Name: Trasplante en la cámara anterior del ojo para Longitudinal, no invasiva En vivo Imagen con una sola célula de resolución en tiempo real (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Aprende el trasplante de islotes pancreáticos en la cámara anterior del ojo de ratón para imagen longitudinal no invasiva. Este método permite monitorear la viabilidad y engraftamiento celular con resolución de célula única.

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Reconocemos los Dres. Camillo Ricordi, Pileggi Antonello, R. Damaris Molano, Speier Esteban y Daniel Nyqvist para un debate fructífero. También damos las gracias Eleut Diego Hernández y Espinosa-Heidmann de asistencia técnica, y Mike Valdes y Formoso Margaret ayuda con grabación de video. Byron Maldonado grabado, editado y producido el vídeo final. Apoyo a la investigación fue proporcionada por el Instituto de Investigación de Diabetes Foundation ( <a href="http://www.DiabetesResearch.org" target="_blank">www.DiabetesResearch.org</a> ), el NIH / NIDDK / NIAID (F32DK083226 a MHA, NIH RO3DK075487 a AC; U01DK089538 a PO.B.). Apoyo a la investigación adicional para PO.B se proporciona a través de los fondos del Instituto Karolinska, el sueco Consejo de Investigación, la Fundación para la Diabetes sueca, la Fundación de la Familia Erling Persson-, la Familia Knut y Alice Wallenberg Foundation, el Skandia Insurance Company Ltd., vibrante ( FP7-228933-2), Programa Estratégico de Investigación en Diabetes en el Karolinska Inst.itutet, la Fundación Novo Nordisk, y la Fundación de amarre von Kantzow.

El siguiente procedimiento se realiza bajo el estereoscopio en 2 pasos, el primer paso consiste en cargar los islotes en la cánula y el segundo paso es el trasplante real en la ACE. Todos los procedimientos realizados con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Miami. 1. Islotes de carga en Cánula para trasplante <ol><li> Centro de los islotes en placa de cultivo al girar el plato en los círculos de estrechamiento. </li><li> Desconectar la cánula de la &quot;reserva&quot; y colocar la cánula y el tubo de conexión sobre una superficie limpia. El depósito puede ser hecho de una punta desechable 300 l pipeta de plástico sin filtro (Figura 1a). </li><li> Lavar las burbujas de aire fuera del depósito para asegurar flujo continuo de islotes cuando aspiración en el depósito. Enjuagar el depósito se hace por impulsar el manos libres motorizado jeringa controlador utilizando el pedal(Figura 1b, c). Esto también hará que el espacio en la jeringa para permitir la aspiración de los islotes en el depósito (pre-cargado con una solución estéril, tal como medios de solución salina, PBS o cultivo). </li><li> Aspirar suavemente cantidad deseada de islotes en el depósito. Islotes tenderá a girar al entrar en el depósito y se mantendrá juntos hacia la parte inferior. La aspiración se realiza por conducción hacia atrás la jeringa motorizada-conductor utilizando el pedal de pie. </li><li> Vuelva a conectar la cánula al depósito a través de la tubería de conexión. </li><li> Colocar la punta de la cánula de nuevo en la placa de cultivo y lavar los islotes fuera del depósito en el tubo a continuación, en la cánula. Asegúrese de que los islotes permanecer juntos como hace una copia de llenar el