Name: Una preparación semi-intacta aislada del ratón epitelio sensorial vestibular de Electrofisiología y de alta resolución de la microscopía de dos fotones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Aprende a preparar el epitelio vestibular semi-intacto del ratón para estudios de electrofisiología y microscopía de dos fotones. Este método permite analizar propiedades de membrana y señalización de calcio en células ciliadas vestibulares.

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La financiación de este trabajo fue proporcionado por un Passe Garnett y Williams subvención Proyecto Memorial Foundation Rodney R. Lim y AJ Camp.

1. Animales <ol><li> Los ratones se obtuvieron del Centro de roedores Australiano (ARC, Perth, Australia) y se mantuvieron en la Universidad de Sydney Bosch Animalario en un ciclo de luz / oscuridad de 12 horas normal con enriquecimiento ambiental. Todos los experimentos descritos fueron aprobados por la Universidad de Sydney Comité de Ética Animal. </li><li> Ratones machos y hembras (C57/Bl6) se utilizaron para todos los experimentos ya que esta cepa se utiliza comúnmente como el fondo para la manipulación genética, y pueden considerarse equivalentes a wildtype 8-9. </li></ol> 2. Preparación del tejido <ol><li> Preparar 300 ml de un fluido artificial basado en glicerol cefalorraquídeo (ACSF) formado por (en mM): 26 NaHCO3, 11 de glucosa, 250 glicerol, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 1,2 MgCl2, CaCl2 y 2.5. Antes de la adición de CaCl2, gas de la solución con carbógeno (95% de O2 y 5% de CO 2) para establecer APH de 7,4 y evitar la precipitación de calcio (nubosidad). Congelar la solución en un congelador a -80 ° C durante 45 min de manera que se forma una suspensión de hielo. </li><li> Profundamente anestesiar a los ratones con ketamina (100 mg / kg) (Parnell, Alejandría, Australia) a través de una inyección intra-peritoneal. </li><li> Una vez reflejos pizca extremidades posteriores son ratones decapitar ausentes utilizando tijeras afiladas de acero inoxidable y hacer una incisión sagital con una hoja de afeitar (redondeado # 22) para exponer el cráneo. En este punto ya lo largo de los pasos 02.03 a 02.08 de la bóveda craneal, cerebro y aparato vestibular subyacente debe mantenerse lo más fresco posible por la aplicación regular de ACSF helada sobre el tejido. </li><li> Usando el brazo puntas de las tijeras del dibujo estándar (FST, North Vancouver, Canadá) hacer una pequeña incisión en el cráneo en Lambda y se corta a lo largo de la sutura sagital. Asegúrese de que el cerebro no se &quot;arrastrado&quot; por la cuchilla de cizalla durante este paso. </li><li> Retire con cuidado los huesos parietales de distancia lateral y el hueso occipital posteriorly con baja curva pearson gubia (FST). </li><li> Una pequeña espátula de acero inoxidable se utiliza a continuación para levantar suavemente el cerebro de la superficie de la fosa craneal media y posterior, y el nervio vestibulocochlea expuesta (CNVIII) cortada a medio camino entre el oído interno y el tronco cerebral con un par de tijeras iris finas. Cortar este nervio minimiza la tensión indebida en los axones de las fibras aferentes primarias y sus conexiones con las células ciliadas. </li><li> Después de la sección transversal del CN VIII del cerebro se elimina en su totalidad. </li><li> El laberinto vestibular es ahora claramente visible en la fosa craneal media, con la cóclea apunta anteromedialmente. Pinzas gubias de cada lado de la laberinto vestibular antes de la escisión suavemente agarrando el canal semicircular anterior y tirando lateralmente. </li><li> Sumerja los laberintos extirpados (Figura 1) en un plato de disección que contiene la ACSF helada, gaseado continuo descrito en la sección 2.1. Bajo un microscopio estereoscópico, mantenga el laberinto dela base del plato de agarre por la cóclea. Utilice unas pinzas finas para rascarse lejos en el hueso que cubre la ampolla del canal semicircular anterior. Una vez que se consigue un pequeño agujero en el hueso comenzar a chasquear el hueso fuera de la ampolla. Se debe tener cuidado de no empujar la pinza a través del hueso ya que esto puede causar daños en el laberinto membranoso subyacente y el epitelio sensorial. Continúe con este procedimiento hasta tanto el anterior y los conductos semicirculares membranosos horizontales adyacentes y ampollas están expuestos (Figura 2). