de salida brecha, pero también forman hemichannels no apareados, de esta manera funcionarán como canales en las membranas de manera similar a los canales de iones regulares 8-10 (Figura 1). Hemichannels participan en la señalización paracrina entre las células vecinas mediante el control del intercambio de iones y moléculas de señalización entre el medio ambiente intra-y extracelular. En muchos tipos de células (como las células epiteliales, células osteoblásticas, astrocitos, células endoteliales, etc) y los órganos (como el cerebro, el hígado, la retina, cóclea y el sistema vascular), intercelular Ca 2 + olas son fundamentales para la coordinación de las respuestas multicelulares <sup&gt; 11. Los aumentos en intracelulares de Ca + niveles 2 en una determinada célula no se limitan a esta célula, pero se propagan a las células vecinas que rodean, estableciendo de ese modo un Ca intercelular 2 de la onda + 12,13. Estos intercelular Ca 2 +-ondas son importantes para la regulación fisiológica normal de las capas de células como un sincitio y su desregulación se ha asociado con los procesos fisiopatológicos 11. En el endotelio corneal y el epitelio, los diferentes grupos de 14-24, incluyendo la nuestra 25-33, estudiaron los mecanismos y las funciones de la comunicación intercelular. En células no excitables, como las células endoteliales de la córnea, dos modos distintos de la comunicación intercelular se producen 28,29, a saber brecha ocasiones la comunicación intercelular y la comunicación intercelular paracrina. Brecha ocasiones la comunicación intercelular implica un intercambio directo de moléculas de señalización a través de las uniones comunicantes 7. Gap juncla comunicación intercelular nal es crítico para mantener la homeostasis del tejido, el control de la proliferación celular, y el establecimiento de una respuesta sincronizada al estrés extracelular 10,34,35. En una serie de patologías, acoplamiento brecha de la salida se reduce debido a Cxs defectuosos, y por este medio que afecta brecha ocasiones la comunicación intercelular 36. Esto pone de relieve la importancia y la influencia de la brecha ocasiones la comunicación intercelular en los organismos multicelulares. En contraste con brecha ocasiones la comunicación intercelular, la comunicación intercelular paracrina no depende de la aposición de célula a célula, ya que implica la liberación de mensajeros extracelulares difusibles (Figura 2). Los diferentes tipos de moléculas de señalización se liberan en el espacio extracelular por señalización de células. La molécula se transporta a la célula diana donde se detecta por una proteína receptora específica. Posteriormente, el complejo receptor-señal induce una respuesta celular, que sese termina mediante la retirada de la señal, la inactivación o la desensibilización. Lipofílicas mensajeros de señalización extracelular Lanzamiento penetrar la membrana y actúan sobre los receptores intracelulares. En contraste, mensajeros hidrofílicos no atraviesan la membrana plasmática de la célula responder, sino que actúan como un ligando que se une a las proteínas del receptor expresado en la superficie, que luego se retransmiten la señal para el medio ambiente intracelular. Tres grandes familias de proteínas del receptor de la superficie celular que participen en este proceso: los canales iónicos-ligado, unido a enzima y la proteína G-vinculados. La molécula mensajera liberado puede actuar sobre los receptores de la misma célula (autocrina), sobre las células diana en estrecha proximidad (paracrina), o en las células diana distantes que requieren el sistema circulatorio (endocrina). En muchos tipos de células, incluyendo endotelio corneal 28,29, ATP es uno de los principales factores hidrófilos, paracrinos que impulsan la propagación de intercelular Ca 2 +-ondas 37-40. DurING deformación mecánica, la hipoxia, la inflamación o la estimulación por diversos agentes, el ATP puede ser liberado de las células sanas 41-44 en respuesta a la tensión de corte, estiramiento, o osmótica hinchazón 44,45. Diferentes mecanismos de ATP de liberación se han postulado, incluyendo exocitosis vesicular 44 y una plétora de mecanismos de transporte, tales como transportadores de unión a ATP de cassette (ABC), canales de aniones dependientes de voltaje plasmalemmal 46, P2X7 canales de los receptores de 47,48, así como conexina hemichannels 49-52 y pannexin hemichannels 43,49,53. ATP extracelular puede ser hidroliza rápidamente a ADP, AMP y adenosina 54,55 por ectonucleotidasas que están presentes en el medio ambiente extracelular. El ATP liberado extracelularmente y su metabolito ADP 56 se extenderán a través de la difusión. La posterior interacción de estos nucleótidos con los receptores purinérgicos en las células vecinas se ha implicado en la propagation de intercelular Ca 2 + olas 28,37,51. Dos clases diferentes de receptores purinérgicos están presentes: la adenosina es el principal ligando natural para P1-purinoceptores, mientras tanto purina (ATP, ADP) y la pirimidina (UTP, UDP) nucleótidos actúan en la mayoría de P2-purinoceptores 57. La comunicación intercelular puede ser investigado por diferentes métodos, tales como la carga de raspadura, la transferencia de tintes, uncaging local de los agonistas como IP 3 y Ca 2 +, la estimulación mecánica, etc. A continuación se describe el estudio de Ca 2 de propagación de la onda + provocada por la estimulación mecánica de una sola célula. La ventaja de estudiar Ca 2 de propagación de la onda + por estimulación mecánica es que proporciona una herramienta fácil de cuantificar la propagación de la Ca 2 de la onda + en el tiempo y que permite comparar cuantitativamente diferentes pretratamientos de las células. En el endotelio corneal, estos intercelular Ca 2 + olas permiten una corespuesta coordinada de la monocapa, por este medio que actúa como un posible mecanismo de defensa del endotelio corneal no regenerativa ayudar al endotelio para soportar tensiones extracelulares durante la cirugía intraocular, o tras la exposición a mediadores de la inflamación durante el rechazo inmunológico o uveítis 58,59.

