Name: Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprende a medir el módulo elástico de células vivas mediante microscopía de fuerza atómica. Este protocolo utiliza espectroscopía de fuerza y el modelo de Hertz para caracterizar propiedades mecánicas celulares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Los autores agradecen al Dr. Paul Janmey en la Universidad de Pennsylvania para el suministro de las líneas celulares utilizadas en este trabajo. QW también reconoce JF Byfield y Evan Anderson por sus discusiones interesantes sobre las técnicas de AFM.

1. Calibrar la constante del resorte del voladizo <ol><li> Cargar el voladizo en el AFM de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Es necesario limpiar el soporte voladizo con etanol antes de cualquier experimento. Esto ayudará a limitar la contaminación bacteriana de la cultura durante las mediciones de AFM. </li><li> Calibrar InvOLS (Inverse Sensibilidad palanca óptica). Este parámetro describe la cantidad de respuesta de fotodiodo (voltios) por nanómetro de deflexión voladizo. </li><li> Cargar un portaobjetos de vidrio limpio en la etapa de la muestra, a continuación, instalar la cabeza AFM y ajustar el haz de láser y la alineación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Enganche la punta del AFM en el portaobjetos de vidrio. </li><li> Con el piezo retirado, vuelva a alinear el espejo a una lectura fotodiodo -2 V. Realizar una medición espectroscopia de fuerza con un punto de disparo (respuesta máxima fotodiodo) de 2 V. </li><li> Con el piezo retirado, vuelva a alinear el espejo a una lectura fotodiodo -2 V. Realizar una force medición espectroscopía con un punto de disparo (respuesta máxima fotodiodo) de 2 V. Nota: Los valores de tensión aquí son específicos para el Asilo de AFM. Este valor debe establecerse de acuerdo con las especificaciones establecidas por el fabricante. Después de la adquisición de datos es completa, hacer zoom en la región firme contacto de la curva de fuerza. Realizar un ajuste lineal a esta región para encontrar la pendiente, que estará en V / nm. El recíproco de este valor describe la sensibilidad óptica del conjunto voladizo-fotodiodo. </li><li> Cambiar la alineación del espejo a una desviación gratuita de 0 V. </li><li> Calibrar la constante de resorte en voladizo. Un método térmico-sintonía se utiliza para determinar la constante del resorte en voladizo 28. </li><li> Después de calibrar los InvOLS, elevar el escáner fuera de la etapa de la muestra de tal manera que no hay interacciones entre la punta y la muestra. </li><li> Comienza la captura de los datos térmicos. Durante este proceso, la vibración térmica de la viga en voladizo es Recorded. El software AFM analiza un espectro de potencia de una vibración y se representa en una ventana de datos térmicos tales. </li><li> Después de unos pocos segundos de adquisición de datos, realizar un ajuste para el segmento de datos centrada en la más baja-frecuencia (resonancia fundamental) pico para determinar la constante del resorte. </li></ol> 2. Carga de la muestra <ol><li> Instale el accesorio calentador del plato en el escenario AFM, si no está ya equipado. </li><li> Ajustar la temperatura a 37 ° C, y esperar 20 minutos para que el sistema alcance un equilibrio térmico estable. </li><li> Coloque la placa de cultivo en la etapa de AFM y fijarlo con la abrazadera suministrada con el calentador de plato. Es importante reducir al mínimo el tiempo entre la retirada de la placa de la incubadora y colocándolo en el escenario, para evitar el trauma a las células. Para las mediciones de más de 30 min, se debe utilizar CO 2 medio independiente para reemplazar el medio de cultivo normal. </li><li> Aplicar una pequeña gota de 37 ° C el medio de cultivo a la punta de tque AFM voladizo, y bajar la cabeza hasta la punta de AFM se acaba sumergido en líquido. </li><li> Uso de la cámara CCD vista superior, vuelva a alinear el haz de láser en el voladizo (la alineación en el líquido será diferente que en el aire, debido al cambio en el índice de refracción del medio). </li><li> Enganche la punta del AFM en una zona limpia de la placa de cultivo. </li><li> Realice la calibración de los InvOLS como se describe anteriormente, para la sensibilidad voladizo en el medio líquido. </li></ol> Nota: a) Si las células se cultivan en hidrogeles, la calibración de InvOLS se debe realizar de antemano contra la superficie inferior de una placa de cultivo lleno de medios de cultivo celular. Al cambiar a muestras de células, la atención especial se ha de pagar para no cambiar la alineación del haz láser con el voladizo. b) InvOLS tiene que ser recalibrado cada vez que hay un cambio en la alineación láser. c) También se recomienda tomar InvOLS como el promedio del valor de varias curvas de calibración, sesde cada calibración genera un diferente InvOLS. La variación en InvOLS es, sin embargo, pequeña en comparación con el valor medio. Por ejemplo, calibrar un DNP-10 cantilever Bruker con