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig1.jpg" /> Figura 1. El aislado del ratón laberinto vestibular. A. El panel izquierdo) Representación esquemática de los aislados del ratón laberinto vestibular. Los puntos importantes de referencia para acceder al epitelio sensorial vestibular, la cóclea, anterior y horizontal canales semicirculares son de laboratorioeLED. Los asteriscos indican la ampolla del canal semicircular que contiene el epitelio sensorial vestibular. B. Panel de la derecha) Fotomicrografía de la laberinto vestibular aislado de un ratón de 1 mes de edad. <img alt="La figura 2" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig2.jpg" /> Figura 2. Exposición del laberinto vestibular membranoso. El hueso que recubre la ampolla del canal semicircular anterior y horizontal han sido rayado para revelar las ampollas membranosas negro / marrón con manchas y los nervios ampulares asociados (CNVIII). El esquemática en el panel inferior representa las estructuras en la región resaltada de la microfotografía y muestra la relación de los conductos del conducto semicircular a las ampollas y CNVIII. <ol start="10"><li> Con unas pinzas finas, levante suavemente las ampollas y utrículo asociado lejos del laberinto óseo, asegurando que la región central de las ampollas (contanando el epitelio sensorial) no está dañado. En algunos casos, la parte proximal del conducto semicircular membranosa puede ser necesario cortar con unas tijeras iris para liberar las ampollas de la médula. </li><li> Transferir la tríada que contiene los dos ampollas y utrículo en una placa de Petri llena de L-15 de Leibovitz medio de cultivo (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Use una fibra óptica para &quot;backlight&quot; el tejido. Esto permite una visualización clara de la cresta que contiene el epitelio sensorial dentro de las ampollas. </li><li> Con cuidado de una incisión en el &quot;techo&quot; moteado del utrículo con las finas tijeras iris. Continuar esta incisión a través del techo de la anterior y a continuación, las ampollas horizontal. Hacer la incisión lo más cerca posible del borde del epitelio sensorial como sea posible sin contacto con él (Figura 3A). Asegúrese de que no queden trozos de membrana que recubre el epitelio sensorial (Figura 3B) </li><li> Transferir la preparación intacta semi aislado de una pequeña glascámara de registro s de fondo lleno de L-15 medios de comunicación. Pesar abajo de la preparación utilizando una rejilla de fibras de nylon finas fijadas a un alambre de platino en forma de U aplanada (Figura 3B). Idealmente, las fibras de la red no deben superponerse el epitelio sensorial, sin embargo, en algunos casos donde se requiere una mayor estabilidad, una sola fibra transección del epitelio sensorial tal vez preferido. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig3.jpg" /> Figura 3. El aislado preparación semi-intacta del epitelio. A. Representación esquemática sensorial vestibular de la preparación semi-intacta y configuración de los electrodos. La ampolla que cubre la cresta ha sido &quot;de-techo&quot; para exponer la superficie del epitelio sensorial (verde). B. Microfotografía de la semi-intacta preparación &quot;tríada&quot; que muestra el anterior (ac) y horizontal (hc) crista (utrículo oscurecido serhind ac). Tenga en cuenta la fibra de nylon utilizado para asegurar la preparación de la base de la cámara de registro. Barra de escala:. 