Visualización de Desarrollo Craneofacial en los SOX10: Kaede pez cebra transgénico Línea Usando Time-lapse microscopía confocal
September 30th, 2013
La visualización de los datos experimentales se ha convertido en un elemento clave en la presentación de resultados a la comunidad científica. Generación de grabación a intervalos regulares en vivo de embriones en crecimiento contribuye a la mejor presentación y la comprensión de los procesos de desarrollo complejos. Este protocolo es una guía paso a paso para el etiquetado de células a través de la proteína fotoconversión Kaede en el pez cebra.
El objetivo general del siguiente experimento es generar una grabación en vivo de la migración de células de la cresta neural para mostrar la formación de estructuras faciales craneales en desarrollo. Esto se logra montando primero un pez cebra transgénico SOX 10 KD anestesiado en agarosa para minimizar el movimiento a lo largo del experimento. A continuación, bajo un microscopio confocal, se lleva a cabo la fotoactivación UV para convertir KD de verde a rojo en las células de la cresta neural.
A continuación, se centra en las células de la cresta neuronal fotoconvertidas. Se genera un Zack de la estructura en desarrollo antes de que se grabe un vídeo time-lapse. Se obtienen resultados que muestran el desarrollo de células de la cresta neural craneal en el paladar primario del pez cebra en un embrión transgénico de pez cebra SOX 10 KD.
La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la imagen estática, es que los procesos de desarrollo complejos, como la migración celular, se pueden visualizar en tiempo real. Esto hace que los resultados sean más accesibles para la comunidad científica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología del desarrollo, como cómo se forman las estructuras derivadas de las células de cresta neurológica y cómo los genes PTO influyen en su desarrollo.
Para prepararse para el montaje de los embriones, use un matraz de 125 mililitros para mezclar E tres agua con microondas aeros de bajo punto de fusión para disolver la solución. A continuación, añada la trica y coloque el matraz en un baño de agua a 50 grados centígrados para mantener el calor y anidar los lazos con embriones de pez cebra soine KD transgénicos brillantemente fluorescentes a las 60 horas después de la fertilización. Luego transfiera cada uno a un portaobjetos de cámara con papel de seda.
Absorber el exceso de agua E tres y luego usar la solución de agarro para cubrir el embrión. Utilice una punta de micro cargador para posicionar el embrión perfectamente dorsal, asegurando que los embriones estén completamente sumergidos en agarro. Después de que el agarro se establezca, use E tres 0.015%trica para llenar el portaobjetos de la cámara para realizar la conversión de fotos.
Comience usando un objetivo de inmersión en aire de 20 x para concentrarse en el embrión. A continuación, pulse el botón de luz L 100 del microscopio y seleccione los canales en el software. Abre los iconos.
Vea los controles de adquisición A una configuración y haga clic en el botón de configuración confocal. A continuación, haga clic en automático y seleccione DPI 4, 88 y 561.9 para los canales 1, 2, 3 respectivamente antes de volver a cerrar la ventana. A continuación, apague los canales uno y tres antes de hacer clic en el botón de eliminación de enclavamiento y pulsar el botón de escaneo a partir de un fotograma por segundo y HV 200.
Comience a concentrarse en las celdas de interés. Aumentando gradualmente los fotogramas por segundo a uno por 32, y reduciendo el voltaje a 100 a 120 dependiendo del ruido de fondo. Cuando el embrión esté enfocado, agarre el borde verde en el borde derecho de la pantalla y encórtalo para que se ajuste al área que se va a convertir en foto antes de hacer clic con el botón derecho del mouse.
Cambie los fotogramas por segundo a uno y el HV a 200 y presione escanear. Ahora se verá una imagen ampliada del área de conversión de fotos. Siguiente foto.
Convierta las celdas activando el canal uno durante un período de cinco a 60 segundos hasta que la señal verde KD esté casi ausente. A continuación, apague el canal dappy. Encienda los canales dos y tres para volver al zoom original.
Haga clic con el botón derecho en la ventana de zoom y elija volver al tamaño original para verificar si las celdas deseadas se convirtieron adecuadamente a las fotos. Establezca los límites del Zack eligiendo el icono de Capture Z Series en la barra de menú. Ajuste las tablas de búsqueda o uts para configurar un lapso de tiempo.
Elija la casilla A una GUI simple y marque los siguientes ajustes. Uno por cada 32 fotogramas por segundo. Tamaño 1024 y un promedio de cuatro u ocho x dependiendo del número de pilas Z que se deben tomar en un bucle.
A continuación, vaya a ver los controles de adquisición de la secuencia ND y establezca el período de tiempo. A continuación, haga clic en continuo y, a continuación, en Zack. Establezca los bordes como se ha demostrado anteriormente.
Inicie la película, agregue una solución E tres 0.015%trica a la cámara, deslícela durante todo el día y llene la cámara por completo para obtener imágenes durante la noche. Una vez finalizada la imagen, cree un vídeo de alta calidad a partir del archivo de imagen haciendo clic en Mostrar proyección de máxima intensidad. A continuación, haga clic con el botón derecho del ratón en la imagen y cree un nuevo documento.
