Name: Agroinfiltration eficiente de las plantas para la expresión transitoria de alto nivel de proteínas recombinantes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprende la técnica de agroinfiltración para expresar proteínas recombinantes en plantas Nicotiana benthamiana mediante Agrobacterium tumefaciens. Este método permite obtener altos niveles de expresión proteica de forma rápida y escalable para aplicaciones farmacéuticas.

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Agradecemos a R. Sun y otros estudiantes de laboratorio de Chen por su contribución a la generación de plantar material. También agradecemos al Dr. D. Green por su apoyo a la investigación universitaria en la Facultad de Tecnología e Innovación (CTI). Esta investigación fue financiada en parte por subvenciones del NIH U01 AI075549 y 1R21AI101329 al P. Chen, y una donación de SSE de CTI, de la Universidad del Estado de Arizona a Q. Chen. K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado y J. Stahnke son estudiantes universitarios apoyados por la concesión SSE.

1. Crecimiento de las Plantas <ol><li> Lugar 60 pastillas de turba en una bandeja de propagación. Añadir 4 L de agua del grifo y dejar que la turba pellets de absorber el agua durante 2 horas. </li><li> Añadir 2 N. benthamiana semillas en cada una turba de pellets con una sembradora, cubrir la bandeja con una cúpula de plástico transparente, y les permiten germinar en un C Humedad ambiente 25 °, el 84% con un ciclo día / noche de 16/8 horas (Figura 1). </li><li> Retire el domo dos semanas después de la siembra, drenar el agua de la bandeja, y añadir 2 litros de fertilizante de Jack a una concentración de 1,48 g / L (Figura 1B). Continuar para cultivar plantas en un entorno C Humedad 25 °, el 50% con una hr día / noche ciclo de 16/8. Suministro 2 L de fertilizante de Jack cada 2 días a la bandeja. </li><li> En la semana 4, transferir las plantas con pellets de turba a una nueva bandeja que aloja seis plantas para proporcionar un espacio adecuado para un mayor crecimiento (Figura 1C) hasta que estén listos para ser infiltrado a las 6 semanas de edad (figura1D). </li></ol> 2. A. tumefaciens Cultura Preparación 2.1 Preparación para la infiltración Jeringa <ol><li> Racha A. tumefaciens GV3101 cepas que contienen los vectores geminiviral p19, pREP110, pBYGFP, y pBYDsRed en placas de agar LB que contenían kanamicina (100 mg / ml). Racha de una cepa por placa y crecer a 30 º C durante 48 horas. </li><li> Del mismo modo, la raya y GV3101 crecer las cepas que albergan los vectores magnICON de la 5 &#39;módulo (pICH15879), el 3&#39; del módulo que contiene el gen diana de GFP o DsRed (Pich-GFP o Pich-DsRed), y la integrasa (pCH14011) en agar LB placas que contenían carbenicilina (100 mg / ml). </li><li> A partir de una sola colonia en la placa de agar LB, inocular GV3101 las cepas que albergan vectores geminiviral en 3 ml de YENB los medios de comunicación (0,75% de extracto de levadura Bacto, 0,8% Nutrient Broth, ajustar el pH a 7,5 con NaOH) + kanamicina (100 mg / ml) en un tubo de cultivo ml de fondo redondo de 15, crece el cultivo líquido a 30 ° C enun agitador durante la noche con una tasa de rotación de 300 rpm. </li><li> Del mismo modo, inocular GV3101 y crecer las cepas que albergan vectores magnICON en YENB medios + carbenicilina (100 mg / ml) durante la noche en un agitador a 30 ° C. </li><li> Los valores de medida y registro de DO 600 para cada cultivo líquido con un espectrofotómetro y utilizar la siguiente fórmula para calcular el volumen necesario (V sub) se subcultivaron para una nueva cultura con una OD de partida 600 de 0.025 en 10 ml de medio YENB con los antibióticos apropiados . Sub V (ml) = (10 ml) x (0.025) / OD 600 </li><li> Transferencia sub V (ml) del cultivo de una noche a (10 - V sub) ml de los medios de comunicación YENB con los antibióticos apropiados para cada cepa. Crecer el nuevo cultivo durante la noche a 30 ° C en un agitador con una velocidad de rotación de 250 rpm hasta que el valor de la DO 600 está en el intervalo de 1,7-2,0. </li><li> Mida y registre OD 600 valores para cada cultivo líquido y utilizar la fórmula siguiente para calcular el volumen necesario (V inf) para ser diluido en 50 ml de tampón de infiltración para dar una DO600 final de 0,12 para cada cepa. Inf V (ml) = (50 ml) x (0,12) / OD 600 </li><li> Transferencia inf V (ml) de cada cultivo a un tubo de microcentrífuga y girar hacia abajo las células por centrifugación a 12.000 xg durante 2 min, a continuación, eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 10 ml de tampón de infiltración (MES 10 mM, pH 5,5; 10 mM MgSO 4) por agitación con vórtex brevemente. </li><li> Mezclar resuspendieron las células de pBYGFP pREP110 + + p19, girar las células hacia abajo a 12.000 xg durante 2 min, y volver a suspender en total de 50 ml de tampón de infiltración. Esta combinación es agrobacterias para la expresión de GFP geminiviral. </li><li> Del mismo modo, mezclar las siguientes combinaciones de células de Agrobacteria, girar hacia abajo y volver a suspender en 50 ml de tampón de infiltración. Estos incluyen (1) pBYDsRed + pREP110 + p19 para la expresión geminiviral de DsRed, (2) pBYGFP + + pBYDsRed pREP110+ P19 para geminiviral co-expresión de GFP y DsRed, (3) pREp110 + p19 como control negativo de la expresión geminiviral, (4) Pich-GFP + + pICH15879 pCH14011 magnICON para la expresión de GFP, (5) Pich-DsRed + + pICH15879 pCH14011 para la expresión magnICON de DsRed, y (6) pICH15879 + pCH14011 como control negativo para