Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

El objetivo general del siguiente experimento es medir el módulo elástico de células vivas utilizando un microscopio de fuerza atómica. Esto se logra realizando primero mediciones de espectroscopia de fuerza FM en varios lugares de la célula. Como segundo paso, se analiza cada curva de distancia forzada para determinar el punto en el que la punta A FM hace contacto inicialmente con la celda.

A continuación, comenzando en el punto de contacto, los primeros 200 a 300 nanómetros de datos de indentación se ajustan al modelo de hercios. Con el fin de extraer el módulo elástico, los resultados arrojan un mapa 2D de la rigidez de la celda obtenido mediante el uso del modo de mapeo de fuerzas, donde cada píxel representa una sola curva de distancia forzada. Para comenzar este procedimiento, limpie el soporte en voladizo con etanol al 70% y deje que se seque.

A continuación, cargue un voladizo bru DNP 10 en el A FM de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, calibrar la sensibilidad inversa de la palanca óptica. Este parámetro describe la cantidad de respuesta del fotodiodo en voltios por nanómetro de deflexión en voladizo.

Para lograr esto, primero cargue un portaobjetos de vidrio limpio en la platina de muestra. Instale un cabezal FM y ajuste el rayo láser y la alineación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una vez alineado, enganche la punta A FM en la corredera de vidrio con el P eight O retirado.

Vuelva a alinear el espejo a una lectura de fotodiodo de menos dos voltios. A continuación, realice una medición por espectroscopia de fuerza con una respuesta máxima del fotodiodo o un punto de activación de dos voltios positivos. Una vez completada la adquisición de datos, acérquese a la región de contacto firme de la curva de fuerza y realice un ajuste lineal a esta región.

Para encontrar la pendiente en voltios por nanómetro, restablezca la alineación del espejo a una deflexión libre de cero voltios. A continuación, calibre la constante del resorte en voladizo utilizando el método de ajuste térmico descrito por Levy y Malam. Para comenzar, eleve el escáner lejos de la etapa de muestra para que no haya interacciones entre la punta y la muestra.

A continuación, capture los datos térmicos registrando la vibración térmica de la viga en voladizo. El software A FM analiza un espectro de potencia de dicha vibración térmica y lo traza en una ventana de datos. A continuación, realice un ajuste al segmento de datos centrado en la frecuencia más baja, también conocida como pico de resonancia fundamental para determinar la constante de resorte.

Para preparar el a FM para las placas de cultivo, instale un accesorio de calentador de platos en la etapa a FM y ajuste la temperatura a 37 grados centígrados. Espere 20 minutos para que el sistema alcance un equilibrio térmico estable. Una vez precalentado, coloque un plato de cultivo en la etapa FM y asegúrelo con la abrazadera provista con el calentador de platos para mediciones de más de 30 minutos, se debe usar un medio independiente del dióxido de carbono para reemplazar el medio de cultivo normal.

A continuación, aplique una pequeña gota de medio de cultivo a 37 grados centígrados en la punta del voladizo A FM y baje el cabezal A FM hasta que la punta quede sumergida en líquido. Con una cámara CCD de vista superior, realinee el rayo láser en el voladizo. La alineación en líquido será diferente a la de un aire debido al cambio en el índice de refracción del medio.

Una vez alineado, enganche la punta A FM en un área libre de celdas de la placa de cultivo y realice la calibración de la sensibilidad inversa de la palanca óptica en el entorno líquido. Para comenzar las mediciones de las propiedades mecánicas de las células, coloque la punta en voladizo sobre la región del ojo de perle de una célula con la ayuda de un microscopio óptico. Los ajustes precisos de la posición de los voladizos se logran mediante la aplicación de compensaciones a los escáneres X e Y.

A continuación, cambie el a FM al modo de cuatro espectroscopías y ajuste la tasa de indentación a cinco micrómetros por segundo, que es lo suficientemente baja como para evitar efectos hidrodinámicos. A continuación, establezca el punto de activación de deflexión en dos nano newtons. Para evitar dañar las celdas, ajuste este valor de acuerdo con la rigidez de la muestra.

