Name: Construcción de Matrices Microdrive para grabaciones neuronales crónicas en Awake Ratones Behaving (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprende a construir matrices microdrive para grabaciones neuronales crónicas en ratones despiertos y en comportamiento libre. Este método permite registrar actividad de poblaciones neuronales con alta relación señal-ruido.

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Damos las gracias a Daniel Carpi por su ayuda y los primeros aportes a este proyecto. También agradecemos a Lucrecia Novoa por su ayuda con las ilustraciones y las imágenes. Este trabajo fue apoyado por el NIH / NIAID subvención programa 5P01AI073693-03.

1. Tetrode Fabrication <ol><li> Iniciar mediante el uso de aislantes 12,5 micras (0,0005 &quot;) diámetro del núcleo de alambre de platino-iridio de California de alambre fino. La longitud del alambre debe ser cortado a la longitud apropiada para la estructura de destino. Por ejemplo, cortar el alambre a por lo menos 30 cm de largo para la orientación del subículo dorsal o hipocampo. </li><li> Doble el alambre sobre en el centro de manera que hay dos alambres paralelos que serán 15 cm de longitud. Coloque el punto medio de este alambre sobre un brazo horizontal para formar cuatro alambres paralelos de 7,5 cm de longitud. Siguiente adjuntar el clip recubierto de caucho cerca de la parte inferior del alambre de drapeado, la creación de un conjunto de cuatro cables. </li><li> Coloque el clip de goma en el Tetrodo Spinner motorizado, asegurándose de que el cable se tensa, pero el peso no demasiado tenso o cojinete como se romperá durante el proceso de hilado. </li><li> Cambie el Spinner Tetrode al modo &quot;Manual&quot; y pulse el joystick para &quot;Derecha&quot; para girar el cable en sentido horario. El spinnergirará en aproximadamente 2 Hz, la creación de un paquete apretado de cuatro alambres para formar el tetrodo. </li><li> Aplicar 80 rotaciones en sentido horario y luego se detiene pulsando la tecla &quot;Up&quot; en el joystick. Esto hará una pausa en la ruleta motorizado. A continuación, aplique 20 giros hacia la izquierda (&quot;Left&quot;) con el fin de liberar la tensión en el tetrodo. El número final de revoluciones por longitud de alambre debe ser de 8 revoluciones por micras. </li><li> Utilice la pistola de calefacción en el ajuste más bajo 1, que alcanza un máximo de 400 grados, con el fin de fusionar los cables juntos por fusión de la capa de unión VG. Sostenga la pistola de aire caliente ~ 2 cm del alambre y ejecutar el arma hacia arriba y abajo de la longitud recta del hilo durante unos 5 segundos desde varios ángulos diferentes. Asegúrese de que para barrer constantemente la pistola de calor y lo sostenga cualquier ubicación única ya que esto fundir el aislamiento HML y hace que los cables se fusionan dentro del haz. </li><li> Hacer un corte en la parte superior de la tetrodo (cerca del brazo horizontal) y luego liberar el tetrodo de la pinza en la parte inferior. Cortar el de un solo bucle de manera que hay cuatro cables separados en un extremo de la tetrodo, estos cables se conectan eléctricamente a las patillas de oro o una placa de circuito en un paso posterior. </li><li> Coloque el tetrodo completado en una caja de explotación libre de polvo para su almacenamiento hasta que la unidad se ha completado. </li></ol> 2. Asamblea Microdrive personalizada <ol><li> En primer lugar la construcción de la base que sostendrá el microdrive (s). La base de la microdrive implantado es generalmente más estable si se asegura y se coloca a lo largo de la línea media del cráneo. Este protocolo describe los pasos para construir una base con un solo microdrive para sostener cuatro portadores de tubos de poliamida. Microdrives y tubos adicionales se pueden agregar fácilmente cuando sea necesario. </li><li> Comience con una pieza de 20 mm aproximadamente cuadrada de plexiglás acrílico (5 mm de espesor) y arena el acrílico en una forma que permita que el ratón se mueva libremente con la unidad después de que se implante en la cabeza. </li><li> A continuación, montar la unidad de accionamiento. Use personalizado 30,3 x 6,3 mm guías de bronce que llevarán el tornillo de accionamiento. En primer lugar, dos guías de soldadura de latón junto perpendicularmente. La guía de latón vertical sostener el tornillo de la unidad y los electrodos, mientras que la pieza horizontal será pegada en la base acrílica. </li><li> Después de soldar las piezas de metal juntos, comenzar el montaje de la unidad en sí, pasando un tornillo de bronce cabeza cilíndrica ranurada a través de la parte superior de la guía y en un bloque de plástico Delrin. El bloque cuadrado está diseñado de modo que el agujero de rosca es ligeramente fuera del centro (por 0,2 mm), lo que resulta en una cara del bloque que sobresale muy ligeramente de la guía. Este es el lado en el que los tubos de poliamida que llevan los electrodos se sentarán. </li><li> Con el bloque de Delrin dentro de la guía y el tornillo hasta el final, enhebrar una tuerca de latón hexagonal hasta que la tuerca está casi tocando la parte inferior de la guía. No apriete la tuerca completamente, sino fundir una pequeña cantidad de soldadura en el extremo con el fin de unirse a la tuerca y el tornillo, pero teniendo cuidado de no soldar anytHing a la guía. Ahora, girando el tornillo debe mover el bloque hasta Delrin (a la derecha) y hacia abajo (hacia la izquierda) verticalmente a lo largo de la rosca. Corte el hilo que sobresale más allá de la tuerca soldada. </li><li> Una vez que la unidad se ha montado, vaya de nuevo a la base de acrílico y corte una ranura de 3 mm de ancho, donde la unidad de electrodo será. Pase la guía de latón horizontal a través de la ranura y el uso de pegamento cryanoacrylate para asegurar la pieza a la base. </li><li> Colocar la base de acrílico en una prensa de tornillo para fijarlo en su lugar. Coloque una tarjeta de interfaz electrónica (BEI) en la parte superior de la base y marcar las ubicaciones de los dos orificios de los tornillos. EIBS son microchips que proporcionan una conexión de señal entre los cables de los electrodos y un headstage de pre-amplificador. El uso de un mm punta de broca 1.5, perfore cuidadosamente agujeros en las marcas de los tornillos que llevará a cabo el BEI en su lugar en la parte superior de la base. Coloque el BEI y el hilo dos tornillos de latón en los