Construcción de Matrices Microdrive para grabaciones neuronales crónicas en Awake Ratones Behaving

El objetivo general de este procedimiento es construir un micro impulsor que pueda usarse para grabaciones cerebrales en ratones mientras se mueven libremente dentro de una cámara experimental. Esto se logra preparando primero un haz de cuatro microelectrodos en un tede. El segundo paso es construir la base de la microunidad y ensamblar los componentes de la unidad.

A continuación, los tetros se conectan a la unidad y se conectan a alfileres de oro. El paso final es chapar en oro la punta de los tetros para reducir su impedancia y garantizar grabaciones de alta señal a ruido. En última instancia, las matrices de microimpulsores crónicos se utilizan para registrar la actividad neuronal de las poblaciones de neuronas, así como de las neuronas individuales en animales que se comportan despiertos.

La principal ventaja de esta técnica es que ofrece una solución bastante barata y de ondas ligeras para las grabaciones cerebrales crónicas en ratones y otros pequeños mamíferos. Esta tecnología puede abordar cuestiones clave en el campo de la neurociencia, como la forma en que las neuronas codifican la información durante la realización de tareas conductuales. Empleamos regularmente esta técnica para registrar las neuronas del hipocampo dorsal y ulu, pero también la hemos utilizado para apuntar a estructuras más profundas como la amígdala.

La demostración visual de este método es crucial ya que la construcción y la parte de montaje son difíciles de aprender, y también porque se trata de una pieza muy pequeña y delicada para comenzar la fabricación de tetro. Para el hipocampo, corte 30 centímetros de alambre aislado de platino iridio con núcleo de 12,5 micrómetros de diámetro, doble el alambre dos veces para formar cuatro alambres paralelos, cada uno de 7,5 centímetros de longitud. A continuación, coloque un clip recubierto de goma cerca de la parte inferior del cable drapeado y conéctelo al girador de tetro motorizado, asegurándose de que el cable esté tenso pero no demasiado tenso o que el peso del soporte haga que se rompa.

Durante el proceso de centrifugado, aplique 80 rotaciones en el sentido de las agujas del reloj para enrollar el tero, seguidas de 20 rotaciones en el sentido contrario a las agujas del reloj para liberar la tensión. El número final de rotaciones por longitud de alambre debe ser de ocho rotaciones por micra. A continuación, configure la pistola de calor a 400 grados centígrados y utilícela para fusionar los cables.

Pase la pistola de calor hacia arriba y hacia abajo a lo largo de los cables durante cinco segundos, manteniéndola aproximadamente a dos centímetros del cable en todo momento. Para derretir suavemente el recubrimiento de unión VG en los cables, corte la parte superior del tero para formar cuatro alambres separados y luego suelte el extremo inferior del clip. Coloque el tero completado en una caja de retención libre de polvo para guardarlo hasta que se haya completado la unidad.

Primero, construya la base para el micro disco lijando una pieza cuadrada de plexiglás acrílico de 20 milímetros que tiene cinco milímetros de grosor en una forma que permitirá que el mouse se mueva libremente con el disco después de que se implante en la cabeza. A continuación, suelde dos guías de latón de 3,3 por 6,3 milímetros juntas perpendicularmente. La guía vertical de latón sujetará el tornillo de accionamiento y los electrodos, mientras que la pieza horizontal se pegará a la base acrílica.

A continuación, comience el montaje de la propia unidad pasando un tornillo pecheral de cabeza de relleno a través de la parte superior de la guía y en un bloque de plástico delrin. Enrosque una pechuga hexagonal en el tornillo hasta que la tuerca esté casi tocando la parte inferior de la guía. Sin embargo, no lo apriete completamente.

En su lugar, derrita una pequeña cantidad de soldadura para unir la tuerca y el tornillo. Pero tenga cuidado de no soldar nada a la guía. Al girar el tornillo, el bloque de delrin debe mover el bloque de delrin en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj verticalmente a lo largo de la rosca.

Una vez que se haya ensamblado la unidad, regrese a la base acrílica y corte una ranura de tres milímetros de ancho donde estará la unidad del electrodo. A continuación, pase la guía horizontal del sujetador a través de la ranura y luego utilice el pegamento Sano ACRL para fijar la pieza a la base. A continuación, coloque una placa de interfaz electrónica en la parte superior de la base y, para marcar las ubicaciones de los dos orificios de los tornillos con un taladro de punta de 1,5 milímetros, taladre con cuidado los orificios en las marcas de los tornillos que mantendrán el EIB en su lugar en la parte superior de la base.

A continuación, enrosque dos tornillos de pecho en los agujeros. Utilice unas tijeras de microdisección para cortar cuatro trozos de tubo de poliamida de siete milímetros de largo. Alinéalos uno al lado del otro en un trozo de cinta de laboratorio doblada y aplica sano ACRL para unirlos.

Deje suficiente tiempo para que los tubos de unión se sequen por completo. A continuación, frote con cuidado una pequeña cantidad de cianocrilato en la cara de delrin. A continuación, coloque los cuatro tubos de unión sobre el pegamento.

Nuevamente, deje suficiente tiempo para que el pegamento se fije por completo antes de intentar mover la unidad. Compruebe que los tubos de poliamida estén bien fijados y que todo el conjunto se mueva suavemente sin tocar la guía ni encontrar ninguna resistencia. A continuación, prepare el tornillo de tierra y conecte el cable de tierra al EIB como se describe en el protocolo de texto adjunto.

Conecte los tetros y/o electrodos individuales al EIB pasando primero los cables a través del tubo de poliamida, permitiendo que se extiendan al menos dos milímetros más allá del extremo del tubo. A continuación, aplique una pequeña gota de cianocrilato, fijando el alambre al tubo y evitando cualquier movimiento del cable. A continuación, conecte los extremos sueltos del tero u otros cables a un orificio del canal EIB con un alfiler de oro.

Finalmente, recorte el exceso de alambre con las tijeras finas que se muestran. A continuación, se muestran ejemplos de otras configuraciones de unidades que se pueden construir para dirigirse a diferentes regiones del cerebro. Para empezar, ensamble de la unidad.

Corta el tubo de poliamida a 10 milímetros y guíalo a través del orificio más pequeño de un portador de tetro hasta que se extienda 0,5 milímetros más allá del extremo. A continuación, coloque el tubo de poliamida en su lugar y repita estos pasos para los otros tres tubos y soportes. Después de que el epoxi se haya endurecido por completo.

Guíe cada tubo de poliamida a través de uno de los cuatro orificios de la base de la transmisión Versa. A continuación, empuje un alfiler de insecto a través del orificio exterior. Esto mantendrá al portador tetro en línea y servirá como riel para que el portador viaje.

Repita esto para los otros tres portadores. A continuación, tome una tapa y alinéela con los cuatro alfileres de insectos para que la tapa cubra la base y los portadores de tero residan dentro de la tapa. Enrosque un tornillo de máquina de un milímetro por cinco milímetros a través del orificio apropiado en la tapa y en el portaobjetos.

Repita esto para los otros tres tornillos. Gire todos los tornillos en el sentido de las agujas del reloj hasta que los portadores de tetro estén en su posición superior y los tubos de poliamida sean visibles a través de la abertura de la tapa. Con unas tijeras finas de microdisección, corte el tubo justo debajo de la base para que los cuatro tubos de poliamida tengan la misma longitud.

A continuación, utilice un microscopio de disección para pasar cuidadosamente los tetros a través de los tubos de poliamida y asegúrelos en su lugar con una pequeña gota de anoato. A continuación, corta los tetros de forma que sólo se extiendan 2,0 milímetros más allá de los tubos. Antes de conectar los cables tero a los receptáculos dorados.

Primero, conecte los cables de tierra a la tapa. A continuación, guíe todos los cables de tero sueltos a través de sus respectivos orificios de receptáculo en la tapa e instale la tapa alineando los orificios de los pasadores de insectos y presione el accesorio a la base. Finalmente, recorte cualquier exceso de alambre que permanezca sobresaliendo de la parte superior de la tapa.

En primer lugar, gire los tornillos de microaccionamiento en sentido contrario a las agujas del reloj hasta su posición más baja. A continuación, monte de forma segura el microaccionamiento en una abrazadera que permitirá el descenso de las puntas de los electrodos en la solución chapada en oro. Llene una torre de delrin con solución de oro CCO y la otra torre con agua destilada y baje las puntas de los electrodos en la solución de oro.

A continuación, abra el programa Nano Z y haga clic en galvanoplastia de CC. Establezca el modo para que coincida con las impedancias, la corriente de recubrimiento a menos 1,0 microamperios y el objetivo a 350 kilo ohmios a 1004 hercios. A continuación, configúrelo para que se ejecute cinco veces a intervalos de cinco segundos con una pausa de dos segundos entre cada ejecución.

Una vez que el programa esté configurado, haga clic en placa automática, el programa primero leerá la impedancia de cada canal. A continuación, aplique la corriente especificada a ese canal, vuelva a probar la impedancia y aplique la corriente según sea necesario hasta que se alcance la impedancia objetivo o un valor inferior. Si la impedancia cae por debajo de 100 kilo ohmios, invierta la polaridad actual a 1,0 microamperios positivos para eliminar el exceso de partículas de oro y luego repita la galvanoplastia. Los valores típicos de impedancia final en un paquete de cuatro cables de 12,5 micrómetros oscilan entre 150 y 325 kilo ohmios.

Una vez que todos los canales se hayan plateado a un nivel de impedancia aceptable, cierre el programa Nano Z y desconecte el dispositivo. A continuación, levante los electrodos de la solución de recubrimiento y baje las puntas en la torre de delrin de agua destilada para enjuagar el exceso de partículas de oro Grabaciones neuronales representativas utilizando el micro drive para medir los potenciales de campo local del ratón. Aquí se muestran los ulu dorsales.

Los cuatro canales que se muestran en la parte A son un ejemplo de una señal mal conectada a tierra que da como resultado valores saturados y señales extremadamente ruidosas. Sin embargo, los cuatro canales que se muestran en la parte B son un buen ejemplo de una señal bien conectada a tierra con oscilaciones de red claramente visibles en el rango theta de cuatro a 12 hercios. A la izquierda hay un ejemplo de una mala grabación de Tero.

Debido a que los cuatro cables de electrodos han registrado formas de onda de pico esencialmente idénticas, más de mil formas de onda de pico individuales se superpusieron una encima de la otra para cada canal de los teros. Este patrón probablemente se debió a la fusión de los cables durante el paso de fusión del aislamiento de la fabricación del tero, lo que hizo que el haz de cables actuara efectivamente como un solo electrodo de registro. A la derecha hay un ejemplo de una buena grabación de tetro que muestra formas de onda de pico superpuestas de una unidad putativa con diferentes amplitudes a través de los cuatro cables de tede.

Este tipo de patrón de registro de picos permite mejorar la discriminación de unidades durante la agrupación y separación posteriores fuera de línea. Después de construir esta micro inmersión, es importante probar cada uno de los canales de electrodos y asegurarse de que estén dentro de un rango de impedancia adecuado antes de pasar a la cirugía de implantación. Después de ver este video, debería sentirse cómodo construyendo teros y microelectrodos para la implantación crónica en el ratón.

Buena suerte construyendo tus unidades y diviértete con tus experimentos.