Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

El objetivo general del siguiente experimento consiste en medir el módulo elástico de células vivas utilizando un microscopio de fuerza atómica. Esto se logra primero realizando mediciones de espectroscopía de fuerza por FM en diversas ubicaciones sobre la célula. Como segundo paso, se analiza cada curva de fuerza-distancia para determinar el punto en el que la punta de FM entra inicialmente en contacto con la célula.

A continuación, comenzando en el punto de contacto, los primeros 200 a 300 nanómetros de datos de indentación se ajustan al modelo de Hertz. Con el fin de extraer el módulo elástico, los resultados generan un mapa 2D de la rigidez celular obtenido mediante el modo de mapeo de fuerza, en el que cada píxel representa una curva individual de fuerza-distancia. El procedimiento será demostrado por Guen Thomas, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para iniciar este procedimiento, limpie el porta-muestra del cantiléver con etanol al 70 % y deje que se seque.

A continuación, cargue un cantiléver bru DNP 10 en el MF A según las instrucciones del fabricante. Luego, calibre la sensibilidad del inverso del brazo óptico. Este parámetro describe la cantidad de respuesta del fotodiodo en voltios por nanómetro de deflexión del cantiléver.

Para lograr esto, primero cargue una placa de vidrio limpia sobre la platina de la muestra. Instale la cabeza de MF y ajuste el haz láser y la alineación según las instrucciones del fabricante. Una vez alineado, acople la punta de MF sobre la placa de vidrio con el P ocho O retirado.

Alinee nuevamente el espejo hasta obtener una lectura del fotodiodo de menos dos voltios. Luego, realice una medición de espectroscopía de fuerza con una respuesta máxima del fotodiodo o punto de activación de más dos voltios. Una vez completada la adquisición de datos, acerque la región de contacto firme de la curva de fuerza y realice un ajuste lineal a esta región.

Para hallar la pendiente en voltios por nanómetro, luego restablezca la alineación del espejo a una desviación libre de cero voltios. A continuación, calibre la constante del resorte del cantiléver utilizando el método de sintonización térmica descrito por Levy y Malam. Para comenzar, eleve el escáner lejos del platino de la muestra de modo que no haya interacciones entre la punta y la muestra.

Luego, capture los datos térmicos registrando la vibración térmica de la viga en voladizo. El software de MF-A analiza un espectro de potencia de dicha vibración térmica y lo representa en una ventana de datos. A continuación, realice un ajuste al segmento de datos centrado en la frecuencia más baja, también conocida como el pico de resonancia fundamental, para determinar la constante del resorte.

Para preparar el microscopio de fuerza atómica (FM) para las placas de cultivo, instale un accesorio calentador de placa sobre la platina del FM y ajuste la temperatura a 37 grados Celsius. Espere 20 minutos para que el sistema alcance un equilibrio térmico estable. Una vez precalentado, coloque un recipiente de cultivo sobre la platina del FM y fíjelo utilizando la abrazadera proporcionada con el calentador de placa; para mediciones de más de 30 minutos, se debe utilizar un medio independiente de dióxido de carbono en sustitución del medio de cultivo normal.

A continuación, aplique una pequeña gota de medio de cultivo a 37 grados Celsius sobre la punta del cantiléver de MF-A y baje la cabeza de MF-A hasta que la punta quede apenas sumergida en el líquido. Utilizando una cámara CCD con vista superior, realinee el haz de láser sobre el cantiléver. El alineamiento en el líquido será diferente al del aire debido al cambio en el índice de refracción del medio.

Una vez alineado, coloque la punta de AFM sobre un área libre de células del cultivo y realice la calibración de la sensibilidad inversa del palanca óptica en el entorno líquido. Para comenzar las mediciones de las propiedades mecánicas de las células, posicione la punta del cantiléver por encima de la región del ojo perla de una célula con la ayuda de un microscopio óptico. Los ajustes precisos de la posición del cantiléver se logran aplicando desplazamientos a los escáneres X e Y.

Luego cambie el microscopio de fuerza atómica al modo espectroscopia en cuatro puntos y establezca la velocidad de indentación en cinco micrómetros por segundo, lo cual es lo suficientemente baja como para evitar efectos hidrodinámicos. A continuación, fije el punto de activación de la deflexión en dos nano newtons. Con el fin de evitar dañar las células, ajuste este valor según la rigidez de la muestra.