Elimine los fotogramas innecesarios y ajuste los L uts. En esta película que muestra Palato Genesis en el pez cebra, la línea transgénica SOX 10 K se utiliza para seguir las células de la cresta neural craneal a medida que se desarrollan para formar el paladar primario. Las células más anteriores del paladar en formación se fotoconvierten de verde a rojo a las 60 horas después de la fertilización.
Cuando los trabéculos emparejados se han unido para formar el paladar primario, estas células son seguidas hasta que alcanzan su destino final. Esta película muestra el desarrollo perturbado del paladar que conduce a la formación de una hendidura orofacial, derribo de la mota mediado por morino. Una libra, un gen involucrado en la hendidura facial oblicua se usa como ejemplo.
A los 60 HPF, la fotoconversión unilateral de las células de la placa etmoidal más anterior muestra un derrame de falla entre las células de la placa etmoidal mediana y lateral. Este defecto se asemeja a la patogenia del desarrollo de hendiduras faciales oblicuas en humanos, donde se produce un derrame por falla entre el proceso nasal lateral y la prominencia maxilar. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del desarrollo exploraran el desarrollo de las células de la cresta neurológica en el pez cebra.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar este método para capturar su proceso de desarrollo de interés.
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Visión general
Este protocolo describe un método para visualizar la migración de células de la cresta neural en embriones de pez cebra a través de grabaciones de lapso de tiempo en vivo. Mediante la fotoconversión de la proteína kaede, los investigadores pueden comprender mejor el desarrollo de las estructuras faciales craneales.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del desarrollo
- Embriología
Antecedentes
- La visualización de datos experimentales es crucial para la comunicación científica.
- Las grabaciones de lapso de tiempo mejoran la comprensión de procesos de desarrollo complejos.
- Los modelos de pez cebra transgénicos son valiosos para estudiar la dinámica de las células de la cresta neural.
- Las técnicas de fotoconversión permiten un seguimiento preciso de los cambios celulares.
Propósito del estudio
- Generar grabaciones de lapso de tiempo en vivo de la migración de células de la cresta neural.
- Ilustrar la formación de estructuras faciales craneales en pez cebra.
- Utilizar la fotoconversión para una visualización mejorada de procesos celulares.
Métodos utilizados
- Montaje de peces cebra transgénicos SOX 10 KD anestesiados en agarosa.
- Realización de fotoactivación UV para convertir la proteína kaede de verde a rojo.
- Enfoque en células de la cresta neural fotoconvertidas bajo un microscopio confocal.
- Grabación de videos de lapso de tiempo para capturar el desarrollo de estructuras craneales.
Resultados principales
- Visualización exitosa de la migración de células de la cresta neural en pez cebra.
- Demostración de células de la cresta neural craneal que se desarrollan en el paladar primario.
- Generación de un video de lapso de tiempo que muestra la dinámica celular.
- Perspectivas sobre el papel de SOX 10 en el desarrollo craneofacial.
Conclusiones
- El protocolo demuestra eficazmente el comportamiento de las células de la cresta neural in vivo.
- La fotoconversión es una herramienta poderosa para estudiar procesos de desarrollo.
- Los hallazgos contribuyen a la comprensión del desarrollo craneofacial.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Visualizing cranial neural crest cell dynamics in zebrafish provides a predictive model for mechanistic de-risking in craniofacial target validation. The sox10:kaede transgenic system enables high-resolution temporal tracking of migration and differentiation events relevant to human facial morphogenesis. This approach supports early discovery by linking genetic perturbations to phenotypic outcomes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by tracing cranial neural crest contributions to maxillary and mandibular elements.
- Operational Value: Enables precise lineage restriction via photoconvertible kaede reporter, reducing labeling ambiguity compared to dye injection.
- Predictive Value: Supports phenotypic screening of craniofacial mutants to assess target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative spatiotemporal data on cell migration and tissue convergence for assay standardization.
- Operational Value: Produces reproducible time-lapse outputs compatible with high-content imaging pipelines.
- Scalability: Adaptable to any kaede or photoconvertible reporter in transgenic zebrafish for platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Illustrates homology of zebrafish facial prominences to amniotes, enhancing translational relevance.
- Operational Value: Captures both normal and abnormal craniofacial development in mutants for phenotypic validation.
- Risk Mitigation: Enables observation of effusion defects modeling human orofacial cleft pathogenesis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing live imaging of neural crest-derived structures prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in cranial neural crest migration and palate formation.
- Screening: Delivers quantitative confocal readouts for assessing compound effects on cell dynamics.
- Analytics: Enables measurement of migration velocity, convergence timing, and tissue boundary formation.
- Translational Research: Connects zebrafish palate development to human craniofacial homologs for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for developmental phenotype assessment across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation through direct visualization of cell fate decisions.
- Operational Value: Standardizes photoactivation and time-lapse protocols for reproducible neural crest tracking.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking genetic targets to observable craniofacial phenotypes.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of targets based on developmental phenotype severity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, confocal microscopy, and photoconvertible protein handling.
- Dependent on UV-capable confocal systems and agarose embedding infrastructure for embryo immobilization.
- Necessitates standardization of photoactivation duration and z-stack acquisition across users.
- Adaptation considerations include varying promoter-driven reporters and developmental staging across zebrafish strains.
- Practical limitations include phototoxicity from prolonged UV exposure and embryo viability during extended imaging.