constante 0,06 N / m de líquido en 100 veces la primavera producir un valor InvOLS media de 66,3 nm / V, con una desviación estándar de sólo 0,5 nm / V. 3. Recopilación de curvas de fuerza de sangría célula <ol><li> Seleccione una celda para el sangrado. Con la ayuda del microscopio óptico, mover la etapa de posicionar el voladizo por encima de la celda de modo que la punta se encuentra en la región peri-núcleos. Ajuste preciso de la posición de voladizo se puede lograr mediante la aplicación de las compensaciones a las direcciones X e Y escáneres. Nota: El cantilever de AFM tiene que ser retirado de la superficie de la muestra mientras se mueve la etapa de la muestra para seleccionar una célula diana. Esto protege el voladizo de golpear en la muestra, ya que la superficie de la muestra puede no ser plana. </li><li> Cambiar a forzar el modo de Espectroscopía. Establezca la sangríacomprendida dentro de la gama de 1-10 m / seg, lo suficientemente bajas para evitar efectos hidrodinámicos. </li><li> Ajuste del punto de disparo de desviación, lo que limita la fuerza máxima de sangría para evitar daño a las células. Seleccionar la opción de activación relativa, que para corregir cualquier desviación en la señal de deflexión. La fuerza máxima de 2 nN es un buen punto de partida para la mayoría de las muestras. Este valor, sin embargo, debe ser ajustado de acuerdo a la rigidez de la muestra. Para las muestras suaves un valor más bajo se debe utilizar para evitar la sangría excesiva a la muestra. Para las muestras de rigidez un valor alto se debe utilizar para generar indentación medible. </li><li> Ajustar la distancia de la fuerza lo suficientemente grande como para asegurar que la punta estará totalmente separada de la célula entre las medidas de fuerza. Por lo general, la distancia de la fuerza se establece en 5 micras. </li><li> Dirige el AFM para tomar una sola curva de fuerza. </li><li> Recoge al menos tres curvas de fuerza en diferentes lugares en la región peri-núcleos de cada célula. Aunque es beneficioso tomar múltiplescurvas en cada celda de datos estadísticos fiables, teniendo demasiadas curvas de fuerza puede conducir a cambios en la rigidez celular debido a la tensión de la sonda de AFM. </li><li> Cuando la recolección de datos se completa, retire la punta, y repita los pasos 3.1 a 3.6 por tantas células como sea necesario para los buenos datos estadísticos sobre la rigidez celular bajo una cierta condición de muestra. Por lo general, las células 30 se miden para cada condición. </li></ol> Para caracterizar la distribución de la rigidez dentro de una sola célula, se aplica el modo de fuerza-mapa. En el modo de trabajo de ruta, establezca un tamaño de escaneado para incluir la región de interés, establecer una resolución adecuada, establecer los parámetros de sangría que las seleccionadas para las curvas de fuerza individuales, el AFM Luego de trama a través de la zona de muestreo definido y tomar curvas de fuerza individuales en cada pixel en la región de la muestra. 4. Análisis de Datos Las curvas de fuerza registrados se analizaron mediante un procedimiento de encargo MATLAB para calcular la rigidez de células. La siguiente es una breve descripción del procedimiento de MATLAB: <ol><li> El programa MATLAB identifica el punto de contacto coordina z0 y d0 (véase la Figura 1) utilizando un algoritmo adoptado de un método publicado por Lin et al 29.: </li><li> Para cada punto de datos de la curva de fuerza, lleve a cabo un ajuste lineal de los datos a la izquierda del punto de interés, y un modelo de Hertz encaja a la derecha (con el punto seleccionado como el punto inicial de contacto), hasta el conjunto máxima muesca (200-300 nm recomendado). </li><li> Para cada punto, se calcula el error RMS relativa de los dos ataques y la suma de estos valores. </li><li> El punto que alcanza el error de ajuste total mínima es seleccionado como el punto inicial de contacto. Nota: El tiempo de cálculo puede reducirse mediante la aplicación de una búsqueda de sección áurea-en lugar de escaneado linealmente toda la curva de la fuerza. </li><li> Muestra δ deformación y la sangría de la fuerza F se calcula como: <img alt="Ecuación 1"fo: content-width = &quot;3.073in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50497/50497eq1.jpg&quot; /&gt; </li><li> Un ajuste de mínimos cuadrados se aplica para adaptarse a la F vs datos δ en la región de post-contacto, z ≥ z 0, para el modelo de Hertz para extraer el módulo de Young, E de la célula: <img alt="Ecuación 2" fo:content-width="2.773in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50497/50497eq2.jpg" /> , Donde v es la relación de Poisson. Nota: Cuando δ es más de 10% del espesor de la muestra (altura de la celda), la rigidez de células medido se ve afectada por la rigidez del sustrato. El espesor de la región perinuclear es generalmente del orden de unos pocos micrómetros. Por lo tanto, sólo los primeros 200-300 nm de F-δ curva se ajustan al modelo de Hertz. </li></ol>