tubo / cánula con cuidado &quot;parpadeo&quot; (pulsar) del tubo (Figura 1d). Detener ya sea antes o después de que todas las burbujas de aire por delante de los islotes son expulsadas de la cánula. Si no está seguro, deje de islotes como entrar en la parte posterior de la cánula como el aire restanteburbujas antes de islotes puede ayudar a prevenir el reflujo (regurgitación) de los islotes de la ACE. Se disipará durante la noche. </li><li> En este punto, usted está listo para inyectar los islotes en el ACE (por favor, consulte los pasos siguientes). </li></ol> 2. El trasplante de islotes en la cámara anterior del ojo <ol><li> Coloque el ratón anestesiado sobre una almohadilla caliente bajo estereoscopio. </li><li> Coloque el hocico del ratón en anestesia &quot;máscara&quot; conectado a oxígeno / máquina de anestesia con isoflurano. La máscara está hecha de un plástico desechable de 1 ml punta de la pipeta (sin filtro) y conectado a un tubo de anestesia a través del extremo estrecho (figura 2a, b). </li><li> Retraer suavemente los párpados del ojo para ser trasplantados con el dedo índice y el pulgar de la mano libre y el &quot;pop&quot; el ojo para una mejor exposición y de fácil acceso (Figura 2c). Esto requerirá un poco de práctica para perfeccionar sin impedir la respiración del ratón por la presión excesiva en elcuello o bloqueando el flujo de sangre a la cabeza. </li><li> Usando una jeringuilla de insulina desechable (29 - 31 g) como bisturí, cuidadosamente penetrar sólo la punta en la córnea y hacer una incisión lateral única. Hacer la incisión en el punto medio entre el vértice de la córnea y el limbo para minimizar el reflujo de los islotes durante la inyección de la ACE (Figura 2d). </li><li> Cuidadosamente inserte la cánula (precargado con islotes) a través de la incisión. </li><li> Lentamente expulsar islotes fuera de la cánula y los depositan en la parte superior del iris. Para evitar el reflujo islote debido a la acumulación de presión excesiva en la ACE, expulsar los islotes en impulsos breves en tan pequeño volumen (s) como sea posible en el cuadrante opuesto a la incisión. Esto puede ser aún más asegurada mediante la compactación de islotes en el tubo durante la carga de la cánula (por favor, véase el paso 1,6). </li><li> Poco a poco retraer la cánula de la ACE. Este es un paso crítico, especialmente, si un gran volumen de islotes se inyectó como reflujo islote debido a la presenciaque se acumulan dentro de la ACE puede ser inevitable. Para eliminar / minimizar el reflujo islote, gire suavemente la cánula mientras que dentro de la ACE para liberar el exceso de presión a través de la incisión alrededor de la cánula. Busque signos de reflujo en tu intento de retirar la cánula y, si es necesario, espere hasta que desaparezca la presión antes de retraer completamente la cánula de la ACE. </li><li> Enjuagar el ojo trasplantado con PBS estéril o solución salina. </li><li> Inyectar buprenorfina para la analgesia postoperatoria (0.05 a 0.1 mg / kg, por vía subcutánea) para el primero 48 hr. </li><li> Aplique un ungüento antibiótico eritromicina oftálmica al ojo trasplantado inmediatamente después del trasplante. </li><li> Coloque de nuevo el animal en una jaula caliente para permitir la recuperación de la anestesia. </li></ol>