la expresión magnICON. </li></ol> 2.2 Preparación para la infiltración al vacío <ol><li> Inocular y la cultura cada cepa GV3101 que contiene vectores geminiviral o vectores magnICON en 15 ml de medio de YENB con los antibióticos apropiados en un matraz de 50 ml y esterilizado en autoclave crecer durante la noche como se describe para la infiltración por encima de jeringa. </li><li> Los valores de medida y registro de DO 600 para cada cultivo líquido con un espectrofotómetro y utilizar la siguiente fórmula para calcular el volumen necesario (V sub) se subcultivaron para una nueva cultura con una OD de partida 600 de 0.025 en 250 ml de medio YENB con los antibióticos apropiados . V sub </sub&gt; (Ml) = (250 ml) x (0.025) / OD 600 </li><li> Transferencia sub V (ml) del cultivo de una noche a (250 - V sub) ml de los medios de comunicación YENB en un matraz de 1 L autoclavado con los antibióticos apropiados para cada cepa y crecer el nuevo cultivo durante la noche como se describe para la infiltración por encima de jeringa. </li><li> Medir y registrar OD 600 valores para cada cultivo líquido y utilizar la fórmula siguiente para calcular el volumen necesario (V inf) para ser diluido en 3 L de tampón de infiltración para dar una DO600 final de 0,12 para cada cepa. Inf V (ml) = (3.000 ml) x (0.12) / OD 600 </li><li> Precipitado y se resuspende V inf (ml) de cada cultivo en tampón de infiltración como se describe para la infiltración jeringa y mezclar las culturas resuspendidas de acuerdo con las combinaciones descritas para la infiltración jeringa. Repellet las células Agrobacteria mixtos y resuspender en 3 L de tampón de infiltración. </li></ol> 3.1 Jeringa infiltración <ol><li> Elija cuatro de 6 semanas de edad N. benthamiana plantas con 5 hojas cada uno. Las tres primeras hojas, contando desde la parte superior de cada planta se infiltraron en su totalidad con una de las combinaciones de A. tumefaciens cepas en tampón de infiltración. La cuarta hoja será spot-infiltrada con todas las combinaciones de cuatro cepas de expresión geminiviral o las tres combinaciones de expresión magnICON. La última hoja de cada planta se infiltró con combinaciones de controles negativos. </li><li> Crear un pequeño corte con una aguja en la epidermis en el lado posterior de la hoja (Figura 2A). Atención: asegurarse de no rayar tan duro como para perforar la hoja a través de ambos lados, como las células de Agrobacteria en la mezcla de infiltración pasarán a través de la punción para el otro lado de la hoja. </li><li> Tome un firme control de la parte frontal de la hoja y mientras se aplica suavela presión en contra de la nick con el pulgar de una mano, se inyectan las mezclas de Agrobacterium en tampón de infiltración en el nick con una jeringa sin aguja (Figura 2B). Nota: Como la mezcla de Agrobacterium que entra en el espacio intercelular de la hoja, el área infiltrada se volverá verde visiblemente más oscuro (Figura 2C). </li><li> Continuar para inyectar las mezclas de Agrobacterium en el nick hasta que el círculo verde más oscuro deja de expandirse. Cree otro nick y repita los pasos 3.1.2-3.1.4 hasta que toda la hoja se infiltra y toda la hoja se vuelve verde más oscuro para las tres primeras hojas y la última hoja. </li><li> Para la cuarta hoja de cada planta, todas las combinaciones de cuatro (vector geminiviral) o tres (magnICON vector) se infiltraron en ella. Haga un nick para cada combinación de cepas de Agrobacterium, y se infiltran cada nick con una combinación. </li><li> Después de la infiltración, mover las plantas de nuevo a la sala de crecimiento y moniexpresión de la proteína mediador entre 2-15 días después de la infiltración (dpi). </li></ol> 3.2 Vacío infiltración <ol><li> Coloque una bañera en un desecador de vacío y la transferencia de 3 l de tampón de infiltración que contiene las cepas de Agrobacterium a la bañera. Conectar el desecador a una bomba de vacío de diafragma de Vacuubrand (Figura 3A). </li><li> Coloque una planta boca abajo sobre la placa de desecador (Figura 3B) y bajar la placa con la planta hasta que todo el sistema de la hoja y tallo se sumergen en la memoria intermedia de la infiltración con la placa que descansa encima de la bañera. Coloque la junta tórica desecador a lo largo del borde y poner la tapa desecador de la cámara (Figura 3C). </li><li> Encienda la bomba de vacío y empezar a cronometrar cuando el vacío llega a 100 mbar. Abrir lentamente la válvula de descarga en el desecador después de 1 min a 100 mbar para permitir la entrada de Agrobacteria en los espacios intersticiales del tejido de la planta sumergida. Repita este paso uno addititiempo onal para asegurar una buena infiltración. </li><li> Después de la infiltración, tomar la planta del desecador y se puso de nuevo a su posición vertical. Mueva las plantas de nuevo a la cámara de crecimiento y expresión de proteínas de monitoreo entre 2-15 dpi. </li></ol> 4. Detección de la proteína fluorescente y fotografía <ol><li> A partir de 2 dpi, las plantas se mueven en el cuarto oscuro y brillar la luz UV en el envés de las hojas infiltradas con una lámpara UV de mano. </li><li> Observar la fluorescencia verde de GFP o la fluorescencia roja DsRed. GFP emite una señal más fuerte con la luz ultravioleta de onda larga, mientras DsRed es más fuerte a la luz ultravioleta de onda corta. </li><li> Tome fotografías de hojas fluorescentes con una cámara digital normal sin flash. </li><li> Mueva las plantas de nuevo a la cámara de crecimiento después de la observación o la fotografía. </li></ol>