<ol><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Wagner, O. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Softness%2C+strength+and+self-repair+in+intermediate+filament+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Softness, strength and self-repair in intermediate filament networks.</a> Exp. Cell Res. 313, 2228-2235 (2007).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+behavior+in+living+cells+consistent+with+the+tensegrity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 7765-7770 (2001).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+prestress.+I.+Stiffness+and+prestress+are+closely+associated+in+adherent+contractile+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282, 606-616 (2002).</li>
<li>Kasza, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamin+A+is+essential+for+active+cell+stiffening+but+not+passive+stiffening+under+external+force%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Filamin A is essential for active cell stiffening but not passive stiffening under external force.</a> Biophysical Journal. 96, 4326-4335 (2009).</li>
<li>Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanics+as+an+indicator+of+cytoskeletal+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanics as an indicator of cytoskeletal structure and function.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 397-430 (1988).</li>
<li>Schafer, A., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+myosin+II+activity+on+stiffness+of+fibroblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Influence of myosin II activity on stiffness of fibroblast cells.</a> Acta Biomaterialia. 1, 273-280 (2005).</li>
<li>Guck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+deformability+as+an+inherent+cell+marker+for+testing+malignant+transformation+and+metastatic+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Optical deformability as an inherent cell marker for testing malignant transformation and metastatic competence.</a> Biophysical Journal. 88, 3689-3698 (2005).</li>
<li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2, 780-783 (2007).</li>
<li>Plodinec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nanomechanical+signature+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The nanomechanical signature of breast cancer.</a> Nature Nanotechnology. 7, 757-765 (2012).</li>
<li>Rotsch, C., Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+changes+of+cytoskeletal+structure+and+mechanics+in+fibroblasts%3A+an+atomic+force+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Drug-induced changes of cytoskeletal structure and mechanics in fibroblasts: an atomic force microscopy study.</a> Biophysical Journal. 78 (00), 520-535 (2000).</li>
<li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Lu, Q. Y., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+extract+selectively+targets+nanomechanics+of+live+metastatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Green tea extract selectively targets nanomechanics of live metastatic cancer cells.</a> Nanotechnology. 22, 215101(2011).</li>
<li>Hoffman, B. D., Crocker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+dissecting+the+physical+responses+of+cells+to+force%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: dissecting the physical responses of cells to force.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 259-288 (2009).</li>
<li>Hoffman, B. D., Massiera, G., Van Citters, K. M., Crocker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+consensus+mechanics+of+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The consensus mechanics of cultured mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10259-10264 (2006).</li>
<li>Lau, A. W., Hoffman, B. D., Davies, A., Crocker, J. C., Lubensky, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microrheology%2C+stress+fluctuations%2C+and+active+behavior+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Microrheology, stress fluctuations, and active behavior of living cells.</a> Physical Review Letters. 91, 198101(1981).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microrheology+probes+length+scale+dependent+rheology%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Microrheology probes length scale dependent rheology.</a> Physical Review Letters. 96, 118104(2006).</li>
<li>Deng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+slow+dynamics+of+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Fast and slow dynamics of the cytoskeleton.</a> Nature Materials. 5, 636-640 (2006).</li>
<li>Oh, M. J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+Aspiration+of+Substrate-attached+Cells+to+Estimate+Cell+Stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness.</a> J. Vis. Exp. (67), e3886(2012).</li>
<li>Hochmuth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+aspiration+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Micropipette aspiration of living cells.</a> Journal of Biomechanics. 33, 15-22 (2000).</li>
<li>Levental, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+indentation+device+for+measuring+micrometer-scale+tissue+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys-Condens.+Mat%22%5BJournal%5D)">A simple indentation device for measuring micrometer-scale tissue stiffness.</a> J. Phys-Condens. Mat. 22, (2010).</li>
<li>Mahaffy, R. E., Park, S., Gerde, E., Kas, J., Shih, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+viscoelastic+properties+of+thin+regions+of+fibroblasts+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the viscoelastic properties of thin regions of fibroblasts using atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 86, 1777-1793 (2004).</li>
<li>Radmacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+elastic+properties+of+biological+samples+with+the+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Magazine%3A+The+Quarterly+Magazine+of+the+Engineering+in+Medicine+%26+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Measuring the elastic properties of biological samples with the AFM.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine: The Quarterly Magazine of the Engineering in Medicine & Biology Society. 16, 47-57 (1997).</li>
<li>Crocker, J. C., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-particle+tracking+and+two-point+microrheology+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple-particle tracking and two-point microrheology in cells.</a> Methods in Cell Biology. 83, 141-178 (2007).</li>
<li>Liu, F., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-mechanical+characterization+of+lung+tissue+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy.</a> J. Vis. Exp. (54), e2911(2011).</li>
<li>Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+adaptation+and+stiffness+matching+to+soft+elastic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates.</a> Biophysical Journal. 93, 4453-4461 (2007).</li>
<li>Wu, H. W., Kuhn, T., Moy, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+l929+cells+measured+by+atomic+force+microscopy%3A+Effects+of+anticytoskeletal+drugs+and+membrane+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of l929 cells measured by atomic force microscopy: Effects of anticytoskeletal drugs and membrane crosslinking.</a> Scanning. 20, 389-397 (1998).</li>
<li>Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+viscoelastic+properties+of+human+platelets+with+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 70, 556-567 (1996).</li>
<li>Levy, R., Maaloum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+spring+constant+of+atomic+force+microscope+cantilevers%3A+thermal+fluctuations+and+other+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods.</a> Nanotechnology. 13, 33-37 (2002).</li>
<li>Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+strategies+for+automated+AFM+force+curve+analysis--I.+Non-adhesive+indentation+of+soft%2C+inhomogeneous+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 129, 430-440 (2007).</li>
<li>Davis, J. T., Wen, Q., Janmey, P. A., Otteson, D. C., Foster, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muller+cell+expression+of+genes+implicated+in+proliferative+vitreoretinopathy+is+influenced+by+substrate+elastic+modulus%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Muller cell expression of genes implicated in proliferative vitreoretinopathy is influenced by substrate elastic modulus.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 3014-3019 (2012).</li>
<li>Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtissue+elasticity%3A+Measurements+by+atomic+force+microscopy+and+its+influence+on+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtissue elasticity: Measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation.</a> Method Cell Biol. 83, 521-545 (2007).</li>
<li>Lele, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+to+study+cell+mechanics+and+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tools to study cell mechanics and mechanotransduction.</a> Methods in Cell Biology. 83 (07), 443-472 (2007).</li>
<li>A-Hassan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+microelastic+mapping+of+living+cells+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 74, 1564-1578 (1998).</li>
<li>Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Hertzian+approach+to+analyzing+mechanical+properties+of+endothelial+cells+probed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Non-Hertzian approach to analyzing mechanical properties of endothelial cells probed by atomic force microscopy.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 128, 176-184 (2006).</li>
<li>Xiong, Y., Lee, A. C., Suter, D. M., Lee, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+and+nanomechanics+of+live+neuronal+growth+cones+analyzed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Topography and nanomechanics of live neuronal growth cones analyzed by atomic force microscopy.</a> Biophysical Journal. 96, 5060-5072 (2009).</li>
<li>Byfield, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+filamin+A+prevents+cells+from+responding+to+stiffness+gradients+on+gels+coated+with+collagen+but+not+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Absence of filamin A prevents cells from responding to stiffness gradients on gels coated with collagen but not fibronectin.</a> Biophysical Journal. 96, 5095-5102 (2009).</li>
<li>Cross, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM-based+analysis+of+human+metastatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">AFM-based analysis of human metastatic cancer cells.</a> Nanotechnology. 19, 384003(2008).</li>
<li>Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+elasticity+in+biological+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nonlinear elasticity in biological gels.</a> Nature. 435, 191-194 (2005).</li>
<li>Wen, Q., Janmey, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+physics+of+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Solid+State+%26+Materials+Science%22%5BJournal%5D)">Polymer physics of the cytoskeleton.</a> Current Opinion in Solid State & Materials Science. 15, 177-182 (2011).</li>
<li>Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+elastic+moduli+of+thin+layers+of+soft+material+using+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 82 (02), 2798-2810 (2002).</li>
<li>Trache, A., Lim, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+response+to+mechanical+stimulation+studied+by+integrated+optical+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy.</a> J. Vis. Exp. (44), e2072(2010).</li>
<li>Lim, S. M., Kreipe, B. A., Trzeciakowski, J., Dangott, L., Trache, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+effect+on+RhoA+signaling+modulation+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix effect on RhoA signaling modulation in vascular smooth muscle cells.</a> Exp. Cell Res. 316, 2833-2848 (2010).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método de indentación AFM tiene ventajas para caracterizar las propiedades mecánicas de las células vivas. Aunque menos sensible que la citometría de torsión magnético y pinzas ópticas, que puede medir fuerzas en el nivel picoNewton 32, el AFM puede detectar la fuerza de resistencia de las muestras que van desde decenas de pico-Newton a cientos de nano-Newton, comparable a la gama de la fuerza que se puede aplicar a las células utilizando una micropipeta 19. Este rango de la fuerza se ajusta a l...