<table><tbody><tr><td>Solución salina equilibrada de Earle (EBSS)Sondas</td> <td>invitrogen-gibco-moleculares (Karlsruhe, Alemania)</td><td>14155-048</td><td></td></tr><tr><td></td><td>yodo Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Alemania)</td><td>38060-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Sondas invitrogen-gibco-moleculares (Karlsruhe, Alemania)</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (Glutamax)</td><td>Sondas Invitrogen-Gibco-Moleculares (Karlsruhe, Alemania)</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina-B</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Alemania)</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla antibiótica-antimicótica</td><td>Sondas Invitrogen-Gibco-Moleculares (Karlsruhe, Alemania)</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sondas Invitrogen-Gibco-Moleculares (Karlsruhe, Alemania)</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DulbeccoSondas PBS</td><td>Invitrogen-Gibco-Molecular (Karlsruhe, Alemania)</td><td>14190-091</td><td></td></tr><tr><td>Sondas Invitrogen-Gibco-Moleculares</td> <td>Fluo-4 AM</td> (Karlsruhe, Alemania)<td>F14217</td><td></td></tr><tr><td>ARL-67156 (6-N,N-dietil-b,g-dibromometileno-D-ATP) </td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Alemania)</td><td>A265</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase VI</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Alemania)</td><td>A6410</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase VII</td><td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Alemania)</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td><td>Síntesis</td><td></td><td></td>de péptidos personalizada</tr><tr><td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td><td>Síntesis</td><td></td><td></td>de péptidos personalizada</tr><tr><td>Péptido de control (SRGGEKNVFIV)</td><td>Síntesis</td><td></td><td></td>de péptidos personalizada</tr><tr><td>siRNA1 Cx43 (sentido: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) </td><td>El siRNA recocido se compró en Eurogentec (Luik, Bélgica)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td><td>El siRNA recocido se compró en Eurogentec (Luik, Bélgica)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>siRNA scramble: secuencia codificada de siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) </td> El <td>siRNA recocido se compró en Eurogentec (Luik, Bélgica)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td><td>Thermo Electron (Ulm, Alemania)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td><td>Thermo Electron (Ulm, Alemania)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio de dos cámaras</td><td>Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Dinamarca)</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal </td><td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Alemania)</td><td>LSM510</td><td></td></tr><tr><td>Piez&#8211; nanoposicionador de cristal eléctrico (Piezo Flexure NanoPositioner)</td><td>PI Polytech (Karlsruhe, Alemania)</td><td>P-280</td><td></td></tr><tr><td>HVPZT-amplificador</td><td>PI Polytech (Karlsruhe, Alemania)</td><td>E463 HVPZT-amplificador</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de vidrio (reemplazo de vidrio de 3,5 nanolitros)</td><td>World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, EE. UU.</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>Micr&#8211; Tirador de lectrode </td><td>Zeitz Instrumente (München, Alemania)</td><td>WZ DMZ-Universal Puller</td><td></td></tr></tbody></table>

mecánica estimulación inducida por calcio propagación de ondas en monocapas de células: el ejemplo de las especies bovina células endoteliales corneales

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

La comunicación intercelular es esencial para la coordinación de procesos fisiológicos entre las células en una variedad de órganos y tejidos, incluyendo el cerebro, el hígado, la retina, cóclea y la vasculatura. En la configuración experimental, intercelular Ca 2 +-ondas puede ser obtenido mediante la aplicación de un estímulo mecánico a una sola celda. Esto conduce a la liberación de las moléculas intracelulares de señalización IP 3 y Ca 2 + que iniciar la propagación de la Ca 2 de la onda + concéntricamente desde la célula estimulada mecánicamente a las células vecinas. Las principales vías moleculares que controlan intercelular Ca 2 de propagación de la onda + son proporcionados por los canales de salida brecha a través de la transferencia directa de IP 3 y hemichannels a través de la liberación de ATP. Identificación y caracterización de las propiedades y la regulación de diferentes conexina y isoformas pannexin como canales y hemichannels brecha de la salida son permitidas por el quantification de la propagación de la intercelular Ca 2 de la onda +, ARNsi, y el uso de inhibidores de canales y hemichannels brecha de la salida. Aquí, se describe un método para medir intercelular Ca 2 de la onda + en monocapas de células endoteliales corneales primarias cargado con Fluo4-AM en respuesta a un estímulo mecánico controlado y localizado provocado por una deformación aguda, de corta duración de la célula como resultado de tocar la membrana celular con una micropipeta de vidrio micromanipulador-controlado con un diámetro de la punta de menos de 1 m. También describe el aislamiento de células endoteliales corneales bovinas primarias y su uso como sistema modelo para evaluar la actividad Cx43-hemicanal como la fuerza impulsada por intercelular Ca 2 +-ondas a través de la liberación de ATP. Finalmente, se discute el uso, ventajas, limitaciones y alternativas de este método en el contexto del canal brecha de la salida y la investigación hemicanal.

Todos los experimentos se realizan en cumplimiento de todas las directrices, reglamentos y las agencias reguladoras y el protocolo que se está demostrado se lleva a cabo bajo la dirección y aprobación del cuidado de los animales y el empleo de la Universidad Católica de Lovaina. En las células endoteliales corneales bovinas (BCEC), uniones funcionales se expresan y ambos brecha ocasiones la comunicación intercelular y la comunicación intercelular paracrina contribuyen de manera significativa...

Intercelular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las ondas son conducidas por canales y hemichannels brecha de la salida. Aquí se describe un método para medir intercelular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Ondas en monocapas de células en respuesta a un estímulo mecánico de una sola célula local y su aplicación para investigar las propiedades y la regulación de los canales y hemichannels brecha de la salida.

Mecánica estimulación inducida por calcio Propagación de Ondas en monocapas de células: el ejemplo de las especies bovina células endoteliales corneales

