Protocolos para la Evaluación de radiofrecuencia Interacciones con nanopartículas de oro y Sistemas Biológicos para la terapia del cáncer de hipertermia no invasiva

El objetivo general de este procedimiento es evaluar las propiedades de calentamiento de las nanopartículas de oro en un campo eléctrico de radiofrecuencia de 13,56 megahercios, in vitro e in vivo. Esto se logra evaluando primero la velocidad de calentamiento de las nanopartículas de oro concentradas y su tampón en un veterinario de cuarzo. El segundo paso del procedimiento es realizar estudios de toxicidad in vitro de nanopartículas de oro con células cancerosas cultivadas.

El tercer paso es realizar estudios in vivo de nanopartículas de oro en un modelo ectópico de cáncer de ratón. En última instancia, los resultados pueden mostrar si la nanopartícula investigada podría ser o no un agente eficaz para usar con la hipertermia mediada por RF a través del análisis de las nanopartículas en suspensión, in vitro e in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en un campo de la hipotermia de radiofrecuencia no invasiva mediada por nanopartículas, como el calentamiento debido a las propias partículas y ¿se puede utilizar con fines terapéuticos?

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no hay muchos protocolos bien establecidos para realizar este tipo de experimentos. Cisneros, asistente de investigación, Stuart Core, científico postdoctoral, y Leila Green, otra científica postdoctoral, demostrarán el procedimiento. Como ejemplo, comience con una botella de 500 mililitros de nanopartículas de oro con un diámetro de cinco nanómetros.

Tome aproximadamente 125 mililitros de la solución de nanopartículas de oro y divídala entre seis tubos de filtro de centrífuga de 50 kilodalton, centrifuga las nanopartículas a 3000 RPM durante dos minutos y cinco segundos. Retire el sobrenadante que es el tampón filtrado y vuelva a llenar cada filtro. Con más solución de stock.

Continúe la centrifusión y retire el tampón y vuelva a cargar los tubos hasta que se haya filtrado toda la solución de nanopartículas. Después de la última adición, reemplace el tampón filtrado con un volumen similar de agua desionizada y repita el proceso aproximadamente ocho veces más después de cargar la muestra de tampón filtrada en la máquina de RF. Usando el software de la cámara infrarroja, cree cajas sobre el QVE para capturar el perfil de calentamiento Después de ocho lavados, los datos de calentamiento del filtrado de nanopartículas de oro de cinco nanómetros se acercan a los del agua desionizada.

El análisis UV vis también se puede utilizar para controlar la absorción de contaminantes. Picos. Aquí se muestra un espectro limpio. Una vez que los contaminantes tampón se han eliminado por completo, suspendemos las nanopartículas en 0,5 mililitros de agua desionizada en los tubos del filtro que eliminan las nanopartículas del filtro.

A continuación, combine las seis suspensiones en un tubo de 15 mililitros. Ahora, analice la muestra utilizando datos de potencial UV, VIS y zeta para obtener datos de estabilidad. Utilice la especificación de masa I-C-P-O-E-S y/o ICP para determinar la concentración de nanopartículas.

El análisis SEM y/o TEM también se puede utilizar para obtener datos morfológicos utilizando un sistema de RF de Kansas o derivaciones de carga, una jeringa de cuarzo de 1,3 mililitros, y establecer el campo eléctrico de RF en aproximadamente 90 kilovoltios por metro en el aire donde residiría la veta Q. Para una muestra salina estándar con cloruro de sodio al 0,9%, el campo eléctrico se reduciría a aproximadamente 1,1 kilovoltios por metro. Estas son las condiciones aproximadas utilizadas para permitir realizar comparaciones entre diferentes sistemas de RF.

Ahora, cargue una veta de cuarzo limpia con 1,3 mililitros de suspensión de nanopartículas de oro purificado a una concentración de 1000 miligramos por litro. Exponga la muestra al campo de RF durante un período de 120 segundos o hasta que la muestra alcance los 70 grados Celsius. La sobreexposición puede provocar la formación de arcos eléctricos o una ebullición rápida.

Capture los datos de imágenes térmicas, así como las áreas de control, utilizando una cámara IR y el software asociado. Repita este procedimiento tres veces en la misma muestra. Ahora filtre la muestra a través de otro filtro centrífugo de 50 kilodalton para extraer las nanopartículas de oro del tampón de agua.

A continuación, vuelva a exponer el búfer solo al campo de RF. Una vez más, tres veces la diferencia en las horas entre el coloide de nanopartículas de oro y el filtrado determina la HR debido a las propias nanopartículas de oro. Finalmente, suspendemos las nanopartículas de oro restantes del filtro en 1,3 mililitros de agua para realizar más experimentos.

Estos estudios in vitro se pueden aplicar a cualquier tipo de célula cancerosa que forme monocapas 2D. En este ejemplo, se utilizarán células B Hep tres derivadas del carcinoma hepatocelular humano que platearán alrededor de 50.000 células. En tres pocillos de una placa de 12 pocillos con un mililitro de crecimiento.

Los medios continúan cargando celdas hasta que se llenan tres placas para estudios de nanopartículas, y se llenan tres placas como controles. Incubar las placas a 37,5 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, introduzca 0,1 mililitros de una solución de nanopartículas de oro de 1000 miligramos por litro en cada pocillo de las tres placas de nanopartículas a las placas de control.