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</ol>

PO.B. Es uno de los fundadores de la empresa de biotecnología BioCrine, que se va a utilizar la cámara anterior del ojo como una plataforma de servicio comercial. AC se encuentra en la patente que protege esta tecnología.

Islotes pancreáticos de murino fueron aisladas utilizando digestión con colagenasa seguido por purificación en gradientes de densidad, como se ha descrito previamente 33. Islotes aislados se cultivaron durante la noche antes del trasplante. Si bien esto puede no ser necesario, se recomienda para permitir que los islotes de recuperarse del procedimiento de aislamiento. Esto es crítico cuando se realiza el trasplante en los receptores diabéticos, ya que garantizará el trasplante de islotes sobrevivientes / robu...

Los avances en microscopía intravital han revelado fenómenos fisiológicos no predichas por los estudios in vitro 1. Esto pone de relieve el desafío en la traducción de los resultados obtenidos por los métodos in vitro convencional en el animal vivo. En la última década, la visualización de los tejidos en los animales vivos se mejoró considerablemente por los avances tecnológicos en las modalidades de imagen 2, 3, 4, 5, 6. Esto ha estimulado la necesidad de enfoques en formación de imágenes in vivo con aplicación factible en modelos animales experimentales para permitir la visualización longitudinal de los tejidos diana de manera no invasiva. Las técnicas de imagen como la resonancia magnética y la tomografía por emisión de positrones o bioluminiscencia han permitido que la imagen no invasiva de órganos / tejidos profundos dentro del cuerpo 7-8, 9. Pero estas técnicas no pueden lograr células únicas resolución debido a señales de fondo elevadas y baja resolución espacial, a pesar del uso of materiales de alto contraste o 4 tejidos específicos de luminiscencia. Esto fue tratada con la llegada de dos fotones microscopía de fluorescencia confocal 10. Dos fotones microscopía intravital permitió estudios de formación de imágenes para visualizar y cuantificar acontecimientos celulares con detalles sin precedentes 11, 12. Esto ha llevado a la caracterización de procesos biológicos esenciales en la salud y la enfermedad 13, 14, 15, 16. Mientras pioneros estudios de imagen han intravital principalmente &quot;imitado&quot; en condiciones in vivo en los tejidos extirpados (ganglios linfáticos, por ejemplo), otros estudios han utilizado métodos invasivos para los tejidos diana de imagen expuestos in situ 17, 18, ​​19, 20, 21. Otros estudios también han utilizado modelos de cámara &quot;ventana&quot; para eludir las limitaciones asociadas con los métodos invasivos y resolución de imágenes limitado en vivo 22, 23, 24, 25. En el modelo de cámara de ventana, una cámara con una ventana transparente se implanta quirúrgicamente en la piel en difeubicaciones de alquiler (piel dorsal o el oído, almohadilla de grasa mamaria, hígado, etc) sobre el animal (por ejemplo, ratón, rata, conejo). Si bien este enfoque claramente permite una alta resolución de imágenes in vivo, se requiere una cirugía invasiva para implantar la cámara y no puede ser capaz de acomodar los estudios longitudinales de imagen durante varias semanas o meses 22. Se ha demostrado recientemente que la combinación de alta resolución de la microscopía confocal con un procedimiento mínimamente invasivo, es decir, el trasplante a la cámara anterior del ojo (ACE) proporciona una &quot;ventana cuerpo natural&quot; como un. Potente y versátil en vivo plataforma de imágenes 26, 27 El trasplante en el ACE se ha utilizado en las últimas décadas para estudiar aspectos biológicos de una variedad de tejidos 28, 29, 30, y su combinación reciente con imágenes de alta resolución permitió el estudio de la fisiología de los islotes pancreáticos con células únicas resolución no invasiva y longitudinalmente &lt;sup&gt; 26, 27. Este enfoque se utilizó para estudiar las respuestas autoinmunes durante el desarrollo de la diabetes tipo 1 en modelos animales (datos no publicados). También fue utilizado para estudiar el desarrollo de páncreas, así como, en los estudios de la función renal mediante el trasplante en las yemas de páncreas ECA o individuales glomérulos renales, respectivamente (datos no publicados). Un reciente informe utilizando este enfoque demostró además su solicitud para estudiar la respuesta inmune después de trasplante de islotes pancreáticos 31. Es importante destacar que, este estudio demostró que el trasplante a la cámara anterior del ojo proporciona una ventana natural del cuerpo para llevar a cabo: (1) longitudinal, la imagen no invasiva de tejidos trasplantados in vivo, (2) in vivo cytolabeling para evaluar el fenotipo celular y la viabilidad en situ, (3) seguimiento en tiempo real de la infiltración de células inmunes en el tejido diana, y (4) la intervención local por aplicación tópica o inyección intraocular. En este sentido, demonstrate cómo realizar el trasplante en la cámara anterior del ojo utilizando islotes pancreáticos.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Descripción / Comentarios </td></tr><tr><td> IsoTHESIA (isoflurano) </td><td> Buttler Animal Health Supply </td><td> 11695-6775-2 </td><td> 99,9% de isoflurano / ml </td></tr><tr><td> Ketaset (Ketamina HCL) </td><td> Fort Dodge Animal Health </td><td> 0856-2013-01 </td><td> Anestesia inyectable Alternativa </td></tr><tr><td> Beprenex (buprenorfina HCL) </td><td> Reckitt Benckiser Health Care (UK) Ltd. </td><td> 12496-075-7-1 </td><td> 0,3 mg / ml </td></tr><tr><td> Ophthalmic eritromicina ungüento USP, 0,5% </td><td> Akron </td><td> 17478-070-35 </td><td> Aplicado preventivamente a ojo trasplantado </td></tr><tr><td> 0,9% de cloruro sódico (solución salina) </td><td> Hospira Inc. </td><td> 0409-7983-03 </td><td> Para la inyección iv. Estéril </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010-023 </td><td> 1X. Estéril </td></tr><tr><td> CMRL medio 1066 </td><td> Cellgro </td><td> 98-304 CV- </td><td> Complementado, CIT modificación. Los medios preferidos para islotes </td></tr></tbody></table>

trasplante en la cámara anterior del ojo para longitudinal, no invasiva<em&gt; en vivo</em&gt; imagen con una sola célula de resolución en tiempo real