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar la comunicación intercelular mediante canales de uniones comunicantes y canales HEMI mediante la cuantificación de la propagación de la onda intercelular de calcio inducida por estimulación mecánica en monocapas de células endoteliales corneales primarias. Esto se logra primero aislando las células endoteliales corneales primarias de ojos bovinos frescos. Como segundo paso, dos o tres días después de sembrarlas en cámaras portaobjeto, la monocapa confluyente de células se carga con el colorante sensible al calcio fluorescente flu O 4:00 AM. A continuación, aplicamos un estímulo mecánico controlado y localizado a una sola célula de la monocapa para inducir una onda intercelular de calcio, que se visualiza en el microscopio confocal.Los resultados muestran la propagación de la onda de calcio intercelular. Finalmente, la inhibición de los canales de uniones comunicantes y de los canales HEMI se utiliza para desentrañar las propiedades y la regulación de las diferentes isoformas de conexinas y pannexinas que forman los canales de uniones comunicantes y los canales HEMI. La principal ventaja de la propagación de la onda de calcio intercelular inducida por estimulación mecánica es que proporciona un método sencillo y confiable para examinar la contribución y las propiedades de los canales de conexión y paso en forma no invasiva.Además, el método se basa en las moléculas y cascadas de señalización fisiológicas presentes en los sistemas celulares estudiados. Por último, es fácilmente adaptable a una variedad de sistemas celulares, incluyendo células primarias y modelos celulares que expresan ectópicamente ciertas isoformas de conexina o PanIN. Este método puede proporcionar información sobre la función y la regulación dinámica de los canales de uniones en copa formados por conexinas y PanIN, así como de los canales HEMI, mediante el uso de ARN de interferencia (siRNA) para la inhibición de conexinas o isoformas de PanIN endógenas y mediante el uso de inhibidores selectivos de los canales de uniones en copa y canales HEMI.Este sistema definitivamente no se limita a ambas células endoteliales corneales. Es adaptable a prácticamente cualquier tipo celular y también a tejidos más complejos. Este procedimiento utiliza un ojo recién enucleado de una vaca no mayor de 18 meses y no más de cinco minutos post mortem.Se transportó al laboratorio en solución salina balanceada de Earl y solución de yodo al 1% a cuatro grados Celsius. Primero, transfiera el ojo a una placa de Petri de 100 milímetros por 20 milímetros. A continuación, enjuague el ojo con EBSS que contenga yodo al 1%.Luego, esterilícelo con una solución que contenga etanol al 70% a partir de este momento. Trabaje en una cabina estéril. Diseque cuidadosamente la córnea del ojo y colóquela en una placa de Petri de 35 milímetros por 10 milímetros que contenga EBSS, con la capa de células epiteliales orientada hacia arriba.Retire cuidadosamente cualquier tejido de iris residual aún adherido a la córnea. Si es necesario, transfiera la córnea a otro recipiente con EBSS con la capa de células endoteliales hacia arriba y luego enjuague dos veces con EBSS. A continuación, coloque la córnea con la capa endotelial hacia arriba en un vaso de reloj y cúbrala con medio de crecimiento.Para enjuagar, retire el medio con una pipeta de succión. Aplique 300 microlitros de solución de tripsina a 0,5 gramos por litro sobre la capa endotelial de la córnea. Coloque la ampolla de reloj con la córnea en una placa de Petri tapada y transfiera al incubador durante 30 minutos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.Después de recuperar el reloj de arena, raspe suavemente las células endoteliales de la córnea con una pipeta de vidrio en forma de gancho pulido con fuego. Aspire la solución que contiene las células endoteliales y añádala a un frasco de cultivo de 25 centímetros cuadrados que contenga cuatro mililitros de medio de cultivo. A continuación, aplique 300 microlitros de medio de crecimiento a la córnea.Repita la raspado y agregue la solución que contiene las células endoteliales al frasco de cultivo. Repita este paso una vez más, luego coloque los frascos de cultivo que contienen las células endoteliales corneales en el medio de crecimiento en el incubador a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Dos días después, agregue seis mililitros de medio de cultivo y renueve el medio de crecimiento cada segundo día.Las células deben alcanzar confluencia entre siete y 10 días después del aislamiento hasta el paso. Primero, aspire el medio de cultivo y luego enjuague dos veces con EBSS. A continuación, agregue dos mililitros de tripsina en solución a las células y coloque el frasco en el incubador durante tres a cuatro minutos.Luego, agregue 12 mililitros de medio de crecimiento y pipetee el medio tres veces hacia adentro y hacia afuera para dispersar las células. A continuación, cuente las células utilizando un hemocitómetro o un contador automático de