100 micras C. Un electrodo de registro colocado en una celda de pelo vestibular individual. Barra de escala: 15 m. 3. Electrofisiología <ol><li> Perfundir la preparación semi-intacta con oxigenada continuamente medio L-15. Los medios de comunicación contiene un indicador de pH (rojo de fenol) y el color del medio deben ser controlados a través de las grabaciones. El pH con el oxígeno debe ser 7.3 a 7.4 y corresponden a un color rojo. </li><li> Preparar las pipetas de registro de 1,5 mm (1,19 mm ID) de vidrio de borosilicato usando un protocolo de dos pasos (paso de calentamiento 1: 72, y el paso de calor 2: 50) en un extractor de micropipeta (Narishige, Japón, modelo PP-830) para lograr una impedancia de final 3-4 mW. </li><li> Llenar el vástago de la pipeta con 3-4 mm de potasio solución interna con base de fluoruro que contiene (en mM) 110 KF, KCl 12, 27 KOH, 1 NaCl, 10 HEPES, 10 EGTA, 1,8 MgCl 2,3 D-glucosa, 2 y Na-ATP, pH 7,4 con KOH. </li><li> Envolver el vástago de la pipeta 2-3 veces y lo más abajo de la punta como sea posible con una tira delgada de parafina para aislar el electrodo y reducir la capacitancia pipeta. </li><li> Coloque la pipeta en el epitelio sensorial bajo aumento de potencia (5X) en un microscopio vertical (Olympus BX51). Cambie a alta potencia (40X) y visualizar las células ciliadas vestibulares individuales con una cámara CCD adjunta. </li><li> Posición pipeta sobre la membrana de una célula de pelo visualizaron (Figura 3C) usando un micromanipulador (Sutter Instruments, California, EE.UU.). Una vez que se logra un sellado gigaohmio, la ruptura de la membrana celular con una pequeña cantidad de presión negativa aplicada a través de un puerto de succión en el soporte de pipeta. </li><li> Realiza grabaciones de fijación de voltaje de células enteras utilizando técnicas estándar 8-9. </li></ol> 4. Dos fotones Microscopía <ol><li> Preparar una solución salina al 0,9% que contiene 5 mM de Oregon Green488 BAPTA-1 (OGB-1; sal hexapotassium; Invitrogen, Alemania). </li><li> Aunque todavía sumergido, coloque el &quot;de-techo&quot; preparación tríada semi-intacta en un pequeño trozo de papel de filtro (4x4 mm, 0,8 m de espesor; Millipore, Alemania) asegurarse de que el epitelio sensorial está obstruida desde arriba. </li><li> Transferir el papel de filtro y la preparación sobre el electrodo de platino base de solución salina cubierta (7 l) de un electroporador que consiste en la combinación de un generador de impulsos y un amplificador de banda ancha, y la cubierta con un 5 l de solución 5 mM de calcio sintético colorante indicador de Oregon Green 488 BAPTA-1 (Figura 4). </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50471/50471fig4.jpg" /> La Figura 4. Electroporación granel. A. esquemática en sección transversal de configuración que muestra la electroporación. La preparación semi-intacta (*) se coloca en un trozo de papel de filtro sumergido en dy calcioe (Oregon Green 488 BAPTA-1) y la corriente aplicada entre 2 electrodos de platino. Adaptado de Briggman y Euler, 2011 10. <ol start="4"><li> Traer la parte superior paralelo electrodo de platino con el electrodo de base a una distancia de aproximadamente 2 mm, teniendo cuidado de no perturbar la orientación de la preparación, cuando el contacto con el verde 488 BAPTA-1 solución de Oregon recibe. </li><li> Pasar un breve impulso de corriente a través de la preparación (Parámetros para la corriente; 13 V, 10 mseg de anchura de pulso, frecuencia 1 Hz, 10 pulsos de onda cuadrada) 10-11. </li><li> En la parte inferior de una cámara de registro con fondo de vidrio lleno de medio L-15, colocar una pequeña gota de aceite de silicona y la posición de la preparación semi-intacta en él, de nuevo asegurándose de que el epitelio sensorial es sin obstrucciones desde arriba. Para garantizar la estabilidad en toda la imagen, vuelva a colocar la rejilla de nylon en la preparación como se describe anteriormente (véase el punto 2.13). </li><li> El uso del microscopio de dos fotones realizar grabaciones ópticas de esponla actividad del calcio nea en el epitelio sensorial (Figura 7), utilizando protocolos estándar de imaginología, 10-11. </li></ol>

<ol><li>Dulon, D., Safieddine, S., Jones, S. M., Petit, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otoferlin+is+critical+for+a+highly+sensitive+and+linear+calcium-dependent+exocytosis+at+vestibular+hair+cell+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Otoferlin is critical for a highly sensitive and linear calcium-dependent exocytosis at vestibular hair cell ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 29, 10474-10487 (2009).</li>
