La diferenciación de ratón recién nacido piel derivados de las células madre en células germinales-como
16 de julio de 2013
En los últimos años la formación de las células germinales que utilizan en los métodos de cultivo in vitro se ha demostrado usando varios tipos diferentes de células madre somáticas. En este artículo se presentará visualmente la diferenciación de las células madre derivadas de ratones recién nacidos a principios de células ovocitos similares.
El objetivo general del siguiente experimento consiste en formar células similares a ovocitos utilizando células madre derivadas de la piel somática. Esto se logra mediante el uso de células madre indiferenciadas puras derivadas de la piel de ratón recién nacido. Como segundo paso, las células madre se disocian, lo que las prepara para la diferenciación.
A continuación, las células madre se siembran en un medio de diferenciación definido. Con el fin de inducir la formación de células germinales, los resultados obtenidos muestran la expresión de marcadores específicos de ovocitos basada en PCR en tiempo real semicuantitativa. Este método puede ayudar a responder preguntas clave dentro del campo de la biología reproductiva.
Al proporcionar un sistema cerrado para estudiar la célula germinativa, la formación y el desarrollo del eSight, todos los medios necesarios para el protocolo deben prepararse de dos a tres horas antes de su uso y colocarse con la tapa aflojada en el incubador de cultivo celular donde se llevará a cabo el experimento. Los dos medios utilizados aquí son el medio para células madre, compuesto por D-M-A-M-F 12, suplementado con B 27, BFGF y EGF, y el medio para la diferenciación de células germinativas, compuesto por M1 99 suplementado con FSH, LH, B-S-A-I-T-S, piruvato de sodio, tuin y EGF. Células madre aisladas de ratón recién nacido.
Los cachorros se utilizan para la diferenciación in vitro de células germinales en el pase dos hasta el cuatro. Dado que la eficiencia de formación de células similares a cito u OLC está directamente relacionada con la calidad de las células madre iniciales, lo mejor es comenzar la diferenciación tan pronto como la población parezca limpia y saludable, lo cual generalmente ocurre alrededor del pase 2. 48 horas antes de iniciar la subcultura para diferenciación, retire con una pipeta serológica todos los agregados celulares esféricos suspendidos y el medio gastado del plato de cultivo y colóquelos en un tubo de 15 mililitros. Es importante recolectar únicamente los agregados esféricos suspendidos de células y no las células adheridas al fondo del plato que están diferenciándose espontáneamente.
Centrifugar las células a 500 veces G durante cinco minutos, desechar el sobrenadante y resuspender las células en 500 microlitros de medio fresco para células madre. Calentar a 37 grados Celsius. Pipetear suavemente los agregados para disociar parcialmente las células.
No pipetee agresivamente las células, ya que esto reducirá la viabilidad celular. Lave las células parcialmente disociadas en 9,5 mililitros de medio fresco de células madre precalentado en una placa de cultivo celular de 10 centímetros con baja adherencia. Devuelva las células a un incubador de cultivo celular a 37 grados Celsius y 5 %CO2 durante 48 horas.
Para comenzar el procedimiento de diferenciación de OLC, utilice una pipeta serológica para retirar las células madre de la placa de cultivo y colóquelas en un tubo de 15 mililitros. Deje atrás cualquier célula adherida. Precipite las células a 500 × g durante cinco minutos, deseche el sobrenadante y re suspenda las células en 500 microlitros de PBS estéril; pipetee vigorosamente las células utilizando una punta de 1000 microlitros de gran orificio formando agregados, no más grandes de 10 a 20 células.
Para el éxito de este protocolo, es fundamental verificar regularmente el grado de disociación con el fin de asegurar que se obtenga el nivel adecuado durante la disociación. Retire periódicamente una pequeña cantidad de células y obsérvelas bajo un microscopio de luz blanca para confirmar que las células agregadas se encuentren en grupos de 10 a 20 células individuales. No disocie en exceso las células, ya que esto provocará una viabilidad celular reducida.
A continuación, agregue 9,5 mililitros de PBS a las células disociadas y transfiera 15 microlitros de esta suspensión celular a un hemocitómetro para el recuento de células. Pellete las células a 500 veces G durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, resuspenda las células en medio de diferenciación a una concentración de 1,32 veces 10 a la sexta células por mililitro.