<ol><li>Chen, Q. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+Q+%22Transgenic+Horticultural+Crops%3A+Challenges+and+Opportunities+-+Essays+by+Experts%22">Transgenic Horticultural Crops: Challenges and Opportunities - Essays by Experts</a>. Mou, B., Scorza, R. , Taylor & Francis. 86-126 (2011).</li>
<li>Chen, Q., Lai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-derived+virus-like+particles+as+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Plant-derived virus-like particles as vaccines.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9, 26-49 (2013).</li>
<li>Landry, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+and+clinical+development+of+plant-made+virus-like+particle+vaccine+against+avian+H5N1+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preclinical and clinical development of plant-made virus-like particle vaccine against avian H5N1 influenza.</a> PLoS One. 5, e15559(2010).</li>
<li>Lai, H., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprocessing+of+plant-derived+virus-like+particles+of+Norwalk+virus+capsid+protein+under+current+Good+Manufacture+Practice+regulations%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Bioprocessing of plant-derived virus-like particles of Norwalk virus capsid protein under current Good Manufacture Practice regulations.</a> Plant Cell Reports. 31, 573-584 (2012).</li>
<li>Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+Pharmaceutical+Proteins+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of Pharmaceutical Proteins in Plants.</a> Biological Engineering. 1, 291-321 (2008).</li>
<li>Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+a+new+leaf%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biopharm.+Rev%22%5BJournal%5D)">Turning a new leaf.</a> European Biopharm. Rev. 2, 64-68 (2011).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+Q+%22New+Generation+Vaccines%22">New Generation Vaccines</a>. Levine, M. M. , Informa Healthcare USA, Inc. 306-315 (2009).</li>
<li>Lai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+produced+in+plants+efficiently+treats+West+Nile+virus+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody produced in plants efficiently treats West Nile virus infection in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2419-2424 (2010).</li>
<li>Buswell, S., Medina-Bolivar, F., Chen, Q., Van Cott, K., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+porcine+prorelaxin+in+transgenic+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Expression of porcine prorelaxin in transgenic tobacco.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1041, 77-81 (2005).</li>
<li>Lico, C., Chen, Q., Santi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+production+of+recombinant+proteins+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for production of recombinant proteins in plants.</a> J. Cell. Physiol. 216, 366-377 (2008).</li>
<li>Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geminiviral+vectors+based+on+bean+yellow+dwarf+virus+for+production+of+vaccine+antigens+and+monoclonal+antibodies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Vaccin%22%5BJournal%5D)">Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants.</a> Hum. Vaccin. 7, 331-338 (2011).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Green+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Green Fluorescent Protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%2C+mutagenesis%2C+and+oligomerization+of+DsRed%2C+a+red+fluorescent+protein+from+coral%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biochemistry, mutagenesis, and oligomerization of DsRed, a red fluorescent protein from coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97, 11984-11989 (2000).</li>
<li>Lai, H., He, J., Engle, M., Diamond, M. S., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+production+of+virus-like+particles+and+monoclonal+antibodies+with+geminiviral+replicon+vectors+in+lettuce%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Robust production of virus-like particles and monoclonal antibodies with geminiviral replicon vectors in lettuce.</a> Plant Biotechnology Journal. 10, 95-104 (2012).</li>
<li>Giritch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+high-yield+expression+of+full-size+IgG+antibodies+in+plants+coinfected+with+noncompeting+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting viral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14701-14706 (2006).</li>
<li>Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+replicon+system+for+rapid+high-level+production+of+virus-like+particles+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants.</a> Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714 (2009).</li>
<li>Santi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+plant+viral+expression+system+generating+orally+immunogenic+Norwalk+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">An efficient plant viral expression system generating orally immunogenic Norwalk virus-like particles.</a> Vaccine. 26, 1846-1854 (2008).</li>
<li>He, J., Lai, H., Brock, C., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+System+for+Rapid+and+Cost-Effective+Production+of+Detection+and+Diagnostic+Reagents+of+West+Nile+Virus+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A Novel System for Rapid and Cost-Effective Production of Detection and Diagnostic Reagents of West Nile Virus in Plants.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-10 (2012).</li>
<li>Huang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+rapid+production+of+full-size+monoclonal+antibodies+in+plants+by+a+single-vector+DNA+replicon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system.</a> Biotechnol. Bioeng. 106, 9-17 (2010).</li>
<li>Kuta, D., Tripathi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-induced+hypersensitive+necrotic+reaction+in+plant+cells%3A+a+resistance+response+against+Agrobacterium-mediated+DNA+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer.</a> African Journal of Biotechnology. 4, 752-757 (2005).</li>
<li>Phoolcharoen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+an+immunogenic+Ebola+immune+complex+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Expression of an immunogenic Ebola immune complex in Nicotiana benthamiana.</a> Plant Biotechnology Journal. 9, 807-816 (2011).</li>
<li>Phoolcharoen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nonreplicating+subunit+vaccine+protects+mice+against+lethal+Ebola+virus+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A nonreplicating subunit vaccine protects mice against lethal Ebola virus challenge.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 20695-20700 (2011).</li>
<li>Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norwalk+virus-like+particles+as+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Norwalk virus-like particles as vaccines.</a> Expert Rev. Vaccines. 9, 299-307 (2010).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agroinfiltration+as+an+effective+and+scalable+strategy+of+gene+delivery+for+production+of+pharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Tech.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins.</a> Adv. Tech. Biol. Med. 1, 103(2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

La creciente demanda de productos farmacéuticos basados ​​en proteínas en todo el mundo requieren de nuevas plataformas de producción que son robustas, escalables y de bajo costo y seguro. Las plantas han demostrado ser uno de los sistemas de producción alternativas más prometedoras para la producción de la proteína farmacéutica. En los últimos años, el desarrollo de vectores basados ​​en virus deconstruido ha permitido la expresión transitoria de proteínas en plantas, lo que mejora en gran medida la velocidad y el rend...