Transplantation into the Anterior Chamber of the Eye for Longitudinal, Non-invasive In vivo Imaging with Single-cell Resolution in Real-time

Intravital de imágenes se ha convertido en una herramienta indispensable en la investigación biológica. En el proceso, muchas técnicas de imagen se han desarrollado para estudiar los diferentes procesos biológicos en los animales no invasiva. Sin embargo, una limitación técnica importante en existentes modalidades de imagen intravital es la incapacidad para combinar la no-invasivo, formación de imágenes longitudinal con capacidades de resolución de una sola célula. Se muestra aquí cómo el trasplante a la cámara anterior del ojo elude esta limitación significativa que ofrece una plataforma versátil experimental que permite no invasiva, la imagen longitudinal con resolución celular in vivo. Se demuestra el procedimiento de trasplante en el ratón y proporcionar resultados representativos usando un modelo con relevancia clínica, es decir, trasplante de islotes pancreáticos. Además de permitir la visualización directa en una variedad de tejidos trasplantados en la cámara anterior del ojo, este enfoque proporciona una plataforma para Screen mediante la realización de las drogas a largo plazo de seguimiento y monitoreo en los tejidos diana. Debido a su versatilidad, el tejido / trasplante de células en la cámara anterior del ojo no sólo terapias de trasplante beneficios, se extiende a otras aplicaciones in vivo para estudiar los procesos fisiológicos y fisiopatológicos tales como la transducción de señales y el cáncer o desarrollo de la enfermedad autoinmune.

Hay algunos parámetros que definen una &quot;buena&quot; trasplante. Un trasplante de buena es la que procede sin sangrado cuando se hace la incisión como se puede ver en el vídeo. El sangrado se impide / minimiza al penetrar sólo la punta del escalpelo (aguja) en la ACE (Figura 3a). Esto también ayudará a evitar el contacto y la punción del iris. También se asegurará de una pequeña incisión que se curan muy bien sin causar opacidad de la córnea con el tiempo (Figura 3c, d). Otro aspect...

Un nuevo enfoque de la combinación de trasplante intraocular y microscopía confocal permite longitudinal, no invasiva imágenes en tiempo real con una sola célula de resolución dentro de los tejidos injertados<em&gt; In vivo</em&gt;. Se demuestra cómo trasplantar islotes pancreáticos en la cámara anterior del ojo del ratón.

Trasplante en la cámara anterior del ojo para Longitudinal, no invasiva<em&gt; En vivo</em&gt; Imagen con una sola célula de resolución en tiempo real

Intravital imaging has emerged as an indispensable tool in biological research.  In the process, many imaging techniques have been developed to study ...

Hola, soy Doretta del Instituto de Investigación sobre la Diabetes en la Escuela de Medicina Miller de la Universidad de Miami. En este video demostraré cómo trasplantar islotes pancreáticos a la cámara anterior del ojo de ratón. El procedimiento consta de dos pasos.El primer paso consiste en cargar los islotes pancreáticos aislados en la cánula, y el segundo paso es el procedimiento de trasplante propiamente dicho. Para obtener más detalles sobre los instrumentos y los reactivos, consulte el texto adjunto. Aquí destacamos el motor de la jeringa con la jeringa montada y los accesorios del depósito y la cánula, que serán el enfoque del siguiente video.Comenzamos cargando los ojales en la cánula. Todos los procedimientos se realizan bajo el estereoscopio. Comience centrando los ojales girando o rotando el recipiente en círculos.Una vez centrado, desconecte la cánula del reservorio y elimine las burbujas de aire moviendo el motor de la jeringa hacia adelante. Esto se realiza presionando el pedal del pie para avanzar. Cuando esté listo, comience a aspirar los orificios hacia el reservorio moviendo ahora el motor de la jeringa en dirección hacia atrás.Y nuevamente, eso se realiza presio

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el seguimiento en directo de la retina progenitores WT individuales en los antecedentes genéticos distintos permite la evaluación de la contribución de la señalización no autónomo celular durante la neurogénesis. Aquí, una combinación de gen desmontables, la generación de quimera a través de la transferencia de embriones y la imagen de lapso de tiempo confocal in vivo se utilizó para este propósito.