Las propiedades mecánicas, especialmente la rigidez, de células individuales y sus matrices extracelulares que rodean (ECM) son fundamentales para muchos procesos biológicos, incluyendo el crecimiento celular, la motilidad, la división, diferenciación, y la homeostasis del tejido. 1 Se ha demostrado que la rigidez mecánica de células está determinada principalmente por el citoesqueleto, especialmente las redes de actina y filamentos intermedios y otras proteínas asociadas con ellos. 2 Los resultados de ensayos mecánicos sobre en redes in vitro de actina y filamentos intermedios sugieren que la mecánica de células es dependiente en gran medida de la estructura del citoesqueleto y la pre-tensión en el citoesqueleto. 3-5 Rigidez de células vivas se considera entonces como un índice para evaluar la estructura del citoesqueleto 6, la actividad de la miosina 7 y muchos otros procesos celulares. Más importante aún, los cambios en las propiedades mecánicas de células también se encuentran a menudo para ser estrechamente asociadosocasionada por la diversas condiciones de enfermedad, tales como la formación de tumores y la metástasis 8-10 Control de la rigidez mecánica de las células vivas por lo tanto, puede proporcionar una nueva manera de controlar la fisiología celular;. para detectar y diagnosticar enfermedades 8;., y para evaluar la eficacia de los tratamientos farmacológicos 11 , 12 Múltiples métodos incluyendo microrheology partícula de seguimiento, 13-16 magnética citometría de torsión, 17 micropipeta aspiración 18,19 y microindentación 20-22 se han desarrollado para medir la elasticidad de las células. Partículas microrheology seguimiento rastrea las vibraciones térmicas de cualquiera de las partículas fluorescentes submicrométricos inyectados en células o marcadores de referencia dentro del citoesqueleto celular. 23 propiedades elásticas y viscosas de células se calculan a partir de los desplazamientos de partículas medidos utilizando el teorema de fluctuación-disipación. 14,23 Este método permite mediciones simultáneas de localespropiedades mecánicas con alta resolución espacial en distintos lugares de una célula. Sin embargo, la inyección de partículas fluorescentes en las células puede conducir a cambios en la función celular, la estructura del citoesqueleto, y por lo tanto la mecánica celular. El método de aspiración con micropipeta se aplica presión negativa en una micropipeta de diámetro varía de 1 a 5 micras para aspirar una pequeña pieza de membrana celular en la pipeta. Rigidez celular se calcula a partir de la presión negativa aplicada y la deformación de la membrana celular. 18 Este método, sin embargo, no puede detectar la distribución heterogénea de la rigidez a través de la célula. Citometría de torsión magnética (MTC) se aplica el campo magnético para generar par de torsión sobre perlas de súper paramagnéticas unidas a la membrana celular. 17 rigidez célula se deriva en este método a partir de la relación entre el par aplicado y la deformación de torsión de la membrana celular. Es difícil controlar la ubicación de perlas magnéticas en el método de MTC, y también es challenging para caracterizar la deformación de torsión con alta resolución. Microindentación se aplica un penetrador con una geometría bien definida para perforar en la célula. La fuerza de penetración y la indentación resultante en las células a menudo siguen la predicción del modelo de Hertz. Módulos de Young de las células se puede calcular a partir de las curvas de fuerza-indentación ajustándolas al modelo de Hertz. Este método ha sido ampliamente aplicado para probar las propiedades mecánicas de los tejidos y las células a pesar de sus limitaciones, tales como la incertidumbre en la determinación del punto de contacto, la aplicabilidad del modelo de Hertz, y el potencial para dañar físicamente las células. Entre los muchos dispositivos para microindentaion 20, el Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) está disponible comercialmente y se ha aplicado ampliamente para caracterizar las propiedades mecánicas de las células y tejidos vivos 21,24-27. En este trabajo se demuestra el procedimiento de utilizar un asilo MFP3D-Bio AFM para caracterizar la mecánica celular. AFM no enLY proporciona topografía de alta resolución de las células, pero también se ha aplicado ampliamente para caracterizar las propiedades mecánicas de las células del tejido. El principio de AFM indentación se ilustra en la Figura 1. El cantilever de AFM se aproxima a la célula desde unos pocos micrómetros más arriba; hace contacto con la célula; guiones la célula de modo que la deflexión voladizo alcanza un punto de consigna preseleccionado, y se aleja de la célula. Durante este proceso, la deflexión en voladizo se registra como una función de su ubicación, como se muestra en la Figura 1. Antes de hacer contacto con la célula, el voladizo se mueve en el medio sin ninguna desviación aparente. Cuando sangría en la célula, las curvas en voladizo y se incrementa la señal de deflexión. Los voladizos se modelan como vigas elásticas para que su desviación es proporcional a la fuerza aplicada a la célula. Al establecer la deflexión máxima en voladizo, la máxima magnitud de la fuerza aplicada a la muestra es limitada para evitar dNingún daño a las células. La porción de la curva de fuerza desde el punto B al punto C en la Figura 1, donde los guiones punta en la célula, se adaptan al modelo de hercios para extraer la rigidez celular. <img src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50497/50497fig1highres.jpg"/> Figura 1. Ilustración de la AFM microindentación e interpretación de la curva de fuerza. El panel superior muestra el movimiento de la AFM voladizo accionada por el escáner piezoeléctrico. La ubicación vertical del voladizo z y la deflexión en voladizo señal d se registra durante el proceso. El voladizo se inicia desde el punto a, unos pocos micrómetros por encima de la celda. Al acercarse a la célula, la muestra δ indentación permanece en cero hasta que se alcanza el punto B, donde la punta entra en contacto con la célula. Las coordenadas del punto b en el diagrama son valores críticospara el análisis de datos, que se denota por (z 0, d 0&gt;). De B ​​a C, los guiones en voladizo en la célula hasta que la deflexión voladizo llega a un punto de ajuste, que se ajusta para que sea la relación entre la fuerza de penetración máxima al final del voladizo y la constante del resorte. Una vez que la señal de deflexión alcanza el valor máximo prefijado, el voladizo se retira entonces de la célula al punto d, donde a menudo ser tirado hacia abajo debido a la adhesión de la punta-de la muestra, se separa de la célula y vuelve a su ubicación inicial en el correo. El panel de la derecha ilustra la relación entre la indentación y la z grabada y la señal d. En en el panel inferior izquierdo es un gráfico de una curva representativa fuerza, la indentación máximo de un voladizo, de que la constante del resorte se mide a ser 0.07N / m, se ajusta para que sea 17 nm de manera que la fuerza máxima aplicada a la sangría muestra es 1,2 nN. Los puntos clave durante el sangrado se marcan.