Desde la década de 1970, las plantas han sido explorados como alternativas a los cultivos de células de mamíferos, insectos, y bacteriana para la producción comercial de proteínas recombinantes y proteínas terapéuticas 1. Sistemas a base de plantas para la expresión de los productos biofarmacéuticos han demostrado ser prometedores en los últimos años varios nuevos tratamientos para enfermedades, como la enfermedad de Gaucher 2, y la gripe aviar H5N1 3, han demostrado tener éxito en los ensayos clínicos. El desarrollo de mecanismos competentes para la expresión de proteínas recombinantes en plantas en las décadas desde los primeros experimentos se ha creado el potencial para los sistemas basados ​​en plantas para alterar el paradigma actual de la producción de proteínas por tres razones principales. En primer lugar, hay una disminución notable en coste como biorreactores de mamíferos, insectos, y bacteriana requieren considerables costos de inicio, medios de cultivo costosos, complicados y procesos para la purificación aguas abajo 4. La creación de plantas transgénicas estableslíneas también les permite superan la escalabilidad de otros sistemas de expresión como las plantas que expresan proteínas podrían ser cultivados y cosechados a escala agrícola 5. En segundo lugar, los sistemas de expresión basados ​​en plantas reducen significativamente el riesgo de transmitir un patógeno humano o animal desde el host expresan la proteína a los seres humanos, lo que demuestra la superioridad en la seguridad pública 6. Por último, las plantas utilizan un sistema de endomembranas eucariota que es similar a las células de mamíferos, lo que permite apropiada modificación post-traduccional de proteínas, incluyendo glicosilación y el ensamblaje de las proteínas de la subunidad múltiple 7. Esta capacidad pone los sistemas a base de plantas por delante de los basados ​​en sistemas procariotas, tales como bacterias, ya que un número más amplio de proteínas farmacéuticas recombinantes, incluyendo anticuerpos monoclonales (mAb), tienen una estructura más complicada y requerir extensas modificaciones posteriores a la traducción o de montaje 8. Hay dos grandes aprodolores de la expresión de proteínas recombinantes en plantas. El primero es el desarrollo de una línea transgénica de manera estable, donde el ADN que codifica para la proteína diana se clona en un casete de expresión y se introduce a cualquiera de los genomas nucleares o de cloroplastos. De este modo, el ADN extraño se convierte en heredables a través de las generaciones sucesivas y permite enormemente mejorado escalabilidad, mucho más allá de la de otros sistemas de expresión 1. La introducción de ADN exógeno al genoma nuclear se logra por lo general por la infección de Agrobacterium tumefaciens del tejido de la planta o, con menos frecuencia, por bombardeo con microproyectiles de los tejidos 9. Las hormonas vegetales se utilizan entonces para inducir la diferenciación y el crecimiento de tejido de la planta transgénica, tales como raíces y hojas. La transformación del genoma del cloroplasto no se puede lograr con A. tumefaciens, pero depende enteramente de oro o tungsteno recubiertas con ADN dispararon balísticamente en las células vegetales. El segundo método de expresión de recombinaciónproteína nt de plantas es a través de la expresión transitoria 10. En este escenario, los vectores derivados de virus que albergan el gen de interés se entregan a través de A. tumefaciens a plantas completamente desarrolladas a través de un proceso llamado agroinfiltration. En lugar de integrarse en el genoma de la planta, la construcción del gen entregado entonces comenzará a dirigir la producción transitoria de la proteína deseada, que se puede recoger y aislado después de un corto período de incubación. Expresión transitoria de genes ofrece la ventaja de una mayor acumulación de proteínas en general, así como una mejora del tiempo de producción de proteínas, como las plantas estarán listas para la cosecha de aproximadamente 1-2 semanas después de la agroinfiltración 11. Esto es significativamente más rápido que los procesos de generación, selección, y la confirmación de líneas estables de plantas transgénicas, que pueden tardar varios meses a un año. Sin embargo, esta es también la limitación del sistema de expresión transitoria, ya que no dará lugar a la planta genéticamente estable lines que se pueden utilizar para generar un banco de semillas para la producción comercial a gran escala. A pesar de esto, se han desarrollado enfoques para mejorar la expresión transitoria a gran escala. Aquí se demuestra un método de generación de proteínas que expresan plantas de Nicotiana benthamiana transitorios usando vectores virales deconstruidos entregados por A. tumefaciens. Dos métodos principales se están desarrollando para la entrega de A. tumefaciens en el tejido vegetal: Banco infiltración escala mediante una jeringa y la infiltración a gran escala a través de la cámara de vacío. Ambos protocolos se describen aquí usando N. benthamiana, que está estrechamente relacionado con la planta de tabaco común, ya que la planta huésped para la expresión transitoria de dos proteínas fluorescentes: la proteína fluorescente verde (GFP) de la medusa Aequorea victoria y la proteína fluorescente roja de Discosoma de coral (DsRed) 12,13. N. benthamiana es la planta huésped más común paraproteína recombinante, ya que es susceptible de transformación genética, puede producir grandes cantidades de biomasa con rapidez, y es un prolífico productor de semillas para la producción de ampliación 14. Otra ventaja de la utilización de N. benthamiana como huéspedes para la expresión de la proteína es la disponibilidad de una variedad de vectores de expresión de 2,5. En este estudio, dos vectores virales deconstruido, uno basado en un virus del mosaico del tabaco (TMV) ARN replicón sistema (vectores magnICON) y la otra derivada del virus del enanismo amarillo del frijol (BeYDV) sistema de replicón de ADN (vectores geminiviral) 4,11, 15-18, se utilizan para llevar el gen GFP y DsRed y entregarlos en N. células benthamiana mediante A. tumefaciens. Tres construcciones de ADN serán utilizados para GFP o expresión DsRed con vectores magnICON. Ellos incluyen &#39;módulo (pICH15879) que contiene el promotor y otros elementos genéticos para la conducción de la expresión del gen diana, el 3&#39; del módulo 5 que contiene el gen de interés (PICH-GFP o Pich-DsRed), y el módulo de la integrasa (pICH14011) que codifica para una enzima que integra el 5 &#39;y 3&#39; módulos juntos tras la expresión 8,15. También se necesitan tres construcciones de ADN para la expresión con vectores geminiviral. Además de los vectores que contienen el replicón del gen diana (pBYGFP o pBYDsRed), se requiere un vector que codifica para la proteína de replicación (pREP110) para la amplificación de la diana replicón 11,14,16. Por otra parte, se desea la inclusión de un vector que codifica la p19 supresor de silenciamiento del virus del enanismo ramificado del tomate para la expresión del gen diana de alto nivel de 11,16. En general, existen tres pasos principales para la introducción de genes de proteínas recombinantes en células de plantas por agroinfiltration incluyendo el crecimiento de la planta, A. preparación de cultivo tumefaciens, y la infiltración. Se ofrece como cada paso es fundamental para el éxito final de este procedimiento, por lo tanto, una descripción detallada de cadatanto para la infiltración de jeringa y la infiltración al vacío a continuación.