células. Agregue 165.000 células a las laminillas de cultivo de dos pocillos.A continuación, prepare matraces de cultivo cuadrados de 75 centímetros cuadrados para un nuevo pase a una densidad de 6.250 células por centímetro cuadrado y agregue medio de cultivo fresco hasta un volumen total de 25 mililitros; coloque los matraces y las láminas de cámara en el incubador. El medio se renueva cada dos días y se debe alcanzar la cofluencia de la capa celular en tres a cuatro días. En primer lugar, cargue las células en la lámina de cámara con 10 micromolar de fluo-4 AM en solución salina tamponada con fosfato durante 30 minutos a 37 grados Celsius con agitación suave mientras las células se incuban en fluo-4 AM. Acople una micropipeta de vidrio con un diámetro de punta inferior a un micrómetro a un nano posicionador piezoeléctrico y conéctelo a un amplificador montado en un micromanipulador.Establezca el voltaje del nano posicionador entre 0,2 y 1,5 voltios. Retire la solución de 4:00 AM. Luego, lave las células cinco veces con solución salina tamponada con fosfato y, a continuación, incube las células con PBS durante al menos cinco minutos a temperatura ambiente antes de la medición.Excite con 488 nanómetros usando un láser de argón y utilice el divisor de haz HFT 48. Recolecte la emisión fluorescente a 530 nanómetros utilizando un filtro de emisión de paso largo, LP 5 0 5, con el diafragma de altura ajustado al mínimo; aquí se utiliza un objetivo de inmersión en aceite de 40 x. Coloque la cámara portaobjeto sobre la platina de un microscopio confocal y localice un área con células confluentes.A continuación, mueva el micromanipulador para colocar la micropipeta de vidrio de manera que toque la membrana celular formando un ángulo de 45 grados. Opere el micromanipulador para tocar brevemente menos del 1% de la membrana de la célula individual con la micropipeta de vidrio y provoque una estimulación mecánica de un segundo a la célula. Luego, mida los cambios espaciales en la concentración de iones calcio tras la estimulación mecánica, utilizando un microscopio confocal para adquirir y almacenar las imágenes.Finalmente, dibuje una región de interés poligonal para definir el área superficial total de las células responsivas utilizando el software del microscopio confocal. Los transitorios de calcio inducidos por estimulación mecánica se muestran en diferentes puntos temporales en condiciones de control en células endoteliales corneales bovinas mediante imágenes representativas de fluorescencia con pseudocolores; las intensidades de fluorescencia antes de la estimulación se muestran en la primera imagen. La flecha blanca en la segunda imagen identifica la célula estimulada mecánicamente.La onda de calcio se propaga a seis capas celulares vecinas con un área total de células alcanzadas por la onda, dando un área activa de 62.870 micrómetros cuadrados. El gráfico de líneas muestra el curso temporal del valor de fluorescencia normalizado o FN en la célula mecánicamente estimulada etiquetada como ms, y el valor promedio de FN en las capas celulares vecinas uno a cinco etiquetadas en el gráfico como MB uno a MB cinco. Estas imágenes muestran cambios significativos en la propagación de las ondas de calcio intercelulares tras el tratamiento con nucleótidos exógenos en el gráfico de la izquierda y tras el tratamiento con inhibidores de la ectonucleotidasa en el gráfico de la derecha. En mayor detalle, el gráfico de la izquierda muestra una disminución significativa del área activa tras el tratamiento de células endoteliales corneales bovinas con la Arasaasa exógena seis y siete, que hidrolizan el ATP y el ADP, inhibiendo así la vía de comunicación intercelular paracrina.El asterisco indica un valor P menor de 0,001 en presencia frente a ausencia de ace. El gráfico de la derecha muestra un aumento significativo en el área activa tras el tratamiento de BCEC con un inhibidor selectivo de ectonucleótidos, A RL 6 7 1 56, potenciando así la vía de comunicación intercelular pericrina. El asterisco indica un valor P menor de 0,001 en presencia frente a ausencia de a RL Una vez dominado.Esta técnica puede realizarse en cinco a 10 minutos para un experimento en una condición cuando se lleva a cabo correctamente. Realizar una serie completa de experimentos a partir de los cuales se puedan comparar diferentes condiciones lleva un día para obtener conclusiones estadísticas. Deben utilizarse experimentos independientes realizados en días diferentes y a partir de diferentes lotes de células aisladas.La medición y cuantificación de la propagación de ondas de calcio intracelulares permite la identificación y caracterización de la regulación biológica celular de diferentes conexinas e isoformas como canales de uniones tipo gap y canales HEMI. También me gustaría destacar que este método no se sostiene por sí solo, sino que debe complementarse con otros enfoques moleculares y funcionales que van desde la transferencia de marcadores hasta la liberación de ATP y la electrofisiología.