<table><tbody><tr><td>microscopio de fuerza atómica </td><td>Asylum Research</td><td>MFP3D-BIO</td><td></td></tr></tbody></table>

medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Las propiedades mecánicas de las células y la matriz extracelular (ECM) desempeñan papeles importantes en muchos procesos biológicos, incluyendo la diferenciación de células madre, la formación del tumor, y la cicatrización de heridas. Los cambios en la rigidez de las células y ECM son a menudo signos de cambios en la fisiología celular o enfermedades en los tejidos. Por lo tanto, la rigidez de células es un índice para evaluar el estado de los cultivos celulares. Entre la multitud de métodos aplicados para medir la rigidez de las células y tejidos, micro-indentación usando un Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) proporciona una manera de medir de forma fiable la rigidez de las células vivas. Este método ha sido aplicado ampliamente para caracterizar la rigidez de micro-escala para una variedad de materiales que van desde superficies metálicas a los tejidos biológicos blandos y células. El principio básico de este método es para sangrar una célula con una punta de AFM de la geometría seleccionada y medir la fuerza aplicada a partir de la flexión del cantilever de AFM. Montaje de la curva fuerza-sangría para el modo de Hertzl para la geometría de la punta correspondiente puede dar mediciones cuantitativas de la rigidez del material. En este trabajo se demuestra el procedimiento para caracterizar la rigidez de las células vivas utilizando AFM. Se demuestran los pasos clave, incluyendo el proceso de calibración de AFM, la adquisición de la fuerza de la curva, y el análisis de datos mediante una rutina de MATLAB. También se discuten las limitaciones de este método.

