Biosensor para la detección de antibióticos Las bacterias estafilococo resistentes

El objetivo general del siguiente experimento es discriminar cepas de Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina o MRSA y sensibles a la meticilina o MSSA mediante fagos de bacterias líticas antimodificadas especialmente seleccionados. Cuando las bacterias se unen a las colas largas y flexibles del fago lítico, la distancia entre las células unidas y la superficie del sensor es mayor que la penetración de la onda acústica del QC m. Por lo tanto, no se genera la señal del evento de enlace.

La sustitución del fago intacto por un esferoide da como resultado un fago totalmente funcional con colas cortas, que se une a las bacterias dentro de la profundidad de penetración de la onda acústica del QC m, contribuyendo así a los cambios de frecuencia y disipación cuando los esteroides del fago se depositan en el cristal A-Q-C-M-D y se exponen a la suspensión bacteriana mixta, se unen a las cepas MRSA y MSSA de Staphylococcus aureus, pero no otras bacterias que separan el Staphylococcus aureus de las otras bacterias en la superficie del cristal. Por último, cuando se añaden dos perlas unidas al anticuerpo PPP A específico de Mr.RSA, se genera una señal en presencia de cepas de Mr.RSA de Staphylococcus aureus. Las principales ventajas de esta técnica frente a los métodos existentes, como la PCR, son que este método no requiere extracción de ADN y no es sensible a los datos empíricos.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el cribado y la desinfección de Staphylococcus orus, también se puede aplicar a otras bacterias resistentes a los antibióticos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la fabricación de biosensores requiere precisión, exactitud y paciencia. Comience limpiando las piezas de cuarzo codificadas en oro mediante grabado por plasma en Argonne durante 10 minutos, y luego esterilice las piezas durante seis horas bajo luz ultravioleta en un gabinete estéril después de la esterilización a 50 microlitros de suspensión de fagos en la superficie de oro de cada pieza en una placa de Petri estéril, y luego incube las piezas durante la noche en una cámara húmeda a temperatura ambiente a la mañana siguiente, retire la suspensión de fagos restante para que se tiña, luego lave cada pieza de cuarzo con fago unido cinco veces con PBS para eliminar cualquier fago no unido.

Para probar la infectividad del fago, inmovilizado en una superficie seca, primero extienda un cultivo nocturno de Staphylococcus aureus en un NZY eRate y deje que la suspensión se seque. A continuación, coloque una pieza de cuarzo recubierta de oro con el fago inmovilizado boca abajo sobre la placa. Después de 12 horas a 37 grados centígrados, se puede observar una zona de lisis que indica infectividad para probar la actividad lítica del fago libre en líquido.

Primero, agregue un cultivo bacteriano de Staphylococcus aureus durante la noche a 10 mililitros de NZY en cada uno de los cuatro frascos de 300 mililitros para armas cortas. A continuación, añada dos veces 10 a las seis UFP por mililitro de fago libre a dos de los frascos. Ahora, monitoree el curso del tiempo de la lisis de células de estafilococos durante 570 minutos mediante la medición de la densidad óptica a intervalos de 30 minutos para cada matraz tomando una medición final a las 24 horas.

Para probar la actividad lítica del fago unido en líquido, repita los pasos que se acaban de demostrar, pero agregue trozos de oro con fago unido a los matraces experimentales en lugar de fago libre. Para preparar esteroides de fagos, primero combine 400 microlitros de suspensión de fagos 1 2600 con un volumen igual de cloroformo de grado fotométrico en un vial de un mililitro a temperatura ambiente. A continuación, agite suavemente la suspensión de cloroformo del fago cinco o seis veces a intervalos de cinco segundos durante un minuto de duración.

Después de permitir que la suspensión se estabilice durante 30 segundos, recoja la fracción superior que contiene la suspensión de esteroides. Transfiera unos pocos microlitros de la suspensión de esteroides a un vial de 500 microlitros para transmisión y microscopía electrónica de barrido. Guarde la suspensión de esteroides restante en un vial de un mililitro para la fabricación de biosensores.

Para preparar primero el biosensor, limpie los sensores QCMD mediante grabado con plasma en argón durante 10 minutos en un limpiador de plasma. A continuación, enjuague los sensores con hexano para eliminar las impurezas orgánicas. A continuación, limpie un canal del equilibrio de la película como lo describió anteriormente Olson Etal en el Journal of Microbiological methods.