<li>Simultaneous pre- and post-synaptic recording from the peripheral vestibular calyx and its included type I hair cell. Highstein, S., Art, J., Holstein, G., Rabbitt, R. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).</li>
<li>Voltage dependent currents in type I and II hair cell and calyx terminals of primary afferents in an intact in vitro mouse vestibular crista preparation. Kindig, A. E., Lim, R., Callister, R. J., Brichta, A. M. 32nd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Baltimore, MD, , (2009).</li>
<li>Chatlani, S., Goldberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recordings+from+calyx+endings+in+the+turtle+posterior+crista%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recordings from calyx endings in the turtle posterior crista.</a> 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).</li>
<li>Songer, J. E., Eatock, R. A. Transduction in the mammalian saccule. 33rd Mid Winter Research Meeting: Association for Research in Otolaryngology, Anaheim, , (2010).</li>
<li>Lee, H. Y., Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vestibular+primary+afferent+activity+in+an+in+vitro+preparation+of+the+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Vestibular primary afferent activity in an in vitro preparation of the mouse inner ear.</a> J. Neurosci. Methods. 145, 73-87 (2005).</li>
<li>Lim, R., Kindig, A. E., Donne, S. W., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+accumulation+between+type+I+hair+cells+and+calyx+terminals+in+mouse+crista%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Potassium accumulation between type I hair cells and calyx terminals in mouse crista.</a> Exp. Brain Res. 210, 607-621 (2011).</li>
<li>Camp, A. J., Callister, R. J., Brichta, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+synaptic+transmission+differs+in+mouse+type+A+and+B+medial+vestibular+nucleus+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory synaptic transmission differs in mouse type A and B medial vestibular nucleus neurons in vitro.</a> J. Neurophysiol. 95, 3208-3218 (2006).</li>
<li>Camp, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+glycine+receptor+function+reduces+excitability+of+mouse+medial+vestibular+nucleus+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Attenuated glycine receptor function reduces excitability of mouse medial vestibular nucleus neurons.</a> Neuroscience. 170, 348-360 (2010).</li>
<li>Briggman, K. L., Euler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+electroporation+and+population+calcium+imaging+in+the+adult+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 105, 2601-2609 (2011).</li>
<li>Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wiring+specificity+in+the+direction-selectivity+circuit+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina.</a> Nature. 471, 183-188 (2011).</li>
<li>Rennie, K. J., Streeter, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+currents+in+isolated+vestibular+afferent+calyx+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent currents in isolated vestibular afferent calyx terminals.</a> J. Neurophysiol. 95, 26-32 (2006).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li>
<li>Rennie, K. J., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+currents+in+isolated+vestibular+hair+cells+from+the+guinea-pig+crista+ampullaris%5BTitle%5D)+AND+%22Hear.+Res%22%5BJournal%5D)">Ionic currents in isolated vestibular hair cells from the guinea-pig crista ampullaris.</a> Hear. Res. 51, 279-291 (1991).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Los mecanismos que subyacen a nuestro sentido del equilibrio han recibido poca atención en comparación con otros sistemas sensoriales, por ejemplo, los sistemas visual y auditivo. De los estudios que han investigado los cambios en la función vestibular o el balance, la mayoría se han centrado en medidas conductuales como el reflejo vestíbulo-ocular, con un conocimiento incompleto de los pilares fundamentales de la balanza de las propias células ciliadas vestibulares de construcción. Los estudios que se han conc...

