Un método sensible para cuantificar las células cancerosas senescentes

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la senescencia celular de manera rápida y sensible. Aquí demostramos la utilidad de este método en la selección de fármacos quimioterapéuticos potenciales. Primero, inducir la senescencia celular.

Se añade el fármaco quimioterapéutico doxorubicina a células cancerosas. A continuación, se aplica Bain A uno para neutralizar el pH ácido de los lisosomas celulares. Luego se añade el sustrato permeable a la célula beta galacto C 12 FDG tras la captación celular.

La C 12 FDG se hidroliza y fluoresce. Dado que la beta GCSE está enriquecida en los lisosomas de las células senescentes, estas se vuelven más fluorescentes que las células no senescentes. Para cuantificar la diferencia en fluorescencia, las células se analizan mediante citometría de flujo; el análisis de los datos resultantes permite cuantificar el porcentaje de células cancerosas senescentes bajo diferentes condiciones de tratamiento.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la prueba de beta galactosa es que facilita la cuantificación rápida y sensible de células senescentes. De hecho, tuvimos la idea inicial para este método cuando experimentamos dificultades para cuantificar células senescentes utilizando la prueba de beta galactosa comúnmente empleada. Aunque utilizamos esta técnica para detectar la senescencia en células cancerosas, también puede emplearse en células normales.

Este método puede ayudar a responder preguntas rápidas en el campo del cáncer, como si un fármaco quimioterapéutico indujo a las células cancerosas a sse, lo que podría promover la malignidad. Por lo tanto, esta técnica podría ayudar en última instancia a informar sobre nuevos tratamientos terapéuticos para el cáncer. En una campana extractora de gases, disuelva el polvo de C 12 FDG en DMSO hasta una concentración final de 20 milimolar, divida en alícuotas de 0,5 mililitros en tubos einor y almacene a menos 80 grados Celsius.

El DMSO debe usarse con las condiciones de seguridad adecuadas y también disolver el polvo de CIN A en DMSO hasta una concentración final de 0,1 milimolar. Aliquotear la solución en tubos microcentrífugos de 0,5 mililitros y almacenarlos a menos 20 grados Celsius.

Tenga en cuenta que el CIN debe usarse con las precauciones adecuadas de seguridad. Este procedimiento puede realizarse utilizando células adherentes o no adherentes. Aquí se demuestra el procedimiento utilizando la línea celular de mieloma humano RPMI 8 2 2 6.

Estas células crecen en suspensión; cultive las células RPMI 8 2 2 6 en medio que contenga 10 %FBS y 1 %antibióticos a 37 grados Celsius y 5 %dióxido de carbono durante 24 horas antes de realizar el experimento. Siembre las células en placas de seis pocillos para que se encuentren en la fase logarítmica de la curva de proliferación celular. En el momento del experimento para determinar el porcentaje de células senescentes, se requerirán tres muestras celulares: células no tratadas y no teñidas con ST, células no tratadas teñidas con C 12 FDG y células tratadas teñidas con C 12 FTG.

Para cada condición, se requiere un mínimo de cinco veces diez a la quinta células para la citometría de flujo inducida por senescencia en células cancerosas. Al agregar el fármaco quimioterapéutico doxorubicina, la concentración del fármaco y la duración del tratamiento deben adaptarse al tipo celular. Probado en células rpmi 8 2 2 6.

La senescencia puede inducirse tratando un décimo de las seis células por mililitro con doxorrubicina 15 nanomolar durante 48 horas. No olvide incluir una muestra no tratada como control negativo, incubar a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. El tratamiento con fármacos quimioterapéuticos puede provocar la apoptosis celular.

Por lo tanto, después de dos días, verifique la viabilidad celular mediante la exclusión con azul de trian usando un hemocitómetro y un microscopio. Si el porcentaje de viabilidad es inferior al 70 %, elimine las células muertas utilizando un kit adecuado, como el kit de eliminación de células muertas de Milton E, para asegurarse de que las células muertas no sesguen el análisis posterior. De lo contrario, retire el medio de cultivo centrifugando las células a 300 ×g durante cinco minutos.

