Modificación Multi-Escala de implantes metálicos con gradientes de poro, polielectrolitos y su control indirecto En vivo

El objetivo general de este procedimiento es modificar implantes metálicos a múltiples escalas de longitud para controlar el comportamiento celular in vitro e in vivo. Esto se logra produciendo primero un gradiente de tamaño de poro dentro de implantes tubulares tridimensionales, método de extracción Biofreeze. El segundo paso es desarrollar imitaciones de membrana basal nanofibrilar basadas en colágeno y alginato con la metodología capa por capa.

A continuación, un método indirecto para monitorizar dichos implantes después de la implantación mediante análisis de plasma sanguíneo. La HPLC y la posterior secuenciación de péptidos se demuestran, en última instancia, un implante en el que diferentes áreas pueden acomodar diferentes tipos de células según sea necesario. Para algunos tejidos pluricelulares se pueden obtener, aunque este sistema puede proporcionar una forma de modificar los implantes metálicos.

También se puede aplicar a sistemas de modelos de cultivos celulares en 3D, como tejidos artificiales o modelos de enfermedades. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando intentábamos encontrar una técnica para controlar el movimiento celular alrededor de los implantes de titanio porosos in vivo. Para comenzar este procedimiento, limpie los implantes y diseñe y fabrique moldes de teflón como se describe en el texto escrito para la congelación y extracción.

Prepare la solución de polímero sintético PLLA en una mezcla binaria de dioxina y agua introduciendo el polvo de polímero en el disolvente orgánico. En un Starr magnético, caliente la mezcla a 60 grados centígrados para obtener una solución homogénea. Esta temperatura se selecciona porque es el límite superior de la resistencia a la temperatura para las jeringas de vidrio de precisión que se utilizarán para la introducción de la solución en los implantes.

Mientras tanto, calcule el volumen de la solución polimérica necesaria con respecto a la porosidad del implante teniendo en cuenta el cambio en el volumen de la solución congelada. A continuación, introduzca la solución en los implantes utilizando jeringas de vidrio de precisión con una precisión de 0,1 microlitros. El límite inferior para la concentración de polímero es del 3% para la formación de gradientes de PO reproducibles, o cuando se hace difícil obtener una distribución homogénea en las muestras gruesas por encima del 6%, congelar las muestras directamente a menos 80 grados Celsius o con un período de incubación previo de 30 minutos a temperatura ambiente.

Las condiciones de congelación determinan parcialmente la formación de poros. Por lo tanto, las condiciones de congelación se pueden ajustar de acuerdo con la porosidad deseada. Mantenga las muestras durante la noche a menos 80 grados centígrados.

La separación del molde en estado congelado es un paso muy difícil. Se debe tener cuidado de disminuir el contacto de la solución inferior congelada con el molde, con la ayuda de un cuero cabelludo, Sumerja los implantes en etanol preenfriado al 80% para obtener gradientes de porosidad. Utilice un bisturí preenfriado para eliminar todas las partes del molde excepto el mandril, para los implantes tubulares y todas las piezas excepto la parte inferior para los implantes en forma de disco, realice la extracción a menos 20 grados centígrados durante la noche.

Después de la extracción, retire las piezas restantes del molde y seque los implantes al aire. Para la caracterización de la porosidad general de la estructura. Es necesario el análisis del oxímetro de mercurio.

En este ejemplo, las mediciones del oxímetro de mercurio muestran picos distintos que corresponden a los poros a ambos lados del implante y a los poros más pequeños interdispersos. Sin embargo, el dato más crucial es la diferencia entre las porosidades de las superficies intraluminales y extraluminales, que se pueden analizar mediante la imagen J para la distribución del tamaño de los poros. Después de la fractura por congelación de las muestras mediante la observación de la sección transversal con un microscopio electrónico de barrido.

Debido a la naturaleza porosa abierta de los implantes utilizados y a la capacidad de reflexión de la luz del titanio, es posible hacer pilas Z de células marcadas dentro de los implantes porosos. Las células marcadas con PKH 26 o calcio AM se pueden utilizar para visualizar los implantes con microscopía láser confocal para la acumulación de múltiples capas. La máxima reproducibilidad se obtiene con robots de inmersión.

Sin embargo, si no se dispone de un robot de inmersión, estos pasos se pueden realizar manualmente. Para preparar la solución de colágeno, use colágeno tipo uno de grado médico y alginato de sodio. Las concentraciones optimizadas son de 0,5 gramos por litro para cada uno en 150 milimolares.

El tampón de citrato de cloruro de sodio a pH 3,8 disuelve la solución de colágeno durante la noche para garantizar la homogeneidad. El pH ácido de la solución de 3,8 es necesario para la acumulación estable de las capas, ya que la estructura es inestable. Antes de la reticulación.

En el diseño de pH neutro, un soporte específico para la utilización de los implantes con robots de inmersión utilizados en la producción multicapa de polielectrolito. Deposite las capas en la superficie de implantes de titanio solo o implantes modificados como se describe en el texto. Utilizando un sistema de robot de inmersión, primero sumergiendo los implantes en una solución de alginato durante 15 minutos, luego enjuague la estructura con cloruro de sodio 150 milimolares a pH 3.8 durante cinco minutos.

A continuación, sumérjalo en una solución de colágeno durante 15 minutos. Para estabilizar primero la membrana basal, prepare la solución de reticulación a 100 milimolares de genina. En tampón de citrato A-D-M-S-O en una relación de volumen de uno a cuatro volúmenes, disuelva la genina en el componente DMSO y luego en el componente de agua para evitar la aglomeración, reticulación de las muestras por inmersión en la solución de reticulación entre 12 y 24 horas después.

Enjuague con abundantes cantidades de tampón de citrato a pH 3.8 Después de lavar los pasos, esterilice las muestras con tratamiento UV durante 30 minutos o en un baño antibiótico antifúngico. Los principales parámetros que determinan la calidad de la membrana basal imitada son su grosor y el diámetro de las fibras. Calcule los diámetros de las fibras utilizando microscopía de fuerza atómica o imágenes FM obtenidas en modo de contacto.

Después de secar las muestras con un flujo de nitrógeno, antes de la obtención de imágenