La En ovo CAM-ensayo como un Xenograftmodel para el sarcoma

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El objetivo general de este procedimiento es realizar un ensayo de membrana toica de pollo choal o CAM para estudiar el comportamiento del sarcoma, la célula o el injerto. Esto se logra haciendo primero una ventana en la cáscara de un huevo en el tercer día de incubación. En el segundo paso, en el noveno día de incubación, se prepara el material tumoral.

Luego, después de extirpar la capa epitelial, el tumor se agrega a la CAM Durante el paso final en el día 16 de incubación, se fotografía la CAM, se recolecta y se fija en formol para su evaluación histológica. En última instancia, la histología y la inmunohistoquímica clásicas de h y d se utilizan para demostrar el sarcoma, la proliferación celular y la vascularización por invasión, y las reacciones del huésped. La principal ventaja de esta técnica de los métodos existentes, como el xenoinjerto en la mayoría de los modelos, es que es fácil de aprender y relativamente barata.

También le permite estudiar una miríada de actividades asociadas a la metástasis en un período de tiempo muy corto, y no requiere un comité de ética. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del sarcoma, como el efecto de las interacciones entre el huésped tumoral y la supervivencia del tumor, la reconstitución del microambiente tumoral y el reclutamiento de células del estroma. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia personalizada del sarcoma, ya que se puede estudiar el material propio del paciente.

Toda esta nueva técnica puede proporcionarnos nuevos conocimientos sobre la neurogénesis SAR. También es muy aplicable a otros sistemas como la oncogénesis en general. Comience usando un bisturí estéril para cortar la muestra del tumor en pedazos pequeños, no más de un milímetro cúbico, eliminando todas las áreas calcificadas.

Luego pesa la muestra y transfiere de dos a cuatro gramos de tejido a un tubo disociante. Digiere el tejido en 2,5 mililitros de colagenasa dos y 2,5 mililitros de soluciones de DN a. Después de procesar el tejido, de acuerdo con el protocolo de disociación del tumor H, filtre la suspensión resultante a través de un filtro de células de 150 micras.

Ahora centrifuga la suspensión a una fuerza centrífuga adecuada, como de 100 a 500 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Después de eliminar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta, incubar el pellet en 10 mililitros de lisis eritrocitaria, tampón a temperatura ambiente con tación ocasional. Después de 10 minutos, agregue 25 mililitros de medio de cultivo para detener la reacción después de volver a girar la suspensión, el pellet debe ser blanco, desechar el sobrenadante y agregar cinco mililitros de medio a las células, y luego filtrar la suspensión a través de un colador de células de 70 micras.

Utilice un contador automático de células para determinar el número de células vivas por mililitro en el desarrollo. Al tercer día, inserte una aguja de calibre 18 en la punta del huevo y retire dos mililitros de la albúmina para bajar el nivel de la membrana o leva OVO chorio toico. Ahora aplique una película adhesiva semipermeable en la parte superior marcada de la carcasa para evitar el derrame de partículas de la carcasa sobre la leva mientras corta la ventana.

Luego haga un agujero de introducción con un pequeño todo en la superficie del huevo. No dañar la leva durante la apertura de la carcasa es la parte más complicada del procedimiento. Usamos tijeras afiladas sosteniéndolos horizontalmente en una mano mientras mantenemos el huevo en la otra mano.

Ahora, use un par de tijeras quirúrgicas estériles y afiladas para cortar una ventana cuadrada de un centímetro en la cáscara. El corazón pulsante y los vasos adyacentes del embrión ahora deberían ser visibles en la superficie de la yema de huevo. Retire los óvulos no fertilizados o los embriones muertos.

A continuación, selle la ventana con una película adhesiva más semipermeable. Después de volver a centrifugar la suspensión tumoral, vuelva a suspender el pellet en gel de matriz extracelular enfriado una vez 10 a las seis células por cada 100 microlitros de gel. Mantenga esta solución sobre hielo derretido.

A continuación, bajo flujo laminar, utilice un par de tijeras quirúrgicas estériles para extirpar parte de la película adhesiva semipermeable. Retire la capa de células epiteliales tocando ligeramente la leva con una varilla de vidrio estéril. A continuación, añada 4 gotas de 25 microlitros de la suspensión de gel ECM celular a la leva, permitiendo que el gel ECM se polimerice entre las aplicaciones.

De esta manera, se crea una placa adherente que contiene las células cancerosas. A continuación, vuelva a sellar la ventana de la carcasa con una película adhesiva semipermeable. Después del período de incubación experimental adecuado, use un par de tijeras quirúrgicas para agrandar la ventana de la cáscara, asegurándose de no cortar demasiado bajo.

