Un método sensible para cuantificar las células cancerosas senescentes

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la senescencia celular de una manera rápida y sensible. En este trabajo demostramos la utilidad de este método en el cribado de potenciales fármacos quimioterapéuticos. Primero en inducir la senescencia celular.

El fármaco quimioterapéutico doxorrubicina se añade a las células cancerosas. A continuación, se aplica el Baño A uno para neutralizar el pH ácido de los lisosomas celulares. A continuación, se añade permeado celular beta galactosubstrate C 12 FDG tras la absorción celular.

El C 12 FDG está hidrolizado y emite fluorescencia. Dado que los beta GCSEs están enriquecidos en los lisosomas de las células senescentes, se vuelven más fluorescentes que las células no senescentes. Para cuantificar la diferencia en la fluorescencia, las células se ejecutan en un citómetro de flujo, el análisis de los datos resultantes permite cuantificar el porcentaje de células cancerosas senescentes en diferentes condiciones de tratamiento.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como la beta galactosa es, por ejemplo, que facilita la cuantificación rápida y sensible de las células senescentes. De hecho, primero añadimos la idea de este método cuando experimentamos dificultades para cuantificar las células senescentes utilizando el ensayo de beta galactosa comúnmente utilizado. Aunque utilizamos esta técnica para detectar la senescencia en las células cancerosas, también se puede utilizar en las células normales.

Este método puede ayudar a responder preguntas rápidas en el campo del cáncer, como si un medicamento quimioterapéutico indujo a las células cancerosas a la SSE, lo que podría promover la malignidad. Por lo tanto, esta técnica podría ayudar a notificar nuevos tratamientos terapéuticos para el cáncer. Trabajando en una campana de gases químicos, disolvió el polvo C 12 FDG en DMSO hasta una concentración final de 20 milimolares alícuotas en tubos de einor de 0,5 mililitros y se almacenó a menos 80 grados centígrados.

El DMSO debe usarse con las condiciones de seguridad adecuadas, también disolverse. CIN A un polvo en DMSO hasta una concentración final de 0,1. Milimolar Eloqua la solución en tubos de microcentrífuga de 0,5 mililitros y almacenarlos a menos 20 grados centígrados.

Tenga en cuenta que el CIN debe usarse con las precauciones de seguridad adecuadas. Este procedimiento se puede realizar utilizando células adherentes o no adherentes. Aquí se demuestra el procedimiento utilizando la línea celular de mieloma humano RPMI 8 2 2 6.

Estas células crecen en suspensión, cultivan células RPMI 8 2 2 6 en un medio que contiene 10% de FBS y 1% de antibióticos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono 24 horas antes de realizar el experimento siembran las células en placas de seis pocillos para que estén en la fase logarítmica de la curva de proliferación celular. En el momento del experimento para determinar el porcentaje de células senescentes, se requerirán tres muestras de células. Células no tratadas y no teñidas con ST, células no tratadas teñidas con C 12 FDG y células tratadas teñidas con C 12 FTG.

Para cada condición, se requiere un mínimo de cinco veces 10 a la quinta celda para la senescencia inducida por citometría de flujo de las células cancerosas. Al añadir el fármaco quimioterapéutico doxorrubicina, la concentración del fármaco y la duración del tratamiento deben adaptarse al tipo de célula. Probado para rpmi 8 2 2 6 celdas.

La senescencia se puede inducir tratando 10 de las seis células por mililitro con doxorrubicina 15 nanomolares durante 48 horas. No olvide incluir la muestra sin tratar como control negativo, incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. El tratamiento con fármacos quimioterapéuticos puede provocar apoptosis celular.

Por lo tanto, después de dos días, verifique la viabilidad celular mediante la exclusión de azul triano utilizando un hemo, un citómetro y un microscopio. Si el porcentaje de viabilidad es inferior al 70%, retire las células muertas utilizando un kit adecuado, como el kit de eliminación de células muertas de Milton E, para asegurarse de que las células muertas no sesguen el análisis posterior. De lo contrario, retire el medio de cultivo girando las células a 300 GS durante cinco minutos.