orificios. </li><li> Utilice micro tijeras de disección para cortar cuatro trozos largos de 7 mm de jaula en poliamidatubo ide. Línea de los cuatro tubos uno al lado del otro sobre un trozo de cinta de laboratorio doblado. Aplicar cianoacrilato al centro para unirlas pero tenga cuidado de no hacer cola en los propios tubos. Dejar que los tubos unidos se sequen completamente. </li><li> Girar la base de accionamiento 90 grados, de manera que el chip BEI es vertical y la unidad se coloca horizontalmente con el bloque de Delrin que sobresale hacia arriba. Mirando a través de un microscopio de disección, con cuidado aplique una pequeña cantidad de cianoacrilato en la cara Delrin luego colocar los cuatro tubos unidos en la cola. Deje que el pegamento fragüe completamente antes de mover la unidad. </li><li> Prueba de que los tubos de poliamida están bien conectados y que todo el conjunto se mueve suavemente sin tocar la guía o encontrar resistencia alguna. </li><li> A continuación, preparar el tornillo de tierra y conecte el cable de tierra al BEI. Hacer un tornillo de tierra mediante la adopción de un tornillo de bronce (3/32 &quot;) y lijar los hilos hasta que solo 1-2 hilos permanecen. Esto debería ser ~1 mm, como este tornillo se sentará dentro del cráneo y no está destinada a penetrar en el tejido cerebral. </li><li> Cortar una longitud de 30 mm de alambre de cobre (la longitud exacta dependerá del lugar donde en el cráneo para colocar el suelo de origen animal). El alambre de cobre debe ser 100 - 500 micras (0,004-0,02 &quot;) de diámetro, esto es más o menos equivalente a 38 AWG al 24 AWG Aplicar flujo de la soldadura a ambos extremos del alambre de cobre en un extremo, soldar el tornillo de tierra a.. el alambre. En el otro extremo, soldadura un alfiler de oro BEI. Este cable de tierra se puede ajustar a un lado y se conecta a la BEI más tarde durante la cirugía de implantación. </li><li> El siguiente paso es guiar a los electrodos a través de los tubos de poliamida y conectarlos a los orificios de los canales en el chip BEI. Gire el tornillo de accionamiento totalmente hacia la derecha de modo que los tubos están en su posición más alta. </li><li> Para los electrodos individuales, cortar una longitud de 50 mm de alambre Stableohm 50 mM y guiarla a través de un tubo de poliamida, lo que permite que se extienda al menos 2,0 mm más allá del extremo del tubo (para la orientación o subículohipocampo). Aplicar una pequeña gota de cianoacrilato en la parte superior del tubo, la colocación del alambre en el tubo y la prevención de cualquier movimiento de alambre. A continuación, conecte el extremo suelto del cable a un agujero de canal EIB con un broche de oro. Recorte el hilo sobrante con unas tijeras finas. Repita el proceso para otros microelectrodos. </li><li> Para conectar tetrodos, tome uno completó tetrodo de la caja de almacenamiento. Introduzca el extremo fundido del tetrodo través de un tubo de poliamida y deje que se extienda al menos 2,0 mm más allá del extremo del tubo (por subiculum o hipocampo). Aplicar una pequeña gota de cianoacrilato en la parte superior del tubo, la colocación del tetrodo al tubo y la prevención de cualquier movimiento. Tome los cuatro cables sueltos en el otro extremo de la tetrodo y conectar cada cable a un orificio de canal BEI utilizando un alfiler de oro. Recorte el exceso de cable. Repita el procedimiento para los otros tetrodos. </li></ol> 3. Asamblea VersaDrive <ol><li> Comienza la construcción de un tetrodo VersaDrive cuatro, lo que consiste en una base, carcasa y tapa pieces. </li><li> Cortar un tubo de poliamida de 10 mm y lo guiará a través del orificio más pequeño en un soporte tetrodo. Permitir que el tubo se extienda más allá de la portadora muy ligeramente (0,5 mm). Utilice 5 min epoxi para pegar el tubo de poliamida en el lugar, teniendo cuidado de no permitir que la resina entre en el propio tubo. Repita este procedimiento para otros tres tubos y soportes. </li><li> Después de que el epoxi se ha establecido plenamente, guiar a cada tubo de poliamida a través de uno de los cuatro orificios de la base VersaDrive. Una vez que los cuatro tubos son a través de sus agujeros, empujar a un pin de insectos a través del orificio externo, lo que llevará a cabo la compañía tetrodo en línea y servir como un carril para el transporte para viajar en. Repita este procedimiento para las otras tres compañías. </li><li> Tome una gorra y alinearla con los cuatro pasadores de insectos de manera que la tapa cubre la base y los portadores tetrodo residen dentro de la tapa. Tema a 1 mm x 5 mm tornillo de la máquina a través del orificio correspondiente en la tapa y en el soporte tetrodo. Este será el tornillo de accionamiento para mover el soporte hacia arriba y abajo. Repcomer esto para los otros tres tornillos. </li><li> Apague todos los tornillos en sentido horario hasta que las compañías tetrodo están en su posición superior y los tubos de poliamida son visibles a través de la abertura de la tapa. Usando tijeras finas micro disección, cortar el tubo justo por debajo de (1 mm) de la base de modo que todos los cuatro tubos de poliamida son de la misma longitud. </li><li> El uso de un microscopio de disección, enhebrar una tetrodo cuidadosamente a través de un tubo de poliamida. Es importante mantener el cable tetrodo perfectamente recta a medida que avanza a través del tubo como dobleces o curvas harán muy difícil enhebrar plenamente el tetrodo través. Repita el proceso para otros tres tetrodos. </li><li> Una vez que todos los tetrodos están en sus tubos, aplicar cuidadosamente una pequeña gota de cianoacrilato a la parte superior de cada tubo, asegurando los tetrodos dentro de sus respectivos tubos. Tenga cuidado de no obtener ninguna cianoacrilato entre los transportistas o de los cables tetrodo sueltos que sobresalen a través de la tapa. </li><li> Cortar las tetrodos de modo que sólo se extienden más allá de los tubos2,0 mm (para subiculum o hipocampo). A continuación, coloque la base de la unidad (con los cuatro pasadores de insectos insertados) en la plantilla VersaDrive. La otra mitad de la plantilla se mantenga la tapa VersaDrive que tiene todos los agujeros del receptáculo para hacer las conexiones de canal. </li><li> Girar el tornillo de accionamiento completamente contrario, de manera que los tetrodos están en su posición más baja. </li><li> Antes de conectar los cables tetrodo a los receptáculos