Mecánica estimulación inducida por calcio Propagación de Ondas en monocapas de células: el ejemplo de las especies bovina células endoteliales corneales

El objetivo general del siguiente experimento es estudiar la comunicación intercelular mediante canales de uniones comunicantes y canales HEMI mediante la cuantificación de la propagación de la onda intercelular de calcio inducida por estimulación mecánica en monocapas de células endoteliales corneales primarias. Esto se logra primero aislando las células endoteliales corneales primarias de ojos bovinos frescos. Como segundo paso, dos o tres días después de sembrarlas en cámaras portaobjeto, la monocapa confluyente de células se carga con el colorante sensible al calcio fluorescente flu O 4:00 AM. A continuación, aplicamos un estímulo mecánico controlado y localizado a una sola célula de la monocapa para inducir una onda intercelular de calcio, que se visualiza en el microscopio confocal.

Los resultados muestran la propagación de la onda de calcio intercelular. Finalmente, la inhibición de los canales de uniones comunicantes y de los canales HEMI se utiliza para desentrañar las propiedades y la regulación de las diferentes isoformas de conexinas y pannexinas que forman los canales de uniones comunicantes y los canales HEMI. La principal ventaja de la propagación de la onda de calcio intercelular inducida por estimulación mecánica es que proporciona un método sencillo y confiable para examinar la contribución y las propiedades de los canales de conexión y paso en forma no invasiva.

Además, el método se basa en las moléculas y cascadas de señalización fisiológicas presentes en los sistemas celulares estudiados. Por último, es fácilmente adaptable a una variedad de sistemas celulares, incluyendo células primarias y modelos celulares que expresan ectópicamente ciertas isoformas de conexina o PanIN. Este método puede proporcionar información sobre la función y la regulación dinámica de los canales de uniones en copa formados por conexinas y PanIN, así como de los canales HEMI, mediante el uso de ARN de interferencia (siRNA) para la inhibición de conexinas o isoformas de PanIN endógenas y mediante el uso de inhibidores selectivos de los canales de uniones en copa y canales HEMI.

Este sistema definitivamente no se limita a ambas células endoteliales corneales. Es adaptable a prácticamente cualquier tipo celular y también a tejidos más complejos. Este procedimiento utiliza un ojo recién enucleado de una vaca no mayor de 18 meses y no más de cinco minutos post mortem.

Se transportó al laboratorio en solución salina balanceada de Earl y solución de yodo al 1% a cuatro grados Celsius. Primero, transfiera el ojo a una placa de Petri de 100 milímetros por 20 milímetros. A continuación, enjuague el ojo con EBSS que contenga yodo al 1%.

Luego, esterilícelo con una solución que contenga etanol al 70% a partir de este momento. Trabaje en una cabina estéril. Diseque cuidadosamente la córnea del ojo y colóquela en una placa de Petri de 35 milímetros por 10 milímetros que contenga EBSS, con la capa de células epiteliales orientada hacia arriba.

Retire cuidadosamente cualquier tejido de iris residual aún adherido a la córnea. Si es necesario, transfiera la córnea a otro recipiente con EBSS con la capa de células endoteliales hacia arriba y luego enjuague dos veces con EBSS. A continuación, coloque la córnea con la capa endotelial hacia arriba en un vaso de reloj y cúbrala con medio de crecimiento.

Para enjuagar, retire el medio con una pipeta de succión. Aplique 300 microlitros de solución de tripsina a 0,5 gramos por litro sobre la capa endotelial de la córnea. Coloque la ampolla de reloj con la córnea en una placa de Petri tapada y transfiera al incubador durante 30 minutos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Después de recuperar el reloj de arena, raspe suavemente las células endoteliales de la córnea con una pipeta de vidrio en forma de gancho pulido con fuego. Aspire la solución que contiene las células endoteliales y añádala a un frasco de cultivo de 25 centímetros cuadrados que contenga cuatro mililitros de medio de cultivo. A continuación, aplique 300 microlitros de medio de crecimiento a la córnea.

Repita la raspado y agregue la solución que contiene las células endoteliales al frasco de cultivo. Repita este paso una vez más, luego coloque los frascos de cultivo que contienen las células endoteliales corneales en el medio de crecimiento en el incubador a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Dos días después, agregue seis mililitros de medio de cultivo y renueve el medio de crecimiento cada segundo día.

Las células deben alcanzar confluencia entre siete y 10 días después del aislamiento hasta el paso. Primero, aspire el medio de cultivo y luego enjuague dos veces con EBSS. A continuación, agregue dos mililitros de tripsina en solución a las células y coloque el frasco en el incubador durante tres a cuatro minutos.

Luego, agregue 12 mililitros de medio de crecimiento y pipetee el medio tres veces hacia adentro y hacia afuera para dispersar las células. A continuación, cuente las células utilizando un hemocitómetro o un contador automático de células. Agregue 165.000 células a las laminillas de cultivo de dos pocillos.