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>Reagents</td></tr><tr><td>GFP </td><td>Invitrogen</td><td>V353-20</td><td><a href="http://www.invitrogen.com/" target="_blank">www.invitrogen.com</a> Ver referencia: Lico y Chen, et al 2008</td></tr><tr><td>DsRed</td><td>Clontech</td><td>632152</td><td><a href="http://www.clontech.com/" target="_blank">www.clontech.com</a> Ver referencia: Baird y Zacharias, et al 2000</td></tr><tr><td>MagnICON Vector</td><td>Icon Genetics</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.icongenetics.com/" target="_blank">www.icongenetics.com</a> Ver referencia: giritch y Marillonnet, et al 2006</td></tr><tr><td>Geminiviral</td><td>Vector Author' s Lab</td><td>n/a</td><td>Ver referencia: Chen y He, et al 2011</td></tr><tr><td>N. benthamiana</td><td>Autor' s Lab</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.herbalistics.com.au" target="_blank">herbalistics.com.au</a></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens cepa gv3101</td><td>Autor' s Lab</td><td>n/a</td><td>Ver referencia: Lai y Chen 2012</td></tr><tr><td>LB Agar Carbenicillin-100, placas</td><td>Sigma</td><td>L0418</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>LB Agar Kanamycin-50, placas</td><td>Sigma</td><td>L0543</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio hidrato de hepa</td><td>Sigma</td><td>M2773-500 g</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Bacto-Triptona</td><td>Fisher</td><td>73049-73-7</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Bacto Extracto de Levadura</td><td>Becton, Dickinson CO.</td><td>REF 212750</td><td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td></tr><tr><td>Difco Caldo de nutrientes</td><td>Becton, Dickinson CO.</td><td>REF 234000</td><td><a href="http://www.bd.com/" target="_blank">www.bd.com</a></td></tr><tr><td>MES hydrate Buffer</td><td>Sigma</td><td>M8250-1kg</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>Sigma</td><td>C1613-1ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank"> www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td>70560-51-9</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sodio</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Jack' s Fertilizante</td><td>Hummert International</td><td>Jul-25</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Vacuubrand MD4 Bomba de vacío</td><td>Fisher</td><td>13-878-113</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Aire de vacío Válvula reguladora</td><td>Fisher</td><td>NC9386590</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Desecador 12 1/8" con junta tórica</td><td>Fisher</td><td>08-594-15C</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>3 L Tub</td><td>Rubber-Maid</td><td>n/a</td><td>Rubbermaid Servn' Tazón Ahorrador, 10 tazas funcionará</td></tr><tr><td>plato/estante 230ML</td><td>Fisher</td><td>NC9489269</td><td><a href="http://www.fishersci.com/" target="_blank">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Peat Pellet</td><td>Hummert International</td><td>14-2370-1</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a</td></tr><tr><td>>Bandeja de propagación Hidrogranja</td><td></td> <td>de cúpula132052</td><td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td></tr><tr><td>Propagaiton Tray</td><td>hydrofarm</td><td>138758</td><td><a href="http://www.hydroponics.net/" target="_blank">www.hydroponics.net</a></td></tr><tr><td>Virbo Hand Seeder</td><td>Gro-Mor INC</td><td>n/a</td><td><a href="http://www.gro-morent.com/" target="_blank" >www.gro-morent.com</a></td></tr><tr><td>Flora Carro 4 estantes</td><td>Hummert International</td><td>65-6924-1</td><td><a href="http://www.hummert.com/" target="_blank">www.hummert.com</a></td></tr><tr><td>15 ml Tubos de cultivo de fondo redondo</td><td>Sigma</td><td>CLS430172-500EA</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/" target="_blank">http://www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro Cubetas</td><td>Bio-Rad</td><td>223-9950</td><td><a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td><a href="http://www.usascientific.com/" target="_blank">www.usascientific.com</a></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa</td><td>Bio-Rad</td><td>166-0602EDU</td><<td>a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">www.bio-rad.com</a></td></tr><tr><td>Incubadora/Agitadora</td><td>Eppendorf</td><td>Excella E25</td><td><a href="http://www.eppendorf.com/" target="_blank"> www.eppendorf.com</a></td></tr><tr><td>Modelo de luz ultravioleta#: UVGL-25</td><td>UVP</td><td>95-0021-12</td><td><a href="http://www.uvp.com/" target="_blank">www.uvp.com</a></td></tr></tbody></table>

agroinfiltration eficiente de las plantas para la expresión transitoria de alto nivel de proteínas recombinantes