de oro, conecte primero los cables de tierra a la tapa. La tapa VersaDrive tiene dos orificios de pasador para conexiones a tierra en la posición central de las dos filas de agujeros. Cortar un alambre de cobre de al menos 30 mm (depende donde en el cráneo para colocar el suelo) y guiarla a través de uno de estos agujeros centrales. El alambre de cobre debe ser 100 a 500 micras (0,004 a 0,02 &quot;) de diámetro, esto es más o menos equivalente a 38 AWG al 24 AWG Empujar un recipiente de oro a través del agujero para coger el hilo de cobre en su lugar y recortar cualquier exceso de cable.. En el otro extremo del cable de cobre, aplique fundente y solder este extremo del cable a un tornillo de tierra (véase 2.11.). Repita para el segundo cable de tierra. </li><li> A continuación, guiar a todos los cables sueltos tetrodo (debe haber dieciséis en total) a través de sus respectivos orificios de receptáculo en la tapa. Lo mejor es empezar con un tetrodo y enhebrar los hilos individuales de los cuatro orificios apropiados que terminarán directamente sobre él. Los cables tetrodo individuales deben ser manejados con una ligera presión, ya que son frágiles y pueden doblar fácilmente si agarrado demasiado fuerte. Instale la tapa alineando las clavijas de insectos agujeros y pulse ajuste a la base. </li><li> Con los cables de tetrodo sobresale a través de la tapa, ajuste a presión de los recipientes de oro para capturar los cables tetrodo en su lugar y hacer las conexiones eléctricas. Aproximadamente el 50% de los hilos quedará cortada (por encima de la tapa) una vez que el receptáculo de oro es empujado hacia abajo. Recortar cualquier exceso de hilo que queda sobresaliendo de la parte superior de la tapa. En casos raros (menos del 5%), empujando el recipiente de oro por aplastará el alambrey romper por debajo de receptáculo, lo que resulta en un canal desconectado. Esta desconexión no puede realizarse hasta que las pruebas de impedancia y medidas de galvanoplastia (véase el apartado 4.7). </li><li> Repetir el proceso de ajuste a presión para los otros tres tetrodos. Gire los tornillos de la unidad hacia la derecha para mover de nuevo a la parte superior y asegúrese de que el movimiento del motor es suave. </li></ol> 4. Baño de oro de puntas de electrodos <ol><li> Independientemente de qué tipo de microelectrodos que se utilizan, las puntas de los electrodos deben estar revestidos de oro con el fin de reducir la impedancia de punta. Esto maximizará la capacidad de grabar de forma fiable y discriminar los potenciales de acción de una sola unidad. Prueba de la impedancia de los electrodos con el dispositivo nanoZ Neuralynx. El nanoZ es un dispositivo computarizado que mide la impedancia y permite galvanoplastia automatizado. </li><li> Primero girar los tornillos microdrive hacia abajo (hacia la izquierda) a su posición más baja. A continuación, monte firmemente el microdrive en una pinza que le permitirá bajar delas puntas de los electrodos en la solución de chapado en oro. </li><li> Llene una torre de Delrin con una solución de oro SIFCO y la otra torre con agua destilada. Bajar las puntas de los electrodos en la solución de oro. </li><li> Conecte el cable USB nanoZ en un equipo basado en Windows y abra el programa nanoZ. Este programa dará lecturas de impedancia y realizar sobrerregulación en cada canal conectado del Microdrive. </li><li> Vaya al Device desplegable y seleccione el nanoZ, tras lo cual se mostrará &quot;Conexión establecida&quot; en la parte inferior de la ventana. A continuación, seleccione el adaptador adecuado para probar en el menú desplegable. Haga clic en &quot;impedancias de prueba&quot; y ajuste la frecuencia de la prueba de 1004 Hz (40 ciclos, 0 milisegundos de pausa). Haga clic en &quot;Punta de prueba&quot;, que se abrirá la ventana &quot;Sonda Report&quot; que muestra todos los canales disponibles con sus mW lecturas. Guarde estos valores de impedancia haciendo clic en el icono del disco o seleccionando &quot;Archivo&quot;, luego &quot;Guardar informe&quot;. </li><li> A continuación, haga clic en &quot;DC electrochapa&quot; y asignarlos siguientes valores: Modo = impedancias partido, platean actual = -1,0 μA, Target = 350 kW a 1004 Hz, 5 carreras, 5 segundos de intervalo, pausa de 2 segundos. </li><li> Haga clic en &quot;Autoplate&quot;. El programa leerá primero la impedancia de cada canal, a continuación, aplicar la corriente especificada para ese canal, vuelva a probar la impedancia y corriente aplicar según sea necesario hasta que se alcance la impedancia del objetivo (o un valor inferior). Mientras que el objetivo es reducir la impedancia del electrodo, es posible que los canales se electroplate debajo de los valores de 100 kW. En tales casos, es posible que los cables vecinos en el tetrodo han sido cortocircuitados juntos. Si esto sucede, invertir la polaridad de corriente (+ 1,0 μA) para eliminar el exceso de partículas de oro, vuelva a probar la impedancia de ese canal, y luego repetir la galvanoplastia. Valores de impedancia finales típicos de un paquete de cuatro cables de 12,5 mu M van desde 150 hasta 325 kW. </li><li> Si hay cualquier canal único que no ha laminado por debajo de 350 kW, repetir el proceso de galvanoplastia.El programa saltará a través de canales que ya han alcanzado el objetivo y sólo canales de placa que no tienen. </li><li> Una vez que todos los canales se han plateado con una impedancia aceptables, cierre el programa nanoZ y desconecte el dispositivo. Elevar los electrodos de la solución de deposición y bajar las puntas en la torre de Delrin agua destilada con el fin de enjuagar el exceso de partículas de oro. </li><li> Gire los tornillos de la unidad hacia la derecha hasta que los electrodos se levantan a su posición superior. Ahora el microdrive y los electrodos están listos para su implantación. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Hemos descrito un conjunto de técnicas para la construcción de microdrives ligeros y compactos para la grabación de la unidad extracelular y la actividad potencial de campo en ratones. Con la construcción de microdrives personalizados con bases Hecha de vidrio acrílico (metacrilato de metilo), el núcleo del sistema se puede adaptar fácilmente para múltiples unidades y para la orientación de una amplia gama de regiones neuronales. Hemos modificado con éxito el sistema de registro de múltiples dianas cerebrales y con matr...