En vivo de imágenes de transgénicos de la Expresión Génica en el Estimado de retina progenitores en embriones de pez cebra quiméricos para estudiar celulares Influencias no autónomos

Las células epiteliales del pigmento retiniano podrían servir como una terapia de reemplazo celular para la forma avanzada de la degeneración macular seca relacionada con la edad. Este protocolo describe la generación de un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica y el transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivados de células madre embrionarias humanas en este modelo de la enfermedad.

Transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica

El objetivo del protocolo es mostrar longitudinal intravital seguimiento en tiempo real de los timocitos por microscopía en implantes tímicos en la cámara anterior del ojo de ratón del laser. La transparencia de la córnea y la vascularización del injerto permiten grabar continuamente reclutamiento de células progenitoras y salida de células T madura.

Seguimiento en Vivo de los timocitos en el compartimiento Anterior del ojo mediante láser, microscopía en tiempo real

Aquí se presenta una plataforma microscópica multifoto para imágenes de superficie ocular de ratón en vivo. El ratón fluorescente transgénico permite la visualización de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nerviosas y capilares dentro de la superficie ocular. Las señales no lineales de segunda generación armónica derivadas de estructuras de collagenounous proporcionan imágenes sin etiquetas para arquitecturas estromales.

Una plataforma de microscopía multifoto personalizada para imágenes en vivo de cornea de ratón y conjuntiva

La imagen in vivo es una herramienta poderosa para el estudio de la biología en la salud y la enfermedad. Este protocolo describe imágenes transpupilares de la retina del ratón con un microscopio estándar de dos fotones. También demuestra diferentes métodos de imagen in vivo para etiquetar fluorescentemente múltiples cohortes celulares de la retina.

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

El protocolo presenta una nueva herramienta para simplificar la obtención de imágenes intravitales mediante microscopía confocal invertida.

Enfoque simplificado de imágenes intravitales para la monitorización a largo plazo de la dinámica del tejido epitelial en un microscopio confocal invertido

Aquí, describimos una plataforma que permite la obtención de imágenes in vivo no invasivas de esferoides hepáticos injertados en la cámara anterior del ojo del ratón. El flujo de trabajo abarca desde la generación de esferoides a partir de células hepáticas primarias hasta el trasplante en el ojo del ratón y la obtención de imágenes in vivo a resolución celular mediante microscopía confocal.

Obtención de imágenes in vivo de esferoides hepáticos injertados en la cámara anterior del ojo de ratón

Alta frecuencia de ultrasonido Doppler es una nueva tecnología para la evaluación de la función miocárdica regional. Este trabajo presenta la primera evidencia que demuestra la aplicabilidad de esta plataforma de imágenes versátil para las medidas repetidas de la tensión del miocardio, la insuficiencia dp / dt, y mitral en la isquemia-reperfusión (IR) del corazón murino.

Alta frecuencia de alta resolución Ecocardiografía: Primera evidencia sobre la no-invasivo medida repetida de la tensión de miocardio, la contractilidad y la insuficiencia mitral en el corazón por isquemia-reperfusión murino

Nos en este documento presentamos un modelo de trasplante renal de rata para evaluar de forma no invasiva el rechazo agudo del aloinjerto mediante tomografía por emisión de positrones con 18F-fluorodesoxiglucosa.

Imagen no invasiva de rechazo agudo del aloinjerto después Rat Trasplante Renal Uso<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG PET

Se combinaron dominio de la frecuencia del infrarrojo cercano las medidas de espectroscopia de oxigenación cerebral difusa con hemoglobina medidas de espectroscopia de correlación del índice de flujo sanguíneo cerebral para estimar un índice de metabolismo del oxígeno. Pusimos a prueba la utilidad de esta medida como una herramienta de detección de cabecera para evaluar la salud y el desarrollo del cerebro del recién nacido.

No invasiva de medición óptica del metabolismo cerebral en lactantes y Hemodinámica

Aprende el trasplante de islotes pancreáticos en la cámara anterior del ojo de ratón para imagen longitudinal no invasiva. Este método permite monitorear la viabilidad y engraftamiento celular con resolución de célula única.

Trasplante en la cámara anterior del ojo para Longitudinal, no invasiva En vivo Imagen con una sola célula de resolución en tiempo real (Video) | JoVE Journal

Trasplante en la cámara anterior del ojo para Longitudinal, no invasiva

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