La Figura 2a muestra tres curvas de fuerza representativas tomadas a partir de fibroblastos 3T3 cultivadas en la superficie de plástico, gel de poliacrilamida de los módulos de Young 3000 Pa y 17.000 Pa, respectivamente. Después de identificar cuidadosamente los puntos de contacto en las curvas, la fuerza de penetración en función de la deformación celular se representa en la Figura 2b. Bajo una fuerza de magnitud menor que 0,3 nN, una forma de pirámide guiones punta 3 micrómetros en un...

Este documento demuestra un protocolo para caracterizar las propiedades mecánicas de las células vivas por medio de microindentación utilizando un Microscopio de Fuerza Atómica (AFM).

Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en medir el módulo elástico de células vivas utilizando un microscopio de fuerza atómica. Esto se logra primero realizando mediciones de espectroscopía de fuerza por FM en diversas ubicaciones sobre la célula. Como segundo paso, se analiza cada curva de fuerza-distancia para determinar el punto en el que la punta de FM entra inicialmente en contacto con la célula.A continuación, comenzando en el punto de contacto, los primeros 200 a 300 nanómetros de datos de indentación se ajustan al modelo de Hertz. Con el fin de extraer el módulo elástico, los resultados generan un mapa 2D de la rigidez celular obtenido mediante el modo de mapeo de fuerza, en el que cada píxel representa una curva individual de fuerza-distancia. El procedimiento será demostrado por Guen Thomas, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para iniciar este procedimiento, limpie el porta-muestra del cantiléver con etanol al 70 % y deje que se seque.A continuación, cargue un cantiléver bru DNP 10 en el MF A según las instrucciones del fabricante. Luego, calibre la sensibilidad del inverso del brazo óptico. Este parámetro describe la cantidad de respuesta del f

measuring-mechanical-properties-living-cells-using-atomic-force

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Este documento tiene como objetivo instruir al lector en la operación de una fuerza integrada atómica microscopio óptico de imagen para la estimulación mecánica de las células vivas en la cultura. Un protocolo de paso a paso se presenta. Un conjunto representativo de datos que muestra la respuesta de células vivas a la estimulación mecánica se presenta.

