Agroinfiltration eficiente de las plantas para la expresión transitoria de alto nivel de proteínas recombinantes

Este sistema experimental utiliza la agroinfiltración para entregar eficazmente constructos génicos a las hojas con la finalidad de producir altos niveles de proteína recombinante. Primero, cultive plantas de end hamana en un ambiente controlado durante seis semanas, tres días antes de la infiltración. Prepare los cultivos de agrobacterium que contienen el gen diana que se expresará en las plantas el día de la infiltración.

Introduzca las culturas de agrobacterium en el tejido vegetal mediante infiltración con jeringa o por vacío. Resultados como la intensidad de la fluorescencia verde de la GFP en hojas de tabaco bajo luz ultravioleta demuestran una expresión robusta de proteínas recombinantes en plantas que compite con la de los actuales sistemas de expresión basados en bacterias mamíferas e insectos. La infiltración agro es una forma eficaz de introducir transgenes en las células vegetales, lo que conduce a una expresión elevada de proteínas recombinantes.

Se puede utilizar para una amplia gama de especies vegetales. Lo más importante es que puede ampliarse para la producción comercial de proteínas farmacéuticas. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre la cinética y la expresión de la GFP y puede aplicarse a otras proteínas como vacunas de subunidades, anticuerpos monoclonales recombinantes, y puede utilizarse en tratamientos contra el cáncer y enfermedades infecciosas.

Un experimento exitoso requiere condiciones óptimas tanto para el cultivo bacteriano como para el material vegetal. Este proceso de infiltración es más fácil de replicar tras una demostración visual. Comience colocando hasta 60 terrones de turba en una bandeja de propagación.

Agregue cuatro litros de agua del grifo y deje que los comprimidos de guisantes absorban el agua durante dos horas. Ahora, agregue dos semillas hamana en cada comprimido de turba y cubra la bandeja con una cúpula de plástico transparente para la germinación. Coloque las semillas en un ambiente de 25 grados Celsius y 84 % de humedad.

Dos semanas después de la siembra, retire la cúpula y transfiera las plantas a una bandeja nueva. Luego agregue dos litros de fertilizante Jack's a 1,48 gramos por litro. Continúe el crecimiento de las plantas a 25 grados Celsius.

Medio con 50 % de humedad cada dos días. Aportar dos litros de fertilizante jack's por bandeja. En la semana cuatro, transferir las plantas con gránulos de turba a una nueva bandeja que aloje seis plantas para continuar el crecimiento hasta las seis semanas de edad.

Seleccione cuatro plantas de Hamama de seis semanas de edad, cada una con cinco a seis hojas: tres hojas para la infiltración completa con cepas bacterianas agroinfectantes que portan los genes de interés, una hoja para el control negativo y una hoja para la infiltración por puntos. Haga una pequeña incisión con una aguja en la epidermis del envés de la hoja, asegurándose de no atravesar la hoja por ambos lados.

Sujete firmemente el lado frontal del primer folíolo mientras aplica una presión contraria suave sobre el cuello. Con el pulgar de una mano, inyecte las mezclas de agrobacterium en tampón de infiltración dentro del cuello mediante una jeringa y una aguja.

Continúe inyectando las mezclas de agrobacterias en la incisión hasta que el círculo de color verde oscuro deje de expandirse. A continuación, cree otra incisión y repita las inyecciones hasta que toda la hoja esté infiltrada y la hoja completa adquiera un tono verde más oscuro. Infiltra completamente las primeras tres hojas y la última hoja, correspondiente a la cuarta hoja de cada planta, utilizando combinaciones de vectores que incluyan ya sea los cuatro vectores virales Gemini o tres vectores magcon.

Además, realice una incisión para cada combinación de cepas de agrobacterium e infiltre cada incisión con una combinación. Después de la infiltración, devuelva las plantas a la sala de crecimiento y supervise la expresión proteica entre dos y quince días. Tras la infiltración, coloque un recipiente en un desecador al vacío y transfiera tres litros de tampón de infiltración que contenga las cepas de agrobacterium.