A pesar de la importante contribución del sistema vestibular en nuestra vida diaria, una clara comprensión de los procesos responsables de la disminución observada en la función vestibular con la edad, siendo difícil de alcanzar. Una razón para esta falta de conocimiento es que la disminución de la función vestibular ha sido casi exclusivamente explorado el uso de ensayos de comportamiento, incluyendo el reflejo vestíbulo-ocular (VOR), un indicador preciso de la función vestibular extrínseca, pero proporciona información limitada sobre los cambios de los componentes intrínsecos . Esto es un obstáculo importante para nuestra comprensión de la función de las células ciliadas vestibulares en la salud, la enfermedad o el envejecimiento. Aunque ha habido muchos estudios sobre las células ciliadas vestibulares individuales, una deficiencia importante ha sido la dependencia de las preparaciones de células de cabello agudos, en los que las células capilares y terminales aferentes incluso cáliz son retirados de su ambiente normal mediante tratamiento mecánico y / o enzimática. Tal enfoques inevitablea perturbar el delicado microarquitectura entre las células ciliadas y del cáliz, y el pelo de células y células de apoyo. Con el desarrollo de preparaciones semi-intacta 1-5, y un ratón aislado preparación laberinto 6, ahora existe la oportunidad de estudiar las distintas formas de comunicación sináptica en condiciones que se parecen más a los de vivo. En efecto, Lim et al. (2011) mostró marcadas diferencias en las corrientes de células enteras grabadas de tipo agudo aislado células ciliadas vestibulares I en comparación con aquellos que permanecieron incrustados dentro del neuroepitelio. Específicamente, se cree potasio a acumularse en el espacio intercelular, entre la célula de pelo y cáliz aferente, y altera significativamente la respuesta de la célula de pelo 7. Este tipo de información sería imposible de obtener sin la preparación semi-intacta del epitelio sensorial vestibular se describe aquí. Se demuestra la preparación semi-intacta del ratón crista 3, Y muestran resultados representativos obtenidos de parche de células enteras de electrofisiología y de imágenes de calcio de dos fotones.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>REACTIVOS</fuerte></td></tr><tr><td>Leibovitz medio L-15</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA-1-oregon verde</td><td>Invitrogen</td><td>O6806</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT </td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica Microsystems</td><td>A60S</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio vertical</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de dos fotones</td><td>Olympus/La Vision</td><td>BX51WI/ TriMScope II</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Dumont #5 SF</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs</td><td>FST</td><td>16221-14</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de patrón estándar</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>InstraTECH Convertidor A-D</td><td>HEKA</td><td>ITC-18</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Micromanipulador</td><td>Sutter</td><td>MP-225/M</td><td></td></tr><tr><td>amplificador multiclamp</td><td>Axon Instruments</td><td>700B</td><td></td></tr><tr><td>Software de adquisición de datos (electrofisiología)</td><td>Axograph</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Imspector Software de adquisición de datos (dos fotones)</td><td>Max Planck</td><td>innovation N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

una preparación semi-intacta aislada del ratón epitelio sensorial vestibular de electrofisiología y de alta resolución de la microscopía de dos fotones

An Isolated Semi-intact Preparation of the Mouse Vestibular Sensory Epithelium for Electrophysiology and High-resolution Two-photon Microscopy

Comprensión de las células ciliadas vestibulares funcionan en condiciones normales, o cómo el trauma, la enfermedad y el envejecimiento interrumpir esta función es un paso vital en el desarrollo de enfoques preventivos y / o nuevas estrategias terapéuticas. Sin embargo, la mayoría de los estudios en busca de la función vestibular anormal no han sido a nivel celular pero centrado principalmente en ensayos de comportamiento de la disfunción vestibular, tales como los análisis de la marcha y el rendimiento reflejo vestíbulo-ocular. Si bien este trabajo ha dado información valiosa sobre lo que sucede cuando las cosas van mal, hay poca información obtenida sobre las causas subyacentes de la disfunción. De los estudios que se centran en los procesos celulares y subcelulares que subyacen a la función vestibular, la mayoría han confiado en forma aguda las células ciliadas aislados, desprovistos de sus conexiones sinápticas y el entorno celular de soporte. Por lo tanto, un importante reto técnico ha sido el acceso a las células ciliadas vestibulares exquisitamente sensibles en una preparaciónración que está menos perturbado, fisiológicamente. Aquí se demuestra una preparación semi-intacta del ratón epitelio sensorial vestibular que conserva el micro-entorno local, incluyendo las células ciliadas / complejos aferentes primarias.