Respuesta de células vivas a la estimulación mecánica estudiados por microscopía óptica integrada la Fuerza Atómica y

Aquí detallamos las técnicas experimentales usadas para evaluar las fuerzas de la saliente que podosomes aplicar sobre una película compatible con, desde la preparación de la película para el análisis automatizado de imágenes topográficas.

Microscopia de la fuerza de protrusión: Un método para cuantificar las fuerzas desarrolladas por salientes de celular

Aquí, presentamos un protocolo para el uso simultáneo de Förster Resonancia Sensores de tensión basado en la transferencia de energía para medir recuperación de carga y de la fluorescencia de la proteína después de photobleaching para medir la dinámica de la proteína que permite la medida de fuerza-sensible dinámica de proteínas dentro de células vivas.

Medición de la proteína sensible a la fuerza dinámica en células vivas usando una combinación de técnicas fluorescentes

Presentamos un protocolo para funcionalizar los voladizos del microscopio de fuerza atómica (AFM) con una sola célula T y partícula de cuentas para estudios inmunológicos. Se muestran los procedimientos para sondear la unión de células T de un solo par por AFM y para monitorear la respuesta celular en tiempo real de los macrófagos a una sola partícula sólida por AFM con imágenes de fluorescencia.

Funcionalización de voladizos de microscopio de fuerza atómica con células de una t o de una sola partícula para espectroscopia de fuerza de una sola célula inmunológica

Aquí, presentamos la microscopía de fuerza atómica (AFM), operada como una herramienta de nano- y micro-indentación en células y tejidos. El instrumento permite la adquisición simultánea de la topografía de superficie 3D de la muestra y sus propiedades mecánicas, incluyendo el módulo de Young de la pared celular, así como la presión del turgencia.

Uso de la Microscopía de Fuerza Atómica para Medir las Propiedades Mecánicas y la Presión Turgor de Células Vegetales y Tejidos Vegetales

Este protocolo tiene como objetivo automatizar las mediciones de AFM en cientos de células microbianas. En primer lugar, los microbios se inmovilizan en microestructuras de sello PDMS y luego las mediciones de espectroscopia de fuerza se realizan automáticamente en cientos de células inmovilizadas.

Automatización De Las Mediciones De Microscopio De Fuerza Bio-Atómica En Cientos De Células De C. albicans

Aquí se presenta el protocolo de la técnica Conpokal, que combina la microscopía de fuerza confocal y atómica en una sola plataforma de instrumento. Conpokal proporciona la misma célula, misma región, cerca de imágenes confocales simultáneas y caracterización mecánica de muestras biológicas vivas.

Microscopía de Fuerza Atómica y Confocal de Escaneo Láser Casi Simultánea (Conpokal) en Células Vivas

Aquí, presentamos un protocolo para investigar las propiedades mecánicas intracelulares de células embrionarias aisladas de pez cebra en confinamiento tridimensional con medición directa de la fuerza mediante una trampa óptica.

Mediciones directas de la fuerza de la mecánica subcelular en confinamiento utilizando pinzas ópticas

Los estudios de biomecánica de la pared celular son esenciales para comprender el crecimiento y la morfogénesis de las plantas. Se propone el siguiente protocolo para investigar las paredes celulares primarias delgadas en los tejidos internos de órganos de plantas jóvenes utilizando microscopía de fuerza atómica.

Caracterización de las propiedades mecánicas de la pared celular primaria en órganos vegetales vivos mediante microscopía de fuerza atómica

La cuantificación del área de contacto y la fuerza aplicada por la punta de una sonda de microscopio de fuerza atómica (AFM) a una superficie de muestra permite la determinación de propiedades mecánicas a nanoescala. Se discuten las mejores prácticas para implementar la nanoindentación basada en voladizo AFM en aire o fluido en muestras blandas y duras para medir el módulo elástico u otras propiedades nanomecánicas.

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

Aprende a medir el módulo elástico de células vivas mediante microscopía de fuerza atómica. Este protocolo utiliza espectroscopía de fuerza y el modelo de Hertz para caracterizar propiedades mecánicas celulares.

Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Explorar más videos