El uso de la técnica de microelectrodos para registrar las señales neuronales extracelulares in vivo tiene una larga tradición y se valora en neurociencia 1, 2. La capacidad para registrar la actividad eléctrica a partir de muchas regiones del cerebro en animales comportarse libremente es, sin embargo, una tecnología más reciente que se está volviendo cada vez más común como los paquetes de software para la adquisición, el análisis y la discriminación de las señales neurales se hace más sofisticada y fácil de usar 3, 4. Los avances tecnológicos en el lado de software también han ido acompañadas de reducciones en el peso y el volumen de los dispositivos implantables, que se han ampliado lo suficiente para grabar en pequeños mamíferos, como ratones. Mediante el uso de componentes ligeros (en su mayoría de plástico), los investigadores son capaces de construir microdrives que permiten el posicionamiento independiente de electrodos o tetrodos para apuntar una amplia variedad de regiones cerebrales 5-7. Incluso las estructuras cerebrales profundos, tales como laamígdala 6 y el cuerpo estriado 5, pueden ser dirigidos de forma rutinaria con la selección de un tornillo de accionamiento apropiadamente larga. Estas técnicas de grabación permiten a los investigadores para obtener señales neuronales de alta fidelidad y están en registro con la actividad eléctrica de las neuronas individuales registradas intracelularmente 8, 9. El uso de estos tipos de microdrives, hemos registrado con éxito las unidades individuales de los ratones de hasta dos meses después de la implantación 10. Además, la naturaleza de peso ligero de los dispositivos (aproximadamente 1,5-2,0 g) ha dado como resultado en el rendimiento de comportamiento que es comparable a los ratones no implantados en muchas tareas de comportamiento. En particular, hemos demostrado que los ratones implantados presentan el rendimiento normal en la novela tarea de reconocimiento de objetos 10 y el lugar tarea objeto (datos no publicados). El uso de microdrives junto a varios tetrodos permite a los investigadores monitorear y analizar la actividad neuronal a nivel de redmientras que también se graba desde múltiples unidades individuales dentro del cerebro. Grabación con estos tetrodos tiene varias ventajas importantes para fines de identificación de la unidad y permite la adquisición de alta precisión y la discriminación de las múltiples unidades individuales 11. Se describe cómo fabricar y paquetes tetrodo oro placa y, posteriormente, a cargar en portaelectrodos accionables. Un tipo de soporte de la unidad que describimos está disponible comercialmente y el otro es un diseño simple, pero fácilmente ampliable, una unidad con capacidad para múltiples operadores y arreglos tetrodo sin una inversión significativa de recursos.