A 0,1 mililitros de agua en cada uno, incubar bien todas las placas durante otras 24 horas. Después de otras 24 horas, aspire el medio celular y lave las células con PBS para eliminar cualquier nanopartícula de oro unida a la superficie. A continuación, sustituya el medio de la célula.

Las celdas ahora están listas para la exposición a RF. Coloque cada paquete de celdas de 12 pocillos dentro del campo de RF y espere hasta que las celdas se hayan enfriado a 31 grados Celsius. Una vez que se hayan enfriado ligeramente, exponga las celdas a 3,5 minutos de rf.

La temperatura final de los medios celulares será de unos 37 grados centígrados. Transfiera las células a una incubadora y espere 24 horas antes de analizarlas. Cuando las celdas estén listas, aspire el medio y reemplácelo con dos mililitros de reactivo al 25% de MTT en el medio.

Luego deje que las células se incuben durante otras cuatro horas. A continuación, sustituya el soporte MTT por dos mililitros de DMSO. Coloque las placas de celda en un balancín de banco durante 10 minutos para permitir que el DMSO solubilice los reactivos MTT.

Finalmente, pipetee 100 muestras de microlitros de cada pocillo en una placa de 96 pocillos y lea ópticamente la placa a 570 nanómetros. Estos estudios in vivo se pueden aplicar a cualquier tipo de cáncer que forme tumores sólidos en un modelo de espejo ortotópico o ectópico. En este ejemplo, se utilizan células de cáncer de hígado Hep three B con ratones desnudos BPC.

Comience con aproximadamente 100.000 células, la tripsina congele las células y produzca una solución de 2 millones de células por cada 25 microlitros. Añadir una cantidad igual de gel matri helado a la suspensión celular y mezclarlo bien mediante aspiración repetida en una pipeta. Ahora inyecte la suspensión mixta en la posición deseada en el lomo de cada animal.

Después de unas semanas, los tumores tendrán entre medio y un centímetro de diámetro en este momento, comience el tratamiento de radiofrecuencia y anestesie a los ratones con la solución de ketamina y xilacina por inyección IP y manténgalos calientes. A continuación, inyecte las nanopartículas de oro directamente en la mitad de los tumores utilizando una jeringa de un cc con una aguja de calibre 27 o 30. Use un hisopo quirúrgico para absorber la sangre y limpie el sitio de la inyección con una toallita con alcohol.

Como control, inyecte solo PBS en la otra mitad de los tumores. Ahora, trata a la mitad de los ratones de cada grupo. Monte el mouse en el cabezal receptor del generador de RF y proteja las áreas no tratadas con cinta de cobre, incluidos los ojos, las orejas y los dedos de los pies.

La parte más importante de este experimento es la conexión a tierra adecuada de los ratones. Sin una conexión a tierra adecuada, la acumulación de carga en los animales puede causar lesiones térmicas o electrodérmicas. Esto se puede prevenir fácilmente.

Coloque el tumor fuera de la cabeza de transmisión al menos un centímetro más que el ancho del sitio de tratamiento deseado. Ahora, coloque la cámara térmica IR de modo que el tumor y el área de tratamiento sean visibles. Encienda el RF durante cinco minutos y registre la curva de temperatura resultante.

Si la temperatura de la superficie de la piel supera los 42 grados centígrados, suspenda el tratamiento inmediatamente después de la exposición a la radiofrecuencia. Permita que los ratones se recuperen en una cámara caliente hasta que estén conscientes. Repita los tratamientos dos veces por semana durante tres semanas.

A continuación, se sacrifica a los ratones 48 horas después de la exposición final a RF y se procesan los tumores. El calentamiento por radiofrecuencia de las nanopartículas de oro purificado se determinó por la diferencia en horas entre ellas y la solución tampón de agua desionizada de fondo. Los resultados fueron los esperados para las nanopartículas de cinco nanómetros y 10 nanómetros.

Las nanopartículas de oro purificadas integradas en las células B de hepatitis tres derivadas del carcinoma hepatocelular humano. Cuando tales células se exponen a un campo de RF, generalmente se vuelven menos viables que las expuestas a RF sin nanopartículas internalizadas. La figura tres muestra un escenario idealizado en el que las nanopartículas de oro utilizadas tienen una toxicidad limitada por sí mismas, pero excelentes propiedades citotóxicas iniciadas por RF, consulte la literatura para una revisión exhaustiva de los resultados in vitro hasta la fecha utilizando varios tipos de nanomateriales.

Se utilizaron células de cáncer de hígado Hep three B para generar tumores en las espaldas de ratones babsi desnudos. A estos tumores se les inyectaron nanopartículas de oro en suspensión PBS, seguidas de exposición a RF. El análisis posterior al tratamiento reveló que el tratamiento controló el crecimiento tumoral y disminuyó la masa tumoral.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar las nanopartículas para su uso en la hipotermia mediada por RF mediante la determinación de sus propiedades de respuesta a RF y su solución in vitro e in vivo. No olvide que trabajar con campos eléctricos de RF de alta potencia puede ser extremadamente peligroso. Nunca toque ni alcance dentro de un campo eléctrico activo.

Tome medidas del campo eléctrico y, si es necesario, use un blindaje adecuado como una jaula de Faraday. En general, siempre minimice su exposición a campos eléctricos sostenidos de alta intensidad.