Luego, tras eliminar el sobrenadante, añada medio de cultivo fresco precalentado que contenga 100 anom o cin, uno para neutralizar el pH ácido de los lisosomas, e incube durante una hora a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Disuelva el sustrato beta-galacto C12FDG en medio de cultivo fresco precalentado hasta una concentración final de dos milimolares. Tras la incubación con beilmicin.

Añada C 12 FDG directamente a las células y al medio hasta una concentración final de 33 micromolares e incube durante dos horas a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono. Después de la incubación, centrifugue las células a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Después de la centrifugación, lave las células dos veces con PBS, centrifugando cada vez como antes y eliminando el sobrenadante tras el segundo lavado. Reuspenda el sedimento celular en 500 microlitros de PBS frío y luego realice una inmunomarcación simultánea para caracterizar mejor la población de células senescentes. Si no tiene experiencia con citometría de flujo, el aspecto más difícil de este procedimiento será realizar el análisis mediante citometría de flujo.

Para garantizar el éxito, asegúrese de incluir los controles apropiados y busque ayuda de una persona sin experiencia según sea necesario. Antes de analizar la primera muestra, prepare un gráfico de dos parámetros que muestre el canal de dispersión directa (FSC) frente al canal de dispersión lateral (SSC). Luego, analice la primera muestra que contiene células no marcadas.

Configure los tubos fotomultiplicadores o PMT y defina una región de interés, excluyendo células muertas y restos celulares que podrían haber aparecido durante la preparación de la muestra. Esta región de interés en un histograma de un parámetro muestra la fluorescencia de C 12 FDG como FL uno en escala logarítmica en el eje X y el número de eventos en el eje Y. El número total de eventos representa la cantidad de células analizadas.

Configure el PMT de modo que las células no marcadas aparezcan en la primera década de la escala logarítmica del eje x. Determine la autofluorescencia de las células si es necesario, ejecutando las células no marcadas en el flujo. Ejecute en el citómetro el segundo muestra que contiene células no tratadas en el histograma de un parámetro que muestra FL; coloque el cursor después de la población débilmente marcada.

Este umbral permitirá la discriminación entre células no senescentes, que están débilmente marcadas, y células senescentes, que están intensamente marcadas. Ejecute la tercera muestra que contiene células tratadas. Las células senescentes intensamente marcadas aparecen por encima del umbral determinado en el paso anterior.

Evalúe el porcentaje de células senescentes dividiendo el número de eventos brillantes por el número total de eventos, si es necesario. La actividad de la beta-galactosidasa también puede estimarse utilizando la intensidad media de fluorescencia para evaluar la senescencia inducida por un procedimiento quimioterapéutico. La línea celular comercial de mieloma múltiple RPMI 8226 fue tratada durante dos días con doxorrubicina, un fármaco quimioterapéutico, y analizada para senescencia según se describe en este video; estos histogramas muestran la fluorescencia de células no tratadas a la izquierda y de células tratadas a la derecha.

Una población de células intensamente marcadas que representa células senescentes aparece en la región V. Paralelamente, la misma muestra celular se tiñó utilizando el ensayo de beta-galactosidasa. En esta imagen representativa se muestran células completamente azules y células parcialmente azules para ilustrar la dificultad para distinguir células senescentes verdaderamente azules. Para ilustrar la especificidad de C12FDG en la determinación del porcentaje de células senescentes, las células también se trataron con diversas concentraciones de doxorrubicina.

El porcentaje de células senescentes se determinó dividiendo el número de eventos brillantes entre el número total de eventos. Los porcentajes de células senescentes fueron 0,8%, 15,78% y 26,31% para una dosis de 5, 25 y 50 nanomolares de doxorrubicina, respectivamente. Esto demuestra que la marcación con C 12 FTG es específica para células senescentes.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar células senescentes mediante citometría de flujo, ya sea en serie o no, siguiendo este procedimiento; también se pueden realizar métodos como el marcado inmunológico para caracterizar las células senescentes. No olvide que trabajar con DMSO o células cancerosas puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar precauciones al realizar este procedimiento.