<table><tbody><tr><td>0.0005" (12.5 &mu; M) diámetro Alambre de platino-iridio </td><td>California Alambre fino</td><td>CFW#100-167</td><td>HML VG aislado <a href="http://www.calfinewire.com" target="_blank">www.calfinewire.com</a></td></tr><tr><td>0.002" (50 &mu; M) diámetro Alambre Stableohm 675</td><td>California Alambre fino</td><td>CFW# 100-188</td> Tubo de poliamida <td>Ni-Cr con aislamiento</td></tr><tr><td>HML</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150020</td><td>99 micras de diámetro interior, 166 micras de diámetro exterior <a href="http://www.polymicro.com" target="_blank">www.polymicro.com</a></td></tr> guías <tr><td>de latón</td><td>World Plastics Inc</td><td></td><td>3,3 x 6,6 mm</td></tr><tr><td>Bloques de Delrin</td><td>Mundo Plastics Inc</td><td></td><td>3,13 x 2,5 mm</td></tr><tr><td>Tornillos de latón con cabeza de relleno</td><td>J.I. Morris Co.</td><td>00-90 x 1/2</td><td>tornillo de atornillado <a href="http://www.jimorrisco.com" target="_blank">www.jimorrisco.com</a></td></tr><tr><td>tuercas hexagonales de latón</td><td>J.I. Morris Co.</td><td>00-90</td><td></td></tr><tr><td>Tornillos de latón con cabeza de relleno</td><td>J.I. Morris Co.</td><td>000-120 x 3/32</td><td>Montaje EIB y tornillo de</td></tr><tr><td>tierra plexiglás acrílico</td><td>Canal Street Plastics 5</td><td>mm de espesor, transparente, <a href="http://www.cpcnyc.com" target="_blank"> www.cpcnyc.com</a></td>cianoacrilato Krazy Pegamento Krazy Tubo 2 g placa de interfaz electrónica Neuralynx EIB-18 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><a href="http://www.neuralynx.com" target="_blank">www.neuralynx.com</a></td></tr><tr><td>solución de oro sin cianuro</td><td>SIFCO SIFCO</td><td>5355</td><td><a href="http://www.sifcoasc.com" target="_blank">www.sifcoasc.com</a></td></tr><tr><td>VersaDrive 4</td><td>Neuralynx</td><td></td><td>modelo de</td></tr><tr><td>cuatro tetrodos estación de montaje de tetrodos</td><td>Neuralynx</td><td></td><td></td></tr><tr><td>spinner de tetrodo motorizado</td><td>Neuralynx</td><td>tetrode spinner 2.0</td><td></td></tr><tr><td>Plantilla VersaDrive</td><td>Soldador de Neuralynx</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Radio Shack</td><td>64-2802B</td><td><a href="http://www.radioshack.com" target="_blank">www.radioshack.com</a></td></tr><tr><td>nanoZ</td> Taladro/atornillador de broca <td>pequeña Neuralynx</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ram Productos</td><td>Rampower 35</td><td>con controlador de pedal, <a href="http://www.ramprodinc.com" target="_blank">www.ramprodinc.com</a></td></tr><tr><td>brocas</td><td>Small Parts, Inc.</td><td></td><td>Puntas de 3/32", <a href="http://www.smallpartsinc.com" target="_blank">www.smallpartsinc.com</a></td></tr><tr><td>microscopio de disección</td><td>Olympus</td><td>SZ-60</td><td><a href="http://www.olympusamerica.com" target="_blank">www.olympusamerica.com</a></td></tr><tr><td>pistola de calor</td><td>Alphawire</td><td>Fit gun 3</td><td>use la configuración "1" solamente, <a href="http://www.alphawire.com" target="_blank">www.alphawire.com</a></td></tr><tr><td>26 AWG alambre de cobre</td><td>Arcor Electronics</td><td>F26</td><td>para cables de tierra, <a href="http://www.arcorelectronics.com" target="_blank"> www.arcorelectronics.com</a></td></tr><tr><td>fundente de soldadura</td><td>Eagle</td><td>2 oz, #205</td><td></td></tr><tr><td>0.02" de diámetro soldadura</td><td>Kester</td><td>24-6337-0010</td><td><a href="http://www.kester.com" target="_blank"> www.kester.com</a></td></tr><tr><td>tornillo de banco de sobremesa</td> Luz de fibra óptica <td>Vacu-Vise</td><td>Modelo 300</td><td></td></tr><tr>Brazos<td>de</td> luz dobles <td>Nikon</td><td>MKII</td><td>, <a href="http://www.nikon.com" target="_blank"> www.nikon.com</a></td></tr><tr><td>5-min epoxi</td><td>aliado Electrónica</td><td></td><td>25 ml, <a href="http://www.alliedelec.com" target="_blank"> www.alliedelec.com</a></td></tr><tr><td>pinzas finas</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-4907, RS-5010</td><td>material INOX, <a href="http://www.roboz.com" target="_blank"> www.roboz.com</a></td></tr><tr><td>micro tijeras de disección</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabla 1. Materiales y reactivos utilizados para la construcción de tetrodos y microaccionamientos.</td></tr></tbody></table>