A continuación, prepare matraces de cultivo cuadrados de 75 centímetros cuadrados para un nuevo pase a una densidad de 6.250 células por centímetro cuadrado y agregue medio de cultivo fresco hasta un volumen total de 25 mililitros; coloque los matraces y las láminas de cámara en el incubador. El medio se renueva cada dos días y se debe alcanzar la cofluencia de la capa celular en tres a cuatro días. En primer lugar, cargue las células en la lámina de cámara con 10 micromolar de fluo-4 AM en solución salina tamponada con fosfato durante 30 minutos a 37 grados Celsius con agitación suave mientras las células se incuban en fluo-4 AM. Acople una micropipeta de vidrio con un diámetro de punta inferior a un micrómetro a un nano posicionador piezoeléctrico y conéctelo a un amplificador montado en un micromanipulador.

Establezca el voltaje del nano posicionador entre 0,2 y 1,5 voltios. Retire la solución de 4:00 AM. Luego, lave las células cinco veces con solución salina tamponada con fosfato y, a continuación, incube las células con PBS durante al menos cinco minutos a temperatura ambiente antes de la medición.

Excite con 488 nanómetros usando un láser de argón y utilice el divisor de haz HFT 48. Recolecte la emisión fluorescente a 530 nanómetros utilizando un filtro de emisión de paso largo, LP 5 0 5, con el diafragma de altura ajustado al mínimo; aquí se utiliza un objetivo de inmersión en aceite de 40 x. Coloque la cámara portaobjeto sobre la platina de un microscopio confocal y localice un área con células confluentes.

A continuación, mueva el micromanipulador para colocar la micropipeta de vidrio de manera que toque la membrana celular formando un ángulo de 45 grados. Opere el micromanipulador para tocar brevemente menos del 1% de la membrana de la célula individual con la micropipeta de vidrio y provoque una estimulación mecánica de un segundo a la célula. Luego, mida los cambios espaciales en la concentración de iones calcio tras la estimulación mecánica, utilizando un microscopio confocal para adquirir y almacenar las imágenes.

Finalmente, dibuje una región de interés poligonal para definir el área superficial total de las células responsivas utilizando el software del microscopio confocal. Los transitorios de calcio inducidos por estimulación mecánica se muestran en diferentes puntos temporales en condiciones de control en células endoteliales corneales bovinas mediante imágenes representativas de fluorescencia con pseudocolores; las intensidades de fluorescencia antes de la estimulación se muestran en la primera imagen. La flecha blanca en la segunda imagen identifica la célula estimulada mecánicamente.

La onda de calcio se propaga a seis capas celulares vecinas con un área total de células alcanzadas por la onda, dando un área activa de 62.870 micrómetros cuadrados. El gráfico de líneas muestra el curso temporal del valor de fluorescencia normalizado o FN en la célula mecánicamente estimulada etiquetada como ms, y el valor promedio de FN en las capas celulares vecinas uno a cinco etiquetadas en el gráfico como MB uno a MB cinco. Estas imágenes muestran cambios significativos en la propagación de las ondas de calcio intercelulares tras el tratamiento con nucleótidos exógenos en el gráfico de la izquierda y tras el tratamiento con inhibidores de la ectonucleotidasa en el gráfico de la derecha. En mayor detalle, el gráfico de la izquierda muestra una disminución significativa del área activa tras el tratamiento de células endoteliales corneales bovinas con la Arasaasa exógena seis y siete, que hidrolizan el ATP y el ADP, inhibiendo así la vía de comunicación intercelular paracrina.

El asterisco indica un valor P menor de 0,001 en presencia frente a ausencia de ace. El gráfico de la derecha muestra un aumento significativo en el área activa tras el tratamiento de BCEC con un inhibidor selectivo de ectonucleótidos, A RL 6 7 1 56, potenciando así la vía de comunicación intercelular pericrina. El asterisco indica un valor P menor de 0,001 en presencia frente a ausencia de a RL Una vez dominado.

Esta técnica puede realizarse en cinco a 10 minutos para un experimento en una condición cuando se lleva a cabo correctamente. Realizar una serie completa de experimentos a partir de los cuales se puedan comparar diferentes condiciones lleva un día para obtener conclusiones estadísticas. Deben utilizarse experimentos independientes realizados en días diferentes y a partir de diferentes lotes de células aisladas.

La medición y cuantificación de la propagación de ondas de calcio intracelulares permite la identificación y caracterización de la regulación biológica celular de diferentes conexinas e isoformas como canales de uniones tipo gap y canales HEMI. También me gustaría destacar que este método no se sostiene por sí solo, sino que debe complementarse con otros enfoques moleculares y funcionales que van desde la transferencia de marcadores hasta la liberación de ATP y la electrofisiología.