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Cultivo de células de mamíferos es la plataforma importante para la producción comercial de vacunas humanas y proteínas terapéuticas. Sin embargo, no puede satisfacer la creciente demanda mundial de productos farmacéuticos, debido a su limitada capacidad de ampliación y alto costo. Las plantas han demostrado ser una de las plataformas de producción farmacéuticas alternativas más prometedoras que son robustas, escalable, de bajo coste y seguro. El reciente desarrollo de vectores basados ​​en virus ha permitido la expresión transitoria rápida y de alto nivel de proteínas recombinantes en plantas. Para optimizar aún más la utilidad del sistema de expresión transitoria, se demuestra una metodología simple, eficiente y escalable para introducir objetivo-gen que contiene Agrobacterium en tejido de la planta en este estudio. Nuestros resultados indican que tanto agroinfiltración con jeringa de vacío y métodos han dado lugar a la introducción eficiente de Agrobacterium en las hojas y de producción robusta de dos proteínas fluorescentes, GFP y DsRed. Por otra parte,demostramos las ventajas únicas que ofrece por ambos métodos. Infiltración de jeringa es simple y no necesita un equipo costoso. También permite la flexibilidad para infiltrarse ya sea toda la licencia con un solo gen diana, o para introducir genes de múltiples objetivos en una hoja. Por lo tanto, se puede utilizar para la expresión a escala de laboratorio de proteínas recombinantes, así como para la comparación de diferentes proteínas o vectores de rendimiento o expresión cinética. La simplicidad de la infiltración de la jeringa también sugiere su utilidad en la escuela secundaria y la educación universitaria para el tema de la biotecnología. Por el contrario, la infiltración de vacío es más robusto y puede ser mayor escala para la fabricación comercial de proteínas farmacéuticas. También ofrece la ventaja de ser capaz de agroinfiltrate especies de plantas que no son susceptibles para la infiltración jeringa como la lechuga y Arabidopsis. En general, la combinación de jeringa y agroinfiltración de vacío proporciona a los investigadores y educadores un simple, eficiente y robustometodología para la expresión de proteína transitoria. Además, facilitará en gran medida el desarrollo de proteínas farmacéuticas y promover la educación científica.

1. Expresión de proteínas fluorescentes por infiltración Jeringa Para demostrar la eficacia de la jeringa de la infiltración de Agrobacterium en el tejido de la planta, se probó la expresión de dos proteínas fluorescentes - GFP y DsRed - por dos vectores diferentes deconstruido de plantas virales - geminiviral y magnICON - en N. benthamiana. Por N. benthamiana hojas que fueron totalmente infiltrados con vectores que contienen geminiviral Agrobacteria, se obse...

Las plantas ofrecen un sistema novedoso para la producción de proteínas farmacéuticas a escala comercial que es más escalable, rentable y seguro de expresión paradigmas actuales. En este estudio, se presenta un enfoque simple y conveniente, y escalable para introducir meta-gen que contiene<em&gt; Agrobacterium tumefaciens</em&gt; En plantas para la expresión transitoria de proteínas.