Luego, conecte el desecador a una bomba de vacío de diafragma de marca Vacuum. Ahora coloque una planta boca abajo sobre la placa del desecador y baje la placa con la planta hasta que todo el sistema de hojas y tallos quede sumergido en el tampón de infiltración, con la placa apoyada encima del recipiente. A continuación, coloque la junta tórica del desecador a lo largo del borde.

Después de colocar la tapa del desecador sobre la cámara, encienda la bomba de vacío y comience a contar el tiempo cuando el vacío alcance 100 milibares. Después de apagar la bomba de vacío, abra lentamente la válvula de liberación del desecador tras un minuto a 100 milibares para permitir la entrada de bacterias agrobacterianas en los espacios intersticiales del tejido vegetal sumergido. Repita esta infiltración.

Paso uno para garantizar una buena infiltración. Luego, retire la planta del desecador y colóquela nuevamente en posición vertical. Devuelva las plantas a la sala de crecimiento y supervise la expresión proteica entre dos y 15 días posteriores a la infiltración.

Para demostrar la eficacia de la infiltración por jeringa de *Agrobacterium* en tejido vegetal, evaluamos la expresión de dos proteínas fluorescentes, GFP y DsRed, mediante dos vectores virales vegetales desmontados diferentes: Gemini viral y magcon para end. Hojas de Hamana que fueron completamente infiltradas con agrobacterias que contienen vectores virales Gemini. La expresión de GFP se observó en toda el área de la hoja bajo luz ultravioleta, a partir de tan pronto como 2 DPI y alcanzó la acumulación máxima a los cuatro DPI.

En contraste, las hojas infiltradas con el vector magcon que contenía combinaciones de agrobacterium mostraron fluorescencia GFP solo después de cinco DPI y alcanzaron su acumulación máxima a los siete DPI. No se observó fluorescencia verde en las hojas infiltradas con mezclas de agrobacterias de control negativo EP uno 10 más P 19, lo que indica que la fluorescencia era específica del gen GFP y no era resultado de fluorescencia de fondo de las hojas. En su punto máximo de acumulación, la fluorescencia del vector magcon expresado hacia GFP es más intensa que la del vector viral Gemini.

No se observó necrosis importante en las hojas infiltradas con construccos GFP cuando ambas proteínas fluorescentes se expresaron en la misma hoja mediante vectores virales Gemini mediante infiltración localizada con jeringa; se detectaron con su color fluorescente esperado en el lugar donde fueron infiltradas. Curiosamente, la coinfiltración de GFP y DS RED produjo una fluorescencia amarillenta. También se examinó la infiltración al vacío para desarrollar un método de agroinfiltración escalable que pueda utilizarse para la producción a gran escala de proteínas recombinantes mediante sistemas de expresión transitoria en plantas.

Como era de esperar, se observó fluorescencia GFP en todas las hojas de la planta infiltrada en comparación con la infiltración mediante jeringa. Este método es más robusto y puede lograr la infiltración de cada planta en un período de tiempo mucho más corto. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 48 horas.

La mayor parte del tiempo se utiliza para cultivo agrobacteriano, ya que el tiempo real de infiltración dura solo unos pocos minutos. Para lograr una eficiencia óptima de la infiltración agrobacteriana y una expresión proteica dirigida, siga el protocolo. Recuerde controlar los parámetros críticos, incluyendo las condiciones de crecimiento de la planta, la concentración de Agrobacterium, la presión de vacío y la duración. En el campo de la biotecnología vegetal.

Este enfoque experimental puede utilizarse para explorar el desarrollo y la bioproducción de proteínas farmacéuticas novedosas en una amplia gama de especies vegetales. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo usar la agroinfiltración para entregar construcciones génicas diana a la planta y permitir que los sistemas de expresión transitoria vegetal produzcan proteínas recombinantes, compitiendo con los cultivos celulares de bacterias, insectos y mamíferos.