Las propiedades electrofisiológicas de las células ciliadas vestibulares dependen de la microarquitectura complejo en el que están incrustados 7. Figura 5 muestra que la preparación epitelio vestibular semi-intacta se puede utilizar para diferenciar entre el tipo de células ciliadas (figura 5A), células de pelo de tipo II que (Figura 5B), y el cáliz del aferente primario (Figura 5C) sobre la base de características conductancias de células en...

Análisis de la función de las células ciliadas vestibulares se complica por su ubicación en lo profundo de la parte más dura del cráneo, hueso temporal pétreo. La mayoría de los estudios de células pilosas funcionales han utilizado intensamente células ciliadas aislados. A continuación se describe una preparación semi-intacta de ratón epitelio vestibular para estudios electrofisiológicos y de microscopía de dos fotones.

Una preparación semi-intacta aislada del ratón epitelio sensorial vestibular de Electrofisiología y de alta resolución de la microscopía de dos fotones

Understanding vestibular hair cells function  under normal conditions, or how trauma, disease, and aging disrupt this  function is a vital step in the ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener una preparación cercana a la normal del epitelio sensorial vestibular de ratón que pueda utilizarse para estudiar los procesos celulares y subcelulares fundamentales de las células ciliadas vestibulares, entre otros. Esto se logra primero aislado el laberinto vestibular óseo de la cavidad craneal. El segundo paso consiste en raspar cuidadosamente el laberinto óseo con pinzas finas para exponer el laberinto membranoso subyacente antes de extraerlo completamente de su envoltura ósea.A continuación, se expone el epitelio sensorial vestibular cortando la membrana sobreyacente con tijeras de iris finas. El paso final consiste en montar la preparación del epitelio sensorial semiíntegro en una cámara con fondo de vidrio y estabilizarla con una red de nailon pesada. Finalmente, se utiliza la electrofisiología de parche en configuración de sello íntegro y la microscopía de dos fotones para caracterizar respectivamente las propiedades intrínsecas de la membrana y el perfil de señalización de calcio de cada tipo de célula ciliar vestibular y/o neurona primaria aferente.Las principales ventajas de esta técnica frente a los métodos existentes, incluidas las preparaciones de células pilosas aisladas, consisten en que podemos mantener la disposición de las células pilosas y sus neuronas aferentes primarias en condiciones lo más cercanas a las normales posible. Esto significa que podemos realizar mediciones en condiciones casi fisiológicas y que podemos llevar a cabo estas mediciones simultáneamente. La demostración visual de este método es fundamental porque la disección es muy difícil de aprender, principalmente porque el aparato vestibular está alojado profundamente dentro del hueso temporal del cráneo y también porque el epitelio sensorial en sí es muy pequeño y fácil de dañar durante la disección.Stefano DeMarco, un colega que trabaja con mi laboratorio, demostrará los procedimientos de electroporación y de dos fotones. Después de anestesiar profundamente y decapitar un ratón C57BL/6 según las normas institucionales y gubernamentales locales y exponer el cráneo, realice una pequeña incisión en el cráneo en el punto Lambda y corte a lo largo de la sutura sagital. Asegúrese de que el cerebro no sea arrastrado por la hoja de corte.Durante este paso, aplique líquido cefalorraquídeo A frío con hielo al cerebro para enfriar el tejido, y luego retire cuidadosamente los huesos parietales hacia lateral y el hueso occipital hacia posterior utilizando pinzas Pearson de curvatura suave. Nuevamente, aplique líquido cefalorraquídeo A frío con hielo. A continuación, use una espátula pequeña de acero inoxidable para levantar suavemente el cerebro desde la superficie de las fosas craneales media y posterior. Ahora el laberinto vestibular es claramente visible en la fosa craneal media, con la cóclea apuntando hacia adelante.Añada medialmente CSF frío con hielo y raju a ambos lados del laberinto vestibular. Luego, excise suavemente el laberinto vestibular sujetando el canal semicircular anterior y tirando lateralmente. Sumerja los laberintos extirpados en una placa de disección que contenga hielo frío.Coloque continuamente gasificada una LCR bajo un microscopio estereoscópico. Este diagrama muestra con detalle el laberinto extraído. A continuación, mientras trabaja bajo el microscopio estereoscópico, sujete la cóclea con pinzas finas y mantenga el laberinto en el fondo del recipiente.Utilice una segunda pinza para raspar el hueso que recubre el ampolla del conducto semicircular anterior. Una vez que se logre un pequeño orificio en el hueso, comience a desprender el hueso del ampolla. Tenga cuidado de no insertar la pinza a través del hueso, ya que esto podría dañar el laberinto membranoso subyacente y el epitelio sensorial.Continúe con este procedimiento hasta que se expongan tanto las membranas semicirculares horizontales anterior y adyacente, los conductos y el pul, como se muestra aquí. Ahora, utilizando pinzas finas, levante suavemente el pul y el útrículo asociado desde el laberinto óseo, asegurándose de que la región central del puli que contiene el epitelio sensorial no resulte dañada. Transfiera el tríada que contiene los dos pule y el útrículo a una placa de Petri llena con medio de cultivo Lebovitz's L 15.Utilice una fibra óptica para iluminar desde atrás el tejido y permitir una visualización clara de la crista que contiene el epitelio sensorial dentro del conducto semicircular. Ahora use las tijeras finas de iris para realizar cuidadosamente una incisión en el techo moteado del ampolla. Lleve la incisión lo más cerca posible del borde del epitelio sensorial sin tocarlo.Como se muestra aquí, asegúrese de que no haya fragmentos de membrana que recubran el epitelio sensorial. Este esquema muestra la forma del preparado final y la colocación del electrodo de registro. Transfiera el preparado semiintacto aislado a una pequeña cámara de registro con fondo de vidrio que contenga medio L 15, fijando el preparado mediante una rejilla de finas fibras de nailon sujeta a un alambre de platino en forma de U aplanado. El tejido ya está listo para las grabaciones electrofisiológicas.Perfunda la preparación semientera con medio L 15 oxigenado continuamente. Asegúrese de que el medio permanezca rojo para indicar un pH con oxígeno entre 7,3 y 7,4. Durante todo el procedimiento, prepare pipetas de registro a partir de tubos con diámetro externo de 1,5 milímetros y diámetro interno de 1,19 milímetros.Obtenga vidrio silicatado utilizando un protocolo de dos pasos en un extractor de micropipetas para lograr una impedancia final de tres a cuatro mega. Rellene el vástago de la pipeta con tres a cuatro milímetros de solución interna a base de fluoruro de potasio. Luego, enrolle el vástago de la pipeta dos a tres veces y todo lo posible hacia la punta con una tira delgada de parafina para aislar el electrodo y reducir la capacitancia de la pipeta.Coloque la pipeta sobre el epitelio sensorial con un aumento de cinco aumentos bajo un microscopio invertido. Cambie a un aumento de 40 aumentos y visualice células ciliadas vestibulares individuales con una cámara CCD acoplada. Utilice el micromanipulador para posicionar la pipeta sobre la membrana de una célula ciliada visualizada.Una vez que se logre un sello