Siembre las células añadiendo 500 microlitros por pocillo en una placa de suspensión de fondo plano de 24 pocillos. Coloque la placa de 24 pocillos en una incubadora de cultivo celular a 37 grados Celsius en 5%CO2 durante 48 horas. Transcurridas 48 horas, retire 250 microlitros de medio de cada pocillo y colóquelos en un tubo de 1,5 mililitros etiquetado correspondiente.
Añada 250 microlitros de medio de diferenciación fresco a cada pocillo, centrifugue el medio usado a 500 veces G durante cinco minutos, deseche el sobrenadante y re suspenda cualquier célula en el pellet en 50 microlitros de diferenciación fresca. Devuelva la suspensión celular al cultivo correspondiente. Cada 48 horas hasta el día 12 de diferenciación, cambie la mitad del medio de la misma manera en el pocillo de la placa de diferenciación.
Durante la diferenciación en estadios tempranos, las células se adhieren al fondo del recipiente de cultivo y se extienden. Esta imagen representativa muestra células entre 42 y 72 horas de iniciada la diferenciación, positivas para OCT cuatro. Un marcador de células madre indiferenciadas se indica en núcleos verdes, contrasteados con hirst y mostrados en azul.
A medida que avanza la diferenciación, se observarán algunos agregados celulares con células positivas para OCT cuatro marcadas en verde, rodeadas por células negativas para OCT cuatro. La barra de escala para esta imagen es de 100 micrones. Esta figura muestra una imagen de luz blanca de una estructura similar a un folículo tras su separación de la superficie de cultivo; la barra de escala representa 40 micrones.
Con un cultivo continuo, el LCS crecerá hasta alcanzar aproximadamente 45 micrones de diámetro. La barra de escala en esta imagen representa 10 micrones. Se pueden observar grandes LCS positivos para OCT4 ya sea rodeados por células o individualmente dentro del cultivo.
Estos LCS pueden recogerse con células de soporte o con ojos de tripsina para obtener LCS sin otras células adheridas. Con el fin de confirmar que los LCS expresaban transcritos similares a los de los sitios OO naturales, se recogieron los LCS y se analizó la expresión de marcadores comunes de sitios OO, como Z-P-C-S-C-P tres CMO, T cuatro BMP 15 y vasa. Esta figura muestra los niveles de transcritos de estos marcadores en 10 LCS en relación con 10 citoos de ratón recién nacidos.
Los resultados muestran que las LCS expresan menos ZPC que las citas. Dado que ZPC es un componente de la estructura de membrana del zop lucidum específico de las CITAS, esto podría explicar la naturaleza frágil y la membrana zita más delgada de las LCS. La expresión de la SCP3 de la meiosis es mayor en las LCS en comparación con las citas naturales.
Sin embargo, un marcador diferente de meiosis, CMOs, se expresa a un nivel más bajo. Esta discrepancia en los niveles de expresión podría explicar parcialmente el actual fracaso del LCS en completar la meiosis. Otros marcadores como BMP 15 y vasa no presentan diferencias significativas entre los sitios lcs y O.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la salud de la población inicial de células madre es fundamental para su éxito.
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Descripción general
Este artículo presenta un método para generar células similares a ovocitos a partir de células madre somáticas derivadas de la piel de ratones recién nacidos. El proceso implica la disociación de las células madre y su cultivo en un medio de diferenciación definido para inducir la formación de células germinales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Reproductiva
- Investigación con Células Madre
- Diferenciación Celular
Antecedentes
- La formación de células germinales es fundamental para comprender la reproducción.
- Los métodos de cultivo in vitro han avanzado el estudio de la diferenciación de células germinales.
- Las células madre somáticas ofrecen una fuente potencial para la generación de células germinales.
- Las células madre derivadas de ratones recién nacidos proporcionan un modelo para la investigación.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para la formación de células similares a ovocitos.
- Explorar el potencial de diferenciación de las células madre derivadas de la piel somática.
- Investigar la expresión de marcadores específicos de ovocitos.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de células madre indiferenciadas de la piel de ratón recién nacido.