construcción de matrices microdrive para grabaciones neuronales crónicas en awake ratones behaving

Construction of Microdrive Arrays for Chronic Neural Recordings in Awake Behaving Mice

Registros electrofisiológicos State-of-the-art de los cerebros de los animales comportarse libremente permiten a los investigadores examinar simultáneamente los potenciales de campo locales (LFPs) de poblaciones de neuronas y los potenciales de acción de las células individuales, ya que el animal se dedica a experimentalmente tareas pertinentes. Microdrives crónicamente implantados permiten grabaciones del cerebro para durar por períodos de varias semanas. Unidades miniaturizados y componentes ligeros permiten estas grabaciones a largo plazo para los pequeños mamíferos, tales como ratones. Mediante el uso de tetrodos, que consisten en paquetes herméticamente trenzados de cuatro electrodos en el que cada cable tiene un diámetro de 12,5 micras, es posible aislar neuronas fisiológicamente activos superficiales en regiones del cerebro tales como la corteza cerebral, hipocampo dorsal, y subículo, así como regiones más profundas, tales como el cuerpo estriado y la amígdala. Además, esta técnica asegura, alta fidelidad grabaciones neuronales estables como el animal se enfrenta con una variedad de las tareas de comportamiento. Este manuscrito describe varias técnicas que han sido optimizados para grabar desde el cerebro del ratón. En primer lugar, se muestra cómo fabricar tetrodos, cargarlos en tubos accionables, y la placa de oro sus consejos con el fin de reducir su impedancia de mW a la gama kW. En segundo lugar, se muestra cómo construir un conjunto de microdrive personalizada para el transporte y movimiento de los tetrodos vertical, con el uso de materiales de bajo costo. En tercer lugar, se muestran los pasos para el montaje de un microdrive disponible comercialmente (Neuralynx VersaDrive) que está diseñado para llevar a tetrodos independientemente movibles. Finalmente, se presentan resultados representativos de los potenciales de campo locales y las señales de una sola unidad obtenidos en el subiculum dorsal de los ratones. Estas técnicas pueden ser fácilmente modificados para adaptarse a diferentes tipos de conjuntos de electrodos y los sistemas de registro en el cerebro del ratón.