Agroinfiltration eficiente de las plantas para la expresión transitoria de alto nivel de proteínas recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Este sistema experimental utiliza la agroinfiltración para entregar eficazmente constructos génicos a las hojas con la finalidad de producir altos niveles de proteína recombinante. Primero, cultive plantas de end hamana en un ambiente controlado durante seis semanas, tres días antes de la infiltración. Prepare los cultivos de agrobacterium que contienen el gen diana que se expresará en las plantas el día de la infiltración.Introduzca las culturas de agrobacterium en el tejido vegetal mediante infiltración con jeringa o por vacío. Resultados como la intensidad de la fluorescencia verde de la GFP en hojas de tabaco bajo luz ultravioleta demuestran una expresión robusta de proteínas recombinantes en plantas que compite con la de los actuales sistemas de expresión basados en bacterias mamíferas e insectos. La infiltración agro es una forma eficaz de introducir transgenes en las células vegetales, lo que conduce a una expresión elevada de proteínas recombinantes.Se puede utilizar para una amplia gama de especies vegetales. Lo más importante es que puede ampliarse para la producción comercial de proteínas farmacéuticas. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la cinética y la expresión de la GFP y puede aplicarse a otras proteínas como vacunas de subunidades, anticuerpos monoclonales recombinantes, y puede utilizarse en tratamientos contra el cáncer y enfermedades infecciosas.Un experimento exitoso requiere condiciones óptimas tanto para el cultivo bacteriano como para el material vegetal. Este proceso de infiltración es más fácil de replicar tras una demostración visual. Comience colocando hasta 60 terrones de turba en una bandeja de propagación.Agregue cuatro litros de agua del grifo y deje que los comprimidos de guisantes absorban el agua durante dos horas. Ahora, agregue dos semillas hamana en cada comprimido de turba y cubra la bandeja con una cúpula de plástico transparente para la germinación. Coloque las semillas en un ambiente de 25 grados Celsius y 84 % de humedad.Dos semanas después de la siembra, retire la cúpula y transfiera las plantas a una bandeja nueva. Luego agregue dos litros de fertilizante Jack's a 1,48 gramos por litro. Continúe el crecimiento de las plantas a 25 grados Celsius.Medio con 50 % de humedad cada dos días. Aportar dos litros de fertilizante jack's por bandeja. En la semana cuatro, transferir las plantas con gránulos de turba a una nueva bandeja que aloje seis plantas para continuar el crecimiento hasta las seis semanas de edad.Seleccione cuatro plantas de Hamama de seis semanas de edad, cada una con cinco a seis hojas: tres hojas para la infiltración completa con cepas bacterianas agroinfectantes que portan los genes de interés, una hoja para el control negativo y una hoja para la infiltración por puntos. Haga una pequeña incisión con una aguja en la epidermis del envés de la hoja, asegurándose de no atravesar la hoja por ambos lados.Sujete firmemente el lado frontal del primer folíolo mientras aplica una presión contraria suave sobre el cuello. Con el pulgar de una mano, inyecte las mezclas de agrobacterium en tampón de infiltración dentro del cuello mediante una jeringa y una aguja.Continúe inyectando las mezclas de agrobacterias en la incisión hasta que el círculo de color verde oscuro deje de expandirse. A continuación, cree otra incisión y repita las inyecciones hasta que toda la hoja esté infiltrada y la hoja completa adquiera un tono verde más oscuro. Infiltra completamente las primeras tres hojas y la última hoja, correspondiente a la cuarta hoja de cada planta, utilizando combinaciones de vectores que incluyan ya sea los cuatro vectores virales Gemini o tres vectores magcon.Además, realice una incisión para cada combinación de cepas de agrobacterium e infiltre cada incisión con una combinación. Después de la infiltración, devuelva las plantas a la sala de crecimiento y supervise la expresión proteica entre dos y quince días. Tras la infiltración, coloque un recipiente en un desecador al vacío y transfiera tres litros de tampón de infiltración que contenga las cepas de agrobacterium.Luego, conecte el desecador a una bomba de vacío de diafragma de marca Vacuum. Ahora coloque una planta boca abajo sobre la placa del desecador y baje la placa con la planta hasta que todo el sistema de hojas y tallos quede sumergido en el tampón de infiltración, con la placa apoyada encima del recipiente. A continuación, coloque la junta tórica del desecador a lo largo del borde.Después de colocar la tapa del desecador sobre la cámara, encienda la bomba de vacío y comience a contar el tiempo cuando el vacío alcance 100 milibares. Después de apagar la bomba de vacío, abra lentamente la válvula de liberación del desecador tras un minuto a 100 milibares para permitir la entrada de bacterias agrobacterianas en los espacios intersticiales del tejido vegetal sumergido. Repita esta infiltración.Paso uno para garantizar una buena infiltración. Luego, retire la planta del desecador y colóquela nuevamente en posición vertical. Devuelva las plantas a la sala de crecimiento y supervise la expresión proteica entre dos y 15 días posteriores a la infiltración.Para demostrar la eficacia de la infiltración por jeringa de *Agrobacterium* en tejido vegetal, evaluamos la expresión de dos proteínas fluorescentes, GFP y DsRed, mediante dos vectores virales vegetales desmontados diferentes: Gemini viral y magcon para end. Hojas de Hamana que fueron completamente infiltradas con agrobacterias que contienen vectores virales Gemini. La expresión de GFP se observó en toda el área de la hoja bajo luz ultravioleta, a partir de tan pronto como 2 DPI y alcanzó la acumulación máxima a los cuatro DPI.En contraste, las hojas infiltradas con el vector magcon que contenía combinaciones de agrobacterium mostraron fluorescencia GFP solo después de cinco DPI y alcanzaron su acumulación máxima a los siete DPI. No se observó fluorescencia verde en las hojas infiltradas con mezclas de agrobacterias de control negativo EP uno 10 más P 19, lo que indica que la fluorescencia era específica del gen GFP y no era resultado de fluorescencia de fondo de las hojas. En su punto máximo de acumulación, la fluorescencia del vector magcon expresado hacia GFP es más intensa que la del vector viral Gemini.No se observó necrosis importante en las hojas infiltradas con construccos GFP cuando ambas proteínas fluorescentes se expresaron en la misma hoja mediante vectores virales Gemini mediante infiltración localizada con jeringa; se detectaron con su color fluorescente esperado en el lugar donde fueron infiltradas. Curiosamente, la coinfiltración de GFP y DS RED produjo una fluorescencia amarillenta. También se examinó la infiltración al vacío para desarrollar un método de agroinfiltración escalable que pueda utilizarse para la producción a gran escala de proteínas recombinantes mediante sistemas de expresión transitoria en plantas.Como era de esperar, se observó fluorescencia GFP en todas las hojas de la planta infiltrada en comparación con la infiltración mediante jeringa. Este método es más robusto y puede lograr la infiltración de cada planta en un período de tiempo mucho más corto. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 48 horas.La mayor parte del tiempo se utiliza para cultivo agrobacteriano, ya que el tiempo real de infiltración dura solo unos pocos minutos. Para lograr una eficiencia óptima de la infiltración agrobacteriana y una expresión proteica dirigida, siga el protocolo. Recuerde controlar los parámetros críticos, incluyendo las condiciones de crecimiento de la planta, la concentración de Agrobacterium, la presión de vacío y la duración. En el campo de la biotecnología vegetal.Este enfoque experimental puede utilizarse para explorar el desarrollo y la bioproducción de proteínas farmacéuticas novedosas en una amplia gama de especies vegetales. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo usar la agroinfiltración para entregar construcciones génicas diana a la planta y permitir que los sistemas de expresión transitoria vegetal produzcan proteínas recombinantes, compitiendo con los cultivos celulares de bacterias, insectos y mamíferos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La agroinfiltración y la agroinfección por PVX son ensayos funcionales de rutina para la expresión ectópica transitoria de genes en plantas. Estos métodos son ensayos eficientes en estrategias efectoómicas (resistencia rápida y descubrimiento de genes de avirulencia) y cruciales para la investigación moderna en fitopatología molecular. Satisfacen la demanda de análisis funcionales robustos de alto rendimiento en las plantas.