- Disociación de células madre para prepararlas para la diferenciación.
- Siembra de células madre en medio de diferenciación definido.
- Evaluación de la formación de células germinales mediante PCR en tiempo real semicuantitativa.
Resultados principales
- Diferenciación exitosa de células madre en células similares a ovocitos.
- Expresión de marcadores específicos de ovocitos confirmada mediante PCR.
- Los hallazgos contribuyen al entendimiento de la biología reproductiva.
- La metodología proporciona un marco para investigaciones futuras en la formación de células germinales.
Conclusiones
- El estudio demuestra el potencial de las células madre somáticas en la investigación de células germinales.
- Los resultados indican una vía viable para generar células similares a ovocitos in vitro.
- Esta investigación podría ayudar a abordar preguntas clave en biología reproductiva.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El establecimiento de modelos in vitro confiables de formación de células germinales aborda un cuello de botella crítico en la investigación de biología reproductiva, donde el acceso limitado a células germinales primarias dificulta los estudios mecanicistas. Este sistema derivado de células madre somáticas permite la generación escalable de células similares a ovocitos para la validación de dianas y el desarrollo de ensayos en el descubrimiento de fármacos relacionados con la fertilidad. Al proporcionar una plataforma definida y reproducible, apoya la reducción temprana de riesgos en hipótesis terapéuticas dirigidas a vías de gametogénesis.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de las vías de diferenciación de las células germinales utilizando células madre somáticas como un modelo manejable para la prueba de hipótesis específicas.
- Valor operativo: Proporciona una fuente renovable de células similares a ovocitos que expresan marcadores clave (Oct4, Vasa, Bmp15, Scp3) para ensayos consistentes de interacción con dianas.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Apoya la preparación de células germinales diferenciadas para la selección de compuestos que afectan la progresión meiótica o la maduración de ovocitos.
- Valor operativo: Genera resultados cuantificables mediante PCR en tiempo real semicuantitativa para la expresión de marcadores, permitiendo flujos de trabajo de respuesta a la dosis y confirmación de resultados positivos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Ofrece un sistema relevante para la enfermedad para estudiar los mecanismos de formación temprana de células germinales, lo que contribuye al descubrimiento de biomarcadores para trastornos de la fertilidad.
- Valor operativo: Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al proporcionar una lectura estandarizada de la diferenciación.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento que va desde la identificación del blanco hasta la optimización del fármaco líder, particularmente para terapéuticas del tracto reproductivo donde la funcionalidad de las células germinales es un punto final fenotípico clave.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al permitir la validación funcional de dianas implicadas en la especificación de células germinales y la entrada en meiosis.
- Cribado: Genera células listas para ensayos con estados de diferenciación definidos para evaluar los efectos de compuestos sobre la formación de células germinales.
- Análisis: Proporciona datos cuantitativos de expresión de marcadores (mediante PCR) que permiten comparar condiciones experimentales y evaluar la eficiencia de diferenciación.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la expresión de marcadores específicos de ovocitos alineados con las vías naturales de gametogénesis.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de diferenciación reutilizable aplicable en múltiples proyectos dirigidos a vías de biología reproductiva.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al proporcionar un sustituto relevante para el desarrollo de células germinales tempranas en humanos.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de disociación, siembra y cambio de medio.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al permitir la evaluación temprana de los efectos de compuestos sobre las trayectorias de diferenciación de células germinales.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de objetivos relacionados con la fertilidad, basada en la reducción mecanicista de riesgos en un sistema modelo validado.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de cultivo de células madre y diferenciación de células germinales.
- Depende del acceso a incubadoras de cultivo celular, centrífugas y equipos de PCR en tiempo real para el análisis de marcadores.
- Necesita la estandarización de la calidad inicial de las células madre y del número de pases para garantizar una eficiencia constante de diferenciación.
- Implica consideraciones de optimización al adaptar el protocolo a fuentes alternativas de células madre somáticas.
- Está limitado por la baja eficiencia actual en la obtención de células similares a ovocitos y por la imposibilidad de soportar la maduración meiótica completa, lo que podría restringir su aplicabilidad en etapas tardías.