<p class="jove_content"&gt; Después de implantar el microdrive y la reducción de los electrodos a los objetivos previstos cerebrales, un sistema de adquisición de datos amplificada, como por ejemplo un Neuralynx Lynx-8, que se necesita para grabar señales de los nervios. Grabaciones neuronales representativas de los potenciales de campo locales (LFPs) y los potenciales de acción de una sola unidad (a menudo denominados &quot;picos&quot;) de la dorsal subiculum ratón se muestran en la<strong&gt; Figura 2</strong&gt;. LFP señales fueron muestread...

Se describe el diseño y montaje de microdrives en registros electrofisiológicos in vivo de las señales del cerebro del ratón. Uniendo paquetes de microelectrodos a los transportistas accionables resistentes, estas técnicas permiten grabaciones neuronales a largo plazo y estable. El diseño ligero permite un rendimiento conductual sin restricciones por el animal después de la implantación en coche.

Construcción de Matrices Microdrive para grabaciones neuronales crónicas en Awake Ratones Behaving

State-of-the-art electrophysiological recordings from the brains of freely behaving animals allow researchers to simultaneously examine local field ...

El objetivo general de este procedimiento es construir un micro impulsor que pueda usarse para grabaciones cerebrales en ratones mientras se mueven libremente dentro de una cámara experimental. Esto se logra preparando primero un haz de cuatro microelectrodos en un tede. El segundo paso es construir la base de la microunidad y ensamblar los componentes de la unidad.A continuación, los tetros se conectan a la unidad y se conectan a alfileres de oro. El paso final es chapar en oro la punta de los tetros para reducir su impedancia y garantizar grabaciones de alta señal a ruido. En última instancia, las matrices de microimpulsores crónicos se utilizan para registrar la actividad neuronal de las poblaciones de neuronas, así como de las neuronas individuales en animales que se comportan despiertos.La principal ventaja de esta técnica es que ofrece una solución bastante barata y de ondas ligeras para las grabaciones cerebrales crónicas en ratones y otros pequeños mamíferos. Esta tecnología puede abordar cuestiones clave en el campo de la neurociencia, como la forma en que las neuronas codifican la información durante la realización de tareas conductuales. Empleamos regularmente esta técnica para registrar las neuronas del hipocampo dorsal y ulu, pero también la hemos utilizado para apuntar a estructuras más profundas como la amígdala.La demostración visual de este método es crucial ya que la construcción y la parte de montaje son difíciles de aprender, y también porque se trata de una pieza muy pequeña y delicada para comenzar la fabricación de tetro. Para el hipocampo, corte 30 centímetros de alambre aislado de platino iridio con núcleo de 12,5 micrómetros de diámetro, doble el alambre dos veces para formar cuatro alambres paralelos, cada uno de 7,5 centímetros de longitud. A continuación, coloque un clip recubierto de goma cerca de la parte inferior del cable drapeado y conéctelo al girador de tetro motorizado, asegurándose de que el cable esté tenso pero no demasiado tenso o que el peso del soporte haga que se rompa.Durante el proceso de centrifugado, aplique 80 rotaciones en el sentido de las agujas del reloj para enrollar el tero, seguidas de 20 rotaciones en el sentido contrario a las agujas del reloj para liberar la tensión. El número final de rotaciones por longitud de alambre debe ser de ocho rotaciones por micra. A continuación, configure la pistola de calor a 400 grados centígrados y utilícela para fusionar los cables.Pase la pistola de calor hacia arriba y hacia abajo a lo largo de los cables durante cinco segundos, manteniéndola aproximadamente a dos centímetros del cable en todo momento. Para derretir suavemente el recubrimiento de unión VG en los cables, corte la parte superior del tero para formar cuatro alambres separados y luego suelte el extremo inferior del clip. Coloque el tero completado en una caja de retención libre de polvo para guardarlo hasta que se haya completado la unidad.Primero, construya la base para el micro disco lijando una pieza cuadrada de plexiglás acrílico de 20 milímetros que tiene cinco milímetros de grosor en una forma que permitirá que el mouse se mueva libremente con el disco después de que se implante en la cabeza. A continuación, suelde dos guías de latón de 3,3 por 6,3 milímetros juntas perpendicularmente. La guía vertical de latón sujetará el tornillo de accionamiento y los electrodos, mientras que la pieza horizontal se pegará a la base acrílica.A continuación, comience el montaje de la propia unidad pasando un tornillo pecheral de cabeza de relleno a través de la parte superior de la guía y en un bloque de plástico delrin. Enrosque una pechuga hexagonal en el tornillo hasta que la tuerca esté casi tocando la parte inferior de la guía. Sin embargo, no lo apriete completamente.En su lugar, derrita una pequeña cantidad de soldadura para unir la tuerca y el tornillo. Pero tenga cuidado de no soldar nada a la guía. Al girar el tornillo, el bloque de delrin debe mover el bloque de delrin en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj verticalmente a lo largo de la rosca.Una vez que se haya ensamblado la unidad, regrese a la base acrílica y corte una ranura de tres milímetros de ancho donde estará la unidad del electrodo. A continuación, pase la guía horizontal del sujetador a través de la ranura y luego utilice el pegamento Sano ACRL para fijar la pieza a la base. A continuación, coloque una placa de interfaz electrónica en la parte superior de la base y, para marcar las ubicaciones de los dos orificios de los tornillos con un taladro de punta de 1,5 milímetros, taladre con cuidado los orificios en las marcas de los tornillos que mantendrán el EIB en su lugar en la parte superior de la base.A continuación, enrosque dos tornillos de pecho en los agujeros. Utilice unas tijeras de microdisección para cortar cuatro trozos de tubo de poliamida de siete milímetros de largo. Alinéalos uno al lado del otro en un trozo de cinta de laboratorio doblada y aplica sano ACRL para unirlos.Deje suficiente tiempo para que los tubos de unión se sequen por completo. A continuación, frote con cuidado una pequeña cantidad de cianocrilato en la cara de delrin. A continuación, coloque los cuatro tubos de unión sobre el pegamento.Nuevamente, deje suficiente tiempo para que el pegamento se fije por completo antes de intentar mover la unidad. Compruebe que los tubos de poliamida estén bien fijados y que todo el conjunto se mueva suavemente sin tocar la guía ni encontrar ninguna resistencia. A continuación, prepare el tornillo de tierra y conecte el cable de tierra al EIB como se describe en el protocolo de texto adjunto.Conecte los tetros y/o electrodos individuales al EIB pasando primero los cables a través del tubo de poliamida, permitiendo que se extiendan al menos dos milímetros más allá del extremo del tubo. A continuación, aplique una pequeña gota de cianocrilato, fijando el alambre al tubo y evitando cualquier movimiento del cable. A continuación, conecte los extremos sueltos del tero u otros cables a un orificio del canal EIB con un alfiler de oro.Finalmente, recorte el exceso de alambre con las tijeras finas que se muestran. A continuación, se muestran ejemplos de otras configuraciones de unidades que se pueden construir para dirigirse a diferentes regiones del cerebro. Para empezar, ensamble de la unidad.Corta el tubo de poliamida a 10 milímetros y guíalo a través del orificio más pequeño de un portador de tetro hasta que se extienda 0,5 milímetros más allá del extremo. A continuación, coloque el tubo de poliamida en su lugar y repita estos pasos para los otros tres tubos y soportes. Después de que el epoxi se haya endurecido por completo.Guíe cada tubo de poliamida a través de uno de los cuatro orificios de la base de la transmisión Versa. A continuación, empuje un alfiler de insecto a través del orificio exterior. Esto mantendrá al portador tetro en línea y servirá como riel para que el portador viaje.Repita esto para los otros tres portadores. A continuación, tome una tapa y alinéela con los cuatro alfileres de insectos para que la tapa cubra la base y los portadores de tero residan dentro de la tapa. Enrosque un tornillo de máquina de un milímetro por cinco milímetros a través del orificio apropiado en la tapa y en el portaobjetos.Repita esto para los otros tres tornillos. Gire todos los tornillos en el sentido de las agujas del reloj hasta que los portadores de tetro estén en su posición superior y los tubos de poliamida sean visibles a través de la abertura de la tapa. Con unas tijeras finas de microdisección, corte el tubo justo debajo de la base para que los cuatro tubos de poliamida tengan la misma longitud.A continuación, utilice un microscopio de disección para pasar cuidadosamente los tetros a través de los tubos de poliamida y asegúrelos en su lugar con una pequeña gota de anoato. A continuación, corta los tetros de forma que sólo se extiendan 2,0 milímetros más allá de los tubos. Antes de conectar los cables tero a los receptáculos dorados.Primero, conecte los cables de tierra a la tapa. A continuación, guíe todos los cables de tero sueltos a través de sus respectivos orificios de receptáculo en la tapa e instale la tapa alineando los orificios de los pasadores de insectos y presione el accesorio a la base. Finalmente, recorte cualquier exceso de alambre que permanezca sobresaliendo de la parte superior de la tapa.En primer lugar, gire los tornillos de microaccionamiento en sentido contrario a las agujas del reloj hasta su posición más baja. A continuación, monte de forma segura el microaccionamiento en una abrazadera que permitirá el descenso de las puntas de los electrodos en la solución chapada en oro. Llene una torre de delrin con solución de oro CCO y la otra torre con agua destilada y baje las puntas de los electrodos en la solución de oro.A continuación, abra el programa Nano Z y haga clic en galvanoplastia de CC. Establezca el modo para que coincida con las impedancias, la corriente de recubrimiento a menos 1,0 microamperios y el objetivo a 350 kilo ohmios a 1004 hercios. A continuación, configúrelo para que se ejecute cinco veces a intervalos de cinco segundos con una pausa de dos segundos entre cada ejecución.Una vez que el programa esté configurado, haga clic en placa automática, el programa primero leerá la impedancia de cada canal. A continuación, aplique la corriente especificada a ese canal, vuelva a probar la impedancia y aplique la corriente según sea necesario hasta que se alcance la impedancia objetivo o un valor inferior. Si la impedancia cae por debajo de 100 kilo ohmios, invierta la polaridad actual a 1,0 microamperios positivos para eliminar el exceso de partículas de oro y luego repita la galvanoplastia. Los valores típicos de impedancia final en un paquete de cuatro cables de 12,5 micrómetros oscilan entre 150 y 325 kilo ohmios.Una vez que todos los canales se hayan plateado a un nivel de impedancia aceptable, cierre el programa Nano Z y desconecte el dispositivo. A continuación, levante los electrodos de la solución de recubrimiento y baje las puntas en la torre de delrin de agua destilada para enjuagar el exceso de partículas de oro Grabaciones neuronales representativas utilizando el micro drive para medir los potenciales de campo local del ratón. Aquí se muestran los ulu dorsales.Los cuatro canales que se muestran en la parte A son un ejemplo de una señal mal conectada a tierra que da como resultado valores saturados y señales extremadamente ruidosas. Sin embargo, los cuatro canales que se muestran en la parte B son un buen ejemplo de una señal bien conectada a tierra con oscilaciones de red claramente visibles en el rango theta de cuatro a 12 hercios. A la izquierda hay un ejemplo de una mala grabación de Tero.Debido a que los cuatro cables de electrodos han registrado formas de onda de pico esencialmente idénticas, más de mil formas de onda de pico individuales se superpusieron una encima de la otra para cada canal de los teros. Este patrón probablemente se debió a la fusión de los cables durante el paso de fusión del aislamiento de la fabricación del tero, lo que hizo que el haz de cables actuara efectivamente como un solo electrodo de registro. A la derecha hay un ejemplo de una buena grabación de tetro que muestra formas de onda de pico superpuestas de una unidad putativa con diferentes amplitudes a través de los cuatro cables de tede.Este tipo de patrón de registro de picos permite mejorar la discriminación de unidades durante la agrupación y separación posteriores fuera de línea. Después de construir esta micro inmersión, es importante probar cada uno de los canales de electrodos y asegurarse de que estén dentro de un rango de impedancia adecuado antes de pasar a la cirugía de implantación. Después de ver este video, debería sentirse cómodo construyendo teros y microelectrodos para la implantación crónica en el ratón.Buena suerte construyendo tus unidades y diviértete con tus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