Agroinfiltración y PVX Agroinfección en Papa y Nicotiana benthamiana

La producción de proteína transitoria en plantas de Nicotiana sobre la base de infiltración al vacío con agrobacterias llevando vectores de lanzamiento (virus del mosaico del tabaco a base) es un enfoque rápido y económico para producir antígenos de vacunas y proteínas terapéuticas. Hemos simplificado el procedimiento mejorado y la acumulación de destino mediante la optimización de las condiciones de cultivo de bacterias, la selección de especies huéspedes, y co-introducción de supresores de...

La optimización y utilización de<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Mediada por la producción de proteína transitoria en<em&gt; Nicotiana</em

Las plantas de tabaco se usaron para producir una celulasa fúngica, TrCel5A, a través de un sistema de expresión transitorio. La expresión podría ser monitoreado usando una proteína de fusión fluorescente, y la actividad de la proteína se caracterizó después de la expresión.

Expresión recombinante de celulasa de Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; En plantas de tabaco

En este estudio se comparó la expresión de una proteína recombinante humana diana en diferentes plataformas de producción. Nos centramos en los cultivos tradicionales basados en fermentadores y en las plantas, describiendo la configuración de cada sistema y destacando, sobre la base de los resultados informados, los límites y ventajas inherentes a cada plataforma.

Un Análisis Comparativo de Expresión recombinante de proteínas en diferentes Biofactorías: Las bacterias, células de insecto y Plant Systems

Planta las conexiones intercelulares, los plasmodesmos (Pd), juegan un papel central en la planta las interacciones planta-virus y fisiología. Crítica para el transporte de Pd son clasificación señales que dirigen las proteínas a Pd. Sin embargo, nuestro conocimiento acerca de estas secuencias es todavía en su infancia. Se describe una estrategia para identificar señales de localización de Pd en proteínas orientada a Pd.

Identificación de secuencias de localización Plasmodesmal en proteínas en Planta

Nonlytic sistemas de expresión de células de insectos están infrautilizados para la producción, celular tráfico / localización, y el análisis funcional de proteínas recombinantes. A continuación, describimos métodos para generar vectores de expresión y la expresión de proteína transitoria posterior en líneas celulares de lepidópteros disponibles comercialmente. También se presenta la co-localización de las acuaporinas de Bemisia tabaci con proteínas marcadoras fluorescentes subcelulares.

Expresión transitoria y localización celular de proteínas recombinantes en células cultivadas de insectos

Transitoria expresión heteróloga de enzimas biosintéticas en las hojas de Nicotiana benthamiana puede desviar fuentes endógenas de 2,3-oxidosqualene hacia la producción de nuevos productos de alto valor triterpeno. Es en este documento se describe un protocolo detallado para rápido (5 días) escala de preparativo de triterpenos y análogos utilizando esta potente plataforma basada en plantas.

Expresión transitoria en Nicotiana Benthamiana las hojas para la producción de triterpeno a escala preparativa

Aquí se describe un método de etiquetado de proximidad para la identificación de socios de interacción del dominio TIR del receptor inmune NLR en el tejido de hoja de Nicotiana benthamiana. También se proporciona un protocolo detallado para la identificación de interacciones entre otras proteínas de interés utilizando esta técnica en Nicotiana y otras especies vegetales.

Etiquetado de proximidad basado en TurboID para la identificación en planta de redes de interacción proteína-proteína

Aquí describimos un método simple para la expresión, extracción y purificación de IgG humano recombinante fusionado con GFP en Nicotiana benthamiana. Este protocolo se puede extender a la purificación y visualización de numerosas proteínas que utilizan cromatografía de columna. Además, el protocolo es adaptable al laboratorio de enseñanza en persona y en la universidad virtual, proporcionando una exploración basada en proyectos.

Producción de proteínas de fusión IgG expresada transitoriamente en Nicotiana benthamiana

Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para realizar el experimento de marcaje de proximidad (PL) en pepino (Cucumis sativus L.) utilizando la proteína AT4G18020 (APRR2)-AirID como modelo. El método describe la construcción de un vector, la transformación de un constructo a través de la agroinfiltración, la infiltración de biotina, la extracción de proteínas y la purificación de proteínas marcadas con biotina a través de la técnica de purificación por afinidad.

Etiquetado de proximidad basado en AirID para la interacción proteína-proteína en plantas

En este trabajo presentamos el primer protocolo de infiltración localizada al vacío para estudios in vivo de la transformación genética de plantas de gran tamaño. Utilizando esta metodología, logramos por primera vez la transformación transitoria del cacao mediada por Agrobacterium in planta .

Agroinfiltración forzada al vacío para la transformación in planta de plantas recalcitrantes: el cacao como caso de estudio

Aprende la técnica de agroinfiltración para expresar proteínas recombinantes en plantas Nicotiana benthamiana mediante Agrobacterium tumefaciens. Este método permite obtener altos niveles de expresión proteica de forma rápida y escalable para aplicaciones farmacéuticas.

Agroinfiltration eficiente de las plantas para la expresión transitoria de alto nivel de proteínas recombinantes

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