Además, seleccione la opción de activación relativa, que corregirá cualquier desviación en la señal de desviación. A continuación, ajuste la distancia de fuerza a cinco micrómetros para asegurarse de que la punta se separe completamente de la célula entre las mediciones de fuerza. Recoja tres curvas de fuerza en diferentes ubicaciones en la región del núcleo de al menos 30 celdas para cada condición.

Aunque es beneficioso tomar múltiples curvas en cada celda. Para obtener datos estadísticos confiables, tomar demasiados puede provocar cambios en la rigidez de la celda a la angustia de la sonda A FM. Caracterice aún más la distribución de las propiedades mecánicas a lo largo de una sola celda utilizando el modo de mapa de fuerza.

En el modo de mapa de fuerza, establezca el tamaño de escaneo en 30 micrómetros, la resolución en 32 por 32 y los parámetros de sangría son los mismos que los seleccionados para las curvas de fuerza única. A continuación, el A FM tomará curvas de fuerza única en cada píxel de la región de muestra y proporcionará un mapa de rigidez de toda la región. A continuación, analice las curvas de fuerza registradas con MATLAB para calcular la rigidez de la celda.

Comience adoptando un algoritmo publicado por primera vez por Lynette Al, que calcula tanto un ajuste lineal como un ajuste de hercios desde cada punto utilizando matlab. Calcule el error RMS relativo de ambos ajustes y sume estos valores en cada punto. Se selecciona el punto que alcanza el error de ajuste total mínimo como punto de contacto inicial, la localización de este punto es crucial para la medición precisa del módulo de las crías.

A continuación, calcule el delta de deformación de la muestra. Usando las siguientes ecuaciones, con la deformación es igual a cero antes del contacto con la celda, donde Z es menor que Z cero y es igual a la diferencia entre la deflexión del voladizo D y la distancia total Z más allá del punto de contacto. A continuación, calcule la fuerza de indentación F utilizando las siguientes ecuaciones, donde la fuerza es igual a cero antes del contacto con la celda, donde Z es menor que Z cero y es igual a la constante de resorte K del voladizo multiplicada por la deflexión del voladizo más allá del punto de contacto.

A continuación, se aplica el ajuste del cuadrado de Elise a los datos de deformación de la muestra frente a la fuerza de indentación en la región posterior al contacto del modelo de hercios para extraer el módulo de Young de la célula en función de la forma de la punta utilizada que se muestra. A continuación se muestran curvas de fuerza representativas tomadas de tres células T tres fiberblast cultivadas en tres superficies diferentes. Como puede ver aquí, diferentes superficies pueden influir en gran medida en la rigidez del citoesqueleto celular.

La deformación media de las células cultivadas en una superficie de plástico duro se muestra en rojo. Los que crecen en un gel rígido de poliacrilamida se muestran en púrpura, y los que crecen en un gel elástico de poliacrilamida se muestran en azul. Después de identificar cuidadosamente los puntos de contacto en las curvas, se pueden mostrar con precisión las fuerzas de indentación en función de la deformación de la célula.

Además, su Young es modular, se puede calcular con precisión a partir de los primeros 300 nanómetros de indentación después del contacto. Aquí se muestra un fibroblasto que ha sido transfectado con mentón marcado con proteína fluorescente verde, un tipo de filamento intermedio. Cuanto más brillante es la imagen, más mentón hay en esa región.

Esto puede estar relacionado con la rigidez del citoesqueleto de la célula. Utilizando la técnica de mapeo de fuerza A FM presentada aquí, es posible mostrar un mapa de rigidez similar de un fiberblast con una resolución de 32 por 32 píxeles donde cada píxel representa 2,5 por 2,5 micras de área de superficie celular. Después de ver este video, tendrá una buena idea de cómo usar la microscopía de fuerza atómica para medir la elasticidad de las células de tejido vivo.