gigaohmio, rompa la membrana celular aplicando una pequeña cantidad de presión negativa a través de un puerto de succión en el porta-pipetas y realice grabaciones de clampaje de voltaje en célula completa utilizando técnicas estándar para microscopía de dos fotones. Mantenga el desenfollado casi intacto. Sumerja la preparación y transfiérala sobre un pequeño trozo de papel filtro.Asegúrese de que el epitelio sensorial esté despejado desde arriba. Coloque el papel de filtro y la preparación sobre el electrodo de platino base cubierto de solución salina de un electro porador. Coloque el electrodo superior de platino paralelo al electrodo base y a una distancia aproximada de dos milímetros, teniendo cuidado de no alterar la orientación de la preparación.Cuando haya contacto con el Oregon Green 488 BAPTA, se obtiene una solución como se observa en esta imagen. Aplique un breve pulso de corriente a través del preparado. Coloque una pequeña gota de aceite de silicona en el fondo de una cámara de grabación con fondo de vidrio llena con medio L-15.Luego, coloque nuevamente la preparación semientera sobre ella, asegurándose de que el epitelio sensorial quede despejado desde arriba. Para garantizar estabilidad durante toda la adquisición de imágenes, vuelva a colocar la rejilla de nailon sobre la preparación. A continuación, utilizando el microscopio de dos fotones, realice grabaciones ópticas de la actividad espontánea de calcio en el epitelio sensorial siguiendo protocolos estándar de imagenología.Esta imagen muestra corrientes celulares integrales registradas de una célula ciliar vestibular de tipo uno, caracterizada por grandes corrientes de cola colapsantes indicadas por la flecha aquí. Las corrientes celulares integrales se registraron a partir de una célula ciliar vestibular de tipo dos. Observe la ausencia de corrientes de cola.Esta imagen muestra el registro de célula completa de un aferente primario en forma de cálice caracterizado por corrientes transitorias mediadas por sodio, tal como indica la flecha tras la despolarización desde un potencial de reposo negativo de menos 120 milivoltios. Todas las células se mantuvieron a menos 60 milivoltios. Esta figura muestra las relaciones intensidad-voltaje (IV) para células pilosas de tipo dos registradas de ratones jóvenes y mayores en respuesta a un aumento en la duración de la despolarización.Estos histogramas muestran la conductancia promedio y una relación de activación de las células ciliadas de tipo dos en ratones jóvenes y viejos, basados en las curvas IV de 100 milisegundos. Estas micrografías de dos fotones muestran la activación de calcio con BAFTA uno verde Oregon en respuesta a L 15 normal PERFU ocho en el panel superior o L 15 que contiene cloruro de potasio 100 milimolar en el panel inferior. Las flechas indican la misma célula ciliar individual antes y después de la adición de cloruro de potasio.Este gráfico muestra el perfil de fluorescencia de calcio de la célula individual indicada por la flecha en la imagen anterior. Esta micrografía de dos fotones del epitelio sensorial muestra la carga de Oregon Green 488 BAPTA-1 en células pilosas individuales. El recuadro muestra la localización subcelular del calcio en el citoplasma de la célula pilosa tipo I, indicada por la flecha, o en la aferente primaria en forma de calice que rodea una célula pilosa tipo I, indicada por las dobles flechas.Una vez dominada, la disección puede llevar menos de 10 minutos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar el epitelio sensorial vestibular, cómo mantenerlo intacto y cómo conservar su viabilidad para grabaciones electrofisiológicas y para imágenes de calcio mediante microscopía de dos fotones.

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