En este protocolo, se muestra cómo fabricar una serie de micro-disco de crónica registros electrofisiológicos en las ratas.

Micro-array de unidades de crónicos In vivo Grabación: Unidad de Fabricación

En este protocolo, se muestra cómo fabricar y tetrodos condición para su uso con una amplia micro-drive, que fue diseñado para la crónica registros electrofisiológicos en las ratas. Además, se ilustran las etapas finales de construcción de micro-array de unidad, que incluye la instalación de cables de tierra y un cono de protección.

Micro-array de unidades de crónicos In vivo Grabación: Tetrodo Asamblea

El diseño, la fabricación y el montaje de un microdrive ultraligero motorizado se describe. El dispositivo proporciona una solución rentable y fácil de usar para las grabaciones crónicas de unidades individuales en pequeños animales que se comportan.

Diseño y montaje de un Microdrive ultraligero motorizado para crónicos Grabaciones neuronales en Pequeños Animales

El video muestra la grabación electrofisiológica simultánea de múltiples regiones del cerebro en una rata utilizando una matriz de micro-unidades integradoras. Los electrodos de registro se colocan en el bulbo olfatorio, los electrodos de referencia en la corteza frontal y los electrodos de matriz de microaccionamiento en el hipocampo. Se permite que la rata se alimente libremente, y el registro simultáneo de todos los electrodos implantados se registra utilizando la matriz.

Un método de matriz de microunidades para el registro electrofisiológico de múltiples regiones del cerebro

Comprender los sustratos neuronales del comportamiento requiere la grabación de un conjunto de circuitos cerebrales. Debido a su trazabilidad genética, el ratón ofrece un modelo para la disección de circuitos y el mimetismo de enfermedades. Aquí, se describe un método de diseño y fabricación de sondas miniaturizadas que es adecuado para apuntar a la estructura cerebral profunda en el ratón.

Diseño y fabricación de Ultralight Peso, ajustables Sondas Multi-electrodos para electrofisiológicos grabaciones en ratones

Presentamos la construcción de un hiperimpulsor 3D imprimibles con dieciocho tetrodos independientemente ajustables. El hiperimpulsor está diseñado para registrar la actividad cerebral en comportarse libremente las ratas durante un período de varias semanas.

Construcción de un hiperimpulsor mejorado del tetrodo múltiples de grabación Neural a gran escala en comportarse ratas

Este protocolo describe la construcción de una matriz híbrida de micromotores que permite la implantación de nueve tetrodios ajustables de forma independiente y una sonda de optosilicio ajustable en dos regiones cerebrales en ratones que se mueven libremente. También se ha demostrado un método para recuperar y reutilizar de forma segura la sonda de optosilicio para múltiples propósitos.

Sistema microdrive híbrido con sonda de optosilicio recuperable y tetroda para grabación de alta densidad de doble sitio en ratones en movimiento libre

Este protocolo describe un procedimiento para construir matrices de microelectrodos de fibra de carbono para registros electrofisiológicos in vivo crónicos y agudos en ratones(Mus musculus)y hurones(Mustela putorius furo) de múltiples regiones cerebrales. Cada paso, después de la compra de fibras de carbono en bruto para la implantación de matrices de microelectrodos, se describe en detalle, con énfasis en la construcción de matrices de microelectrodos.

Construcción e implementación de matrices de microelectrodos de fibra de carbono para grabaciones in vivo crónicas y agudas

Aquí, describimos un diseño de micro-impulso, procedimiento de implantación quirúrgica y estrategia de recuperación postoperatoria que permiten grabaciones crónicas de campo y de una sola unidad de múltiples regiones cerebrales simultáneamente en ratones juveniles y adolescentes a través de una ventana crítica de desarrollo desde el día postnatal 20 (p20) hasta el día postnatal 60 (p60) y más allá.

Un implante de accionamiento ligero para grabaciones crónicas de tetrodos en ratones jóvenes

El protocolo describe la metodología de registro extracelular en la corteza motora (MC) para revelar propiedades electrofisiológicas extracelulares en ratones conscientes que se mueven libremente, así como el análisis de datos de potenciales de campo local (LFP) y picos, lo que es útil para evaluar la actividad neuronal de la red que subyace a los comportamientos de interés.

Grabación extracelular multicanal en ratones que se mueven libremente

Aquí, presentamos un sistema de implante de sonda liviano y rentable para electrofisiología crónica en roedores optimizado para la facilidad de uso, la recuperación de la sonda, la versatilidad experimental y la compatibilidad con el comportamiento.

El implante DREAM: un sistema de implantes ligero, modular y rentable para la electrofisiología crónica en ratones de cabeza fija y de comportamiento libre

Aprende a construir matrices microdrive para grabaciones neuronales crónicas en ratones despiertos y en comportamiento libre. Este método permite registrar actividad de poblaciones neuronales con alta relación señal-ruido.

Construcción de Matrices Microdrive para grabaciones neuronales crónicas en Awake Ratones Behaving

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