Luego, después de eliminar el sobrenadante en un medio de cultivo fresco precalentado que contiene 100 anom o cin, A uno para neutralizar el pH ácido de los lisosomas incubar durante una hora a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono disuelve el beta galacto un sustrato C 12 FDG en cultivo fresco de preguerra. Concentración media a final de dos milimolares. Después de la incubación con micina beil.

Añadir C 12 FDG directamente a las células y medio hasta una concentración final de 33. Micromolar incubar durante dos horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de la incubación, centrifugar las células a 300 Gs durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Después del centrifugado, lave las celdas dos veces con PBS girando hacia abajo cada vez como antes y eliminando el sobrenadante después del segundo lavado. Resus suspende el pellet celular en 500 microlitros de PBS frío y luego realiza un co-marcado inmunológico para caracterizar aún más la población de células senescentes. Si no tiene experiencia con la citometría de flujo, el aspecto más difícil de este procedimiento será realizar el análisis de citometría de flujo.

Para garantizar el éxito, asegúrese de incluir los controles adecuados y busque ayuda de personas sin experiencia según sea necesario. Antes de ejecutar el primer ejemplo, prepare un gráfico de dos parámetros que muestre el canal de dispersión directa o FSC frente al SSC del canal de dispersión lateral. A continuación, ejecute la primera muestra que contenga células sin etiquetar.

Establezca los tubos fotomultiplicadores o PMT y defina una región de interés, excluyendo las células muertas y los desechos celulares que puedan haber aparecido durante la puerta de preparación de la muestra. Esta región de interés en un histograma de un parámetro que muestra la fluorescencia de C 12 FDG como FL uno en la escala logarítmica del eje x y el número de eventos en el eje Y. El número total de eventos representa el número de celdas analizadas.

Establezca el PMT para que las celdas sin etiquetar aparezcan en la primera década en la escala logarítmica del eje x. Determine la autofluorescencia de las células, si es necesario, ejecutando las células no marcadas en el flujo. El citómetro ejecuta la segunda muestra que contiene células no tratadas en el histograma de un parámetro que muestra FL un lugar con el cursor después de la población tenuemente etiquetada.

Este umbral permitirá la discriminación entre las células no senescentes, que están marcadas tenuemente, y las células senescentes, que están marcadas brillantemente. Ejecute la tercera muestra que contenga células tratadas. Las células senescentes claramente marcadas aparecen por encima del umbral determinado en el paso anterior.

Evalúe el porcentaje de células senescentes dividiendo el número de eventos brillantes por el número total de eventos, si es necesario. La actividad de la beta galactotasa también se puede estimar utilizando la intensidad media de fluorescencia para evaluar la senescencia inducida por un procedimiento quimioterapéutico. La línea celular de mieloma múltiple R RRP I 8 2 2 6 disponible en el mercado se trató durante dos días con doxorrubicina, un fármaco quimioterapéutico y un ensayo para la senescencia como se describe en este video, estos histogramas muestran la fluorescencia de las células no tratadas a la izquierda y las células tratadas a la derecha.

En la región V.In paralela aparece una población de células marcadas brillantemente que representan células senescentes, la misma muestra de células se tiñó mediante el ensayo de beta galacto sasa. En esta imagen representativa se muestran células completamente azules y células parcialmente azules para ilustrar la dificultad de distinguir las células senescentes verdaderamente azules. Para ilustrar la especificidad de C 12 FDG en la determinación del porcentaje de células senescentes, las células también se trataron con varias concentraciones de doxorrubicina.

El porcentaje de células senescentes se determinó dividiendo el número de eventos brillantes. Por el número total de eventos, los porcentajes de células senescentes fueron de 0,8%, 15,78% y 26,31% para una dosis de 5, 25 y 50 nanomolares de doxorrubicina, respectivamente. Esto demuestra que el marcaje de C 12 FTG es específico de las células senescentes.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo cuantificar las células senescentes si se pueden series o no mediante citometría de flujo siguiendo este procedimiento de métodos como el etiquetado inmunológico para caracterizar las células senescentes. No olvide que trabajar con DMSO o células cancerosas puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar precauciones al realizar este procedimiento.