Llenando un canal LB con una solución de subfase y limpiándolo con una barrera de canal. A continuación, estabilice la vaguada a 20 grados centígrados durante 10 minutos. Ahora cree una monocapa de fagos en la solución de la subfase LB goteando cuidadosamente un Eloqua de 300 microlitros de suspensión acuosa de fagos 1 2600 con una varilla de vidrio comestible inclinada que se sumerge parcialmente en la fase SOPH Después de dejar que la monocapa se estabilice durante 10 minutos, comprima la monocapa a una velocidad de 30 milímetros por minuto hasta alcanzar una presión constante de 19 newton's por metro.

La deposición vertical de la película es la parte más complicada de este procedimiento. Para garantizar el éxito, es necesario asegurarse de que todos los componentes de este procedimiento estén limpios y también se deben optimizar los parámetros de deposición monocapa. Ahora sumerja el sensor dentro y fuera de la monocapa siete veces seguidas a una velocidad de 4,5 milímetros por minuto para realizar una deposición vertical de la película.

En el sensor QCMD colocado perpendicularmente. La deposición vertical de la película une el fago intacto a la superficie del biosensor. Por último, utilice biosensores de fagos fabricados para la microscopía electrónica de detección de SARM y la optometría tanto del fago libre como del unido.

Comience este paso estableciendo las líneas de base, la frecuencia de resonancia y la disipación de energía del sensor QCM en el agua utilizando el software qof T. Después de unos 30 minutos, extraiga una suspensión de células vivas de bacterias Staphylococcus aureus o MSSA sensibles a la meticilina en agua a través de la célula de prueba. La línea azul muestra el valor de frecuencia, mientras que la línea roja muestra el nivel de disipación de energía.

Las líneas horizontales muestran el establecimiento de la línea de base. El número dos en el centro de la pantalla indica que los eventos están relacionados con el sensor. El número dos de cuatro monitorea continuamente los cambios en la frecuencia de resonancia y la disipación de energía de los sensores para el primer armónico mostrado.

Estos son los cambios después de que las bacterias pasan por la célula de prueba. Tenga en cuenta que solo se necesitan unos segundos para que la frecuencia disminuya y la disipación de energía aumente cuando los cambios en la frecuencia de resonancia de los sensores y la disipación de energía interna alcanzan niveles de saturación en la suspensión de las velocidades de látex conjugado con anticuerpos PVP al flujo y continúan el monitoreo continuo de la disipación de frecuencia. Aquí se muestra todo el proceso de detección que muestra el establecimiento de líneas de base, el cambio de unos pocos segundos en la frecuencia y la disipación de energía después de agregar bacterias, la saturación y, finalmente, los cambios después de la adición de cuentas.

Esta tabla muestra la actividad lítica demostrada de los fagos frente a todas las cepas de S. reus ensayadas, incluidas las cepas de SARM indicadas por la prueba de detección de fagos. Los tamaños de las placas generalmente oscilaban entre cinco y 15 milímetros. No se encontró actividad contra otros cultivos de prueba.

Aquí, se demuestra el crecimiento normal de Staphylococcus Urus A TCC 1 2600 en medio NZ Y en una incubadora agitadora a 37 grados Celsius con el número de bacterias aumentando de 3,2 veces 10 a seis a 4,0 veces 10 a ocho UFC por mililitro. En aproximadamente 24 horas, el fago inmovilizado sobre una superficie de oro demostró una actividad lítica similar a la actividad del fago en suspensión. El fago inmovilizado permaneció infeccioso en una infección bacteriana fresca incluso después de su uso en un experimento de crecimiento de 24 horas, varios lavados y almacenamiento en PBS durante seis días a cuatro grados centígrados.

En esta imagen, se puede observar el lisosoma alrededor de la pieza de oro, lo que indica que los fagos inmovilizados son capaces de lisar células bacterianas. Por lo tanto, como se ilustra aquí, la disminución efectiva del crecimiento bacteriano que se encuentra en el cocultivo de bacterias y fagos desmovilizados es el resultado de la interacción primaria de las bacterias suspendidas en agua y el fago unido. Aquí, se muestran micrografías electrónicas de transmisión y barrido del fago lítico intacto 1 2600 sobre una superficie de sustrato de oro cuando la suspensión del fago se somete a un tratamiento con cloroformo, la cola del fago se contrae en longitud y se engrosa y la cabeza poligonal se vuelve redondeada o esteroide.