mechanical-stimulation-induced-calcium-wave-propagation-cell

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este artículo describe la técnica utilizada para realizar el mapeo óptico de doble canal en monocapas de células auriculares HL-1 cultivadas. Este protocolo único permite la visualización simultánea de la actividad del calcio (Ca) y el voltaje (Vm) en la misma área para la detección y el análisis detallados de las propiedades electrofisiológicas de las monocapas de cultivo.

Tensión y calcio Dual Channel Mapping óptico de Cultivadas HL-1 auricular miocitos monocapa

El uso de contraste de interferencia diferencial (DIC) de microscopía de alta resolución, una observación ex vivo de la paliza de los cilios ependymal móviles ubicada dentro de los ventrículos cerebrales de ratones se demostró por imágenes en vivo. La técnica permite una grabación de la frecuencia de latido ciliar único y ángulo superando así como sus propiedades de estimulación de oscilación de calcio intracelular.

Imágenes en vivo de la ependimarios cilios en los ventrículos laterales del cerebro del ratón

Canales mechanosensitive bacterianas se pueden utilizar como transductores mechanoelectrical en dispositivos biomoleculares. Bicapas Gotita de interfaz (DIB), bloques de construcción de células de inspiración a este tipo de dispositivos, representan nuevas plataformas para incorporar y estimular canales mechanosensitive. Aquí, demostramos un nuevo método basado en la micropipeta de formar DIB, lo que permite el estudio de los canales mechanosensitive bajo estimulación mecánica.

Multifuncional, Micropipeta basada en el Método de Incorporación y la estimulación de Canales bacteriana mechanosensitive Ion en Gotita de interfaz Bilayers

Un cultivo primario de células endoteliales corneales bovinas se utilizó para investigar el mecanismo de la transición endotelial-mesenquimal corneal. Además, se utilizó un modelo de endotelio corneal criolesión rata para demostrar transición endotelial-mesenquimal corneal in vivo.

En vitro y en modelos in vivo para estudiar la transición del endotelio corneal-mesenquimal

Demostrado aquí son protocolos para el aislamiento (1) recién endoteliales cerebrales intactos "tubos" y mediciones (2) simultáneas de calcio endotelial y la membrana potencial durante la hiperpolarización derivados del endotelio. Además, estos métodos permiten ajuste farmacológico de calcio de la célula endotelial y señalización eléctrica como variables experimentales individuales o interactivas.

Medidas simultáneas de calcio intracelular y el potencial de membrana en el endotelio Cerebral de ratón recién aislado e intacto

Aquí, presentamos un protocolo para separar las células endoteliales corneales (CEC) de la membrana de Descemet (DM) utilizando un láser neodimio:YAG (Nd:YAG) como modelo de enfermedad ex vivo para la queratopatía bullosa (BK).

Desarrollo de un Modelo Experimental No Invasivo, Asistido por Láser de Pérdida Celular Endotelial Corneal

Este protocolo describe los pasos críticos necesarios para establecer y cultivar cultivos celulares endoteliales corneales a partir de explantas de tejido humano o ovino. También se presenta un método para subculturizar células endoteliales corneales en biomateriales membranosas.

Crecimiento de capas celulares endoteliales corneales humanas y ovinas en membranas biomateriales

Este protocolo describe el uso de nanohilos de silicio para la biomodulación óptica intracelular de la célula en un método simple y fácil de realizar. La técnica es altamente adaptable a diversos tipos de células y se puede utilizar para aplicaciones in vitro e in vivo.

Nanohilos de silicio y estimulación óptica para investigaciones de acoplamiento eléctrico intra e intercelular

Las prótesis de retina tienen la capacidad de generar percepciones visuales. Para avanzar en el desarrollo de nuevas prótesis, se necesitan métodos ex vivo para probar los dispositivos antes de su implantación. Este artículo proporciona un protocolo completo para estudiar la actividad del calcio en la capa de células ganglionares de la retina cuando se somete a estimulación eléctrica.

Imágenes de calcio en retinas planas estimuladas eléctricamente

Este artículo presenta un método para el monitoreo cuantitativo en tiempo real de las concentraciones de iones de calcio (Ca2+) en células utilizando imágenes de Ca2+ de una sola célula con el colorante Fura-2 / AM. Esta técnica permite una carga eficiente de colorante y un cálculo preciso de los niveles de Ca2+ a través de las relaciones de intensidad de fluorescencia, lo que la convierte en un enfoque simple y rápido para aplicaciones de investigación.

Imágenes de calcio unicelular para estudiar la activación de los canales iónicos de calcio

El uso de la luz para controlar las células y los tejidos cardíacos permite la estimulación sin contacto, preservando así el estado natural y la función de las células, lo que lo convierte en un enfoque valioso tanto para la investigación básica como para las aplicaciones terapéuticas.

Un sistema microfisiológico cardíaco para estudiar la propagación de Ca2+ a través de la estimulación óptica no genética

Aprende a estudiar la propagación de ondas de calcio intercelular en monocapas de células endoteliales corneales bovinas mediante estimulación mecánica y microscopía confocal. Este método permite analizar la comunicación celular.

Mecánica estimulación inducida por calcio Propagación de Ondas en monocapas de células: el ejemplo de las especies bovina células endoteliales corneales (Video) | JoVE Journal

Mecánica estimulación inducida por calcio Propagación de Ondas en monocapas de células: el ejemplo de las especies bovina células endoteliales corneales

Explorar más videos