Además, seleccione la opción de disparo relativo, que corregirá cualquier deriva en la señal de deflexión. Luego, establezca la distancia de fuerza en cinco micrómetros para asegurar que la punta se desprenda completamente de la célula entre las mediciones de fuerza. Recolecte tres curvas de fuerza en diferentes ubicaciones en la región del núcleo de al menos 30 células para cada condición.

Aunque es beneficioso obtener múltiples curvas en cada célula, para datos estadísticos confiables, tomar demasiadas puede provocar cambios en la rigidez celular debido al estrés causado por la sonda de microscopía de fuerza atómica (AFM). Caracterice además la distribución de las propiedades mecánicas a lo largo de una sola célula utilizando el modo de mapa de fuerza.

En el modo de mapa de fuerza, configure el tamaño de escaneo en 30 micrómetros, la resolución en 32 por 32, y los parámetros de indentación iguales a los seleccionados para las curvas de fuerza individuales. El MF A tomará entonces curvas de fuerza individuales en cada píxel de la región de la muestra y proporcionará un mapa de rigidez de toda la región. A continuación, analice las curvas de fuerza registradas utilizando MATLAB para calcular la rigidez celular.

Comience adoptando un algoritmo publicado inicialmente por Lynette Al, que calcula tanto un ajuste lineal como un ajuste de hertz a partir de cada punto utilizando matlab. Calcule el error RMS relativo de ambos ajustes y sume estos valores en cada punto. El punto que alcanza el error de ajuste total mínimo se selecciona como el punto inicial de contacto; localizar este punto es crucial para la medición precisa del módulo de young de las células.

A continuación, calcule la deformación de la muestra delta. Utilice las siguientes ecuaciones, en las que la deformación es igual a cero antes del contacto con la célula, donde Z es menor que Z cero, y es igual a la diferencia entre la deflexión del cantiléver D y la distancia total Z más allá del punto de contacto. Luego, calcule la fuerza de indentación F mediante las siguientes ecuaciones, en las que la fuerza es igual a cero antes del contacto con la célula, donde Z es menor que Z cero, y es igual a la constante del resorte K del cantiléver multiplicada por la deflexión del cantiléver más allá del punto de contacto.

Seguidamente, se aplica el ajuste de Elise al cuadrado a los datos de deformación de la muestra frente a la fuerza de indentación en la región posterior al contacto del modelo de Hertz, con el fin de extraer el módulo de Young de la célula según la forma de la punta utilizada que se muestra. A continuación se presentan curvas de fuerza representativas obtenidas de tres células de fibroblasto T3 cultivadas sobre tres superficies diferentes. Como puede observarse aquí, diferentes superficies pueden influir notablemente en la rigidez del citoesqueleto celular.

La deformación promedio de las células cultivadas sobre una superficie plástica dura se muestra en rojo. Las cultivadas sobre un gel de poli acrilamida rígido se muestran en púrpura, y las cultivadas sobre un gel de poli acrilamida elástico se muestran en azul. Tras identificar cuidadosamente los puntos de contacto en las curvas, se pueden mostrar con precisión las fuerzas de indentación como función de la deformación celular.

Además, su módulo de Young se puede calcular con precisión a partir de los primeros 300 nanómetros de indentación tras el contacto. Aquí se muestra un fibroblasto que ha sido transfectado con proteína verde fluorescente marcada con mentona, un tipo de filamento intermedio. Cuanto más brillante sea la imagen, mayor será la cantidad de mentona en esa región.

Esto puede estar relacionado con la rigidez del citoesqueleto celular. Mediante la técnica de mapeo de fuerza de microscopía de fuerza atómica (AFM) presentada aquí, es posible obtener un mapa de rigidez similar de un fibroblasto con una resolución de 32 por 32 píxeles, donde cada píxel representa 2,5 por 2,5 micrómetros de área superficial celular. Tras ver este video, se tendrá una buena idea de cómo utilizar la microscopía de fuerza atómica para medir la elasticidad de células de tejidos vivos.