A pesar de los importantes cambios estructurales. La actividad lítica del esteroide, medida por el número de placas, no cambió como resultado del tratamiento con cloroformo. Los sensores QCM con fagos líticos inmovilizados no mostraron cambios significativos en la frecuencia de resonancia o la disipación de energía cuando se expusieron a MRSA, lo que indica que la interacción de los fagos con MRSA resultó en un cambio de masa nom.

Sin embargo, según el QCM, las micrografías electrónicas de los biosensores posteriores al ensayo revelaron una unión bacteriana significativa en la superficie del sensor. Cuando se inyectaron suspensiones de SARM en la celda de flujo con biosensores de esteroides fagos, se observó una disminución sustancial en la frecuencia y un aumento en la disipación. Tras las interacciones de unión bacteriana al MRSA del esfero fago, los sensores de ensayo se expusieron a suspensiones de velocidad de látex conjugadas con anticuerpos BBP dos A.

Estos biosensores de ensayo de SARM respondieron a las suspensiones de velocidad conjugadas de látex con dos anticuerpos BPP A a medida que se observaba una disminución adicional en la frecuencia y un aumento en la disipación. La unión de la MSA a las sondas de fagos y a las velocidades de látex conjugado con anticuerpos PPP dos A se confirmó mediante investigaciones de microscopía electrónica de barrido. Cuando el biosensor de esteroides de fagos se expuso a MSSA, se observó una disminución sustancial en la frecuencia y un aumento en la disipación después de las interacciones de unión de MSSA de esteroides de fagos, los sensores de ensayo se desafiaron con suspensiones de velocidad de látex conjugadas con anticuerpos PPP dos A.

Inicialmente, el biosensor del ensayo MSSA mostró una breve transitoriedad de aumentos en la frecuencia y disminuciones en la disipación después de unos minutos de interacciones de látex conjugado con anticuerpos MSSA y PPP dos A. Sin embargo, la frecuencia volvió a los niveles de introducción de anticuerpos A posteriores a la PVP dos A, pero la energía deci aumentó. A continuación, se analizó la unión de MSSA a las sondas de fagos mediante microscopía electrónica de barrido, pero no se observó ninguna unión entre MSSA y PPP a dos velocidades de látex conjugadas con anticuerpos A, se muestra un perfil de espesor simétrico de elipses y un mapa de espesor 3D de fagos líticos.

Se dibujó una línea a través del mapa de espesor para generar el perfil de espesor. Estas últimas imágenes muestran imágenes representativas de cámaras ópticas CCD de MRSA capturadas por fagos unidos a la superficie de oro del sensor A-Q-C-M-D y perfiles de intensidad 3D de MRSA en sustratos de vidrio inmovilizados por fagos a una concentración de 10 a las ocho UFC por mililitro y de 10 a las nueve UFC por mililitro. Cada círculo redondo representa una sola bacteria.

Está claro que el aumento de la concentración de bacterias en suspensión líquida de 10 a ocho UFC por mililitro a 10 a nueve UFC por mililitro da como resultado un aumento significativo de las bacterias capturadas en los perfiles de intensidad 3D. El número de picos blancos en la capa superior es proporcional al número de bacterias capturadas y, como era de esperar, la densidad de los picos aumenta significativamente cuando la exposición bacteriana se incrementa de 10 a ocho a 10 a nueve UFC por mililitro. La capa inferior de color azul oscuro corresponde a la capa de fagos que entra en contacto con un sustrato de oro.

A medida que se capturan más bacterias, las propiedades ópticas de los fagos cambian a medida que se unen a las bacterias, lo que da como resultado un color azul más oscuro e intenso. Siguiendo este procedimiento, podemos definir la eficiencia de captura bacteriana para comprender las interacciones de las bacterias de los fagos después del desarrollo. Esta técnica muestra el camino para que los investigadores en el campo de la terapia con fagos bacterianos exploren la inhibición de patógenos en animales y humanos No olvide que trabajar con solventes orgánicos en bacterias patógenas puede ser extremadamente peligroso, y seguir la estricta regulación es muy importante.