A continuación, utilice una pipeta para añadir de 300 a 500 microlitros de PBS en la sección CAM que contiene el material inoculado. A continuación, fotografíe la cámara a través de un microscopio estereoscópico de fluorescencia. Luego, use un par de tijeras estériles para cortar la membrana en el borde que se encuentra contra la cáscara y coloque la leva cosechada en una placa de Petri estéril llena de PBS o formaldehído tamponado.

A continuación, fotografíe tanto la parte superior como la inferior de la leva, con y sin filtro, como se ve. En esta primera figura, los injertos tumorales se adhieren a la leva. Aquí, se puede observar en estas dos imágenes una suspensión de una sola célula del material del paciente que muestra una placa seca y ligeramente elevada.

Se muestra la marcada arruga de la membrana que se produce después de la escisión de la leva. La línea SAO dos forma una placa que se extiende sobre el CAM con un claro aumento de la superficie a partir del séptimo día. Después de la inoculación, la señal de GFP permanece fuerte, lo que indica células viables.

Estas placas que contienen células SW 1 3 53 muestran una disminución de la superficie y tienden a tener una leva contraída, lo que da lugar a una membrana arrugada. Después de la cosecha desde el séptimo día, se observa con frecuencia sangrado. La señal DSR disminuye a medida que la sonda fluorescente se diluye después de muchas divisiones celulares, así como si se produce sangrado.

En la mayoría de los casos, se observa una reacción vascular de la CAM a medida que nuevos vasos tortuosos ingresan a la muestra. Por ejemplo, también se pueden observar ramificaciones como lo indican las puntas de flecha y anastomosas como lo indican los asteriscos en este sangrado puntiforme como lo indican las flechas, en toda la placa. Obsérvese la migración de las dos células SAOs paralelas a los vasos de la leva.

Esta reacción vascular se puede visualizar después de la escisión de la leva en la vista inferior, mostrando vasos tortuosos que rodean el injerto o la placa. La reacción vascular de la CAM se observa en el grupo de injerto tumoral y en el grupo de suspensión de una sola célula. La evidencia histológica muestra que las dos células de SAO mantienen una apariencia de una sola célula en todo el volumen del gel de la matriz extracelular, lo que provoca un aumento del grosor y el diámetro de la placa.

Las células tumorales invaden la capa mesodérmica de la leva como lo indica aquí la flecha, aumentando así la distancia entre las capas endodérmica y dérmica de la leva como una cremallera que se abre. Como lo indica la flecha doble, el patrón de crecimiento de las células SW 1 3 5 3 y de una suspensión de una sola célula del sarcoma consciente de un paciente está más agrupado con islas de células en una extensión del gel de la matriz extracelular. Como indica la flecha, a pesar de su sitio ectópico de crecimiento, encontramos que las características esenciales y las características inmunohistoquímicas de los tumores de sarcoma originales se mantuvieron en la cámara.

Además, los injertos tumorales se revascularizaron, como lo demuestra la aparición de los eritrocitos de pollo nucleados de color rosa oscuro, como lo indican las puntas de flecha y se encuentran en los vasos. El recuento de células de KI 67 positivo y KI 67 negativo muestra un aumento constante en el número total de células desde el cuarto día para ambas líneas celulares. Después de este día, el número total de células permanece estable siete días después de la inoculación, el número de células KI 67 positivas y el número total de células comienza a disminuir. Se observa una mayor proporción de células positivas para KI 67 cerca de la cámara y una mayor proporción de células negativas para KI 67 en la superficie de la placa.

Una vez dominada, la técnica de leva SA se puede utilizar para analizar 50 veces en 14 horas repartidas en tres días si se realiza correctamente. Se pueden realizar tinciones y evaluaciones adicionales h y e, y requieren tres horas por cada 10 condiciones después de este procedimiento. Se pueden realizar métodos adicionales, como imágenes del estilo de vida, para abordar problemas adicionales como la extravasación o la ización de células cancerosas marcadas con la gripe.

Por lo tanto, con el desarrollo de esta nueva técnica, permite a los investigadores en el campo de las pruebas preclínicas explorar nuevos factores pronósticos y terapéuticos en pacientes con sarcoma. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aplicar el material tumoral en el cmaa y cómo traducir sus observaciones microscópicas y microscópicas hacia una mejor comprensión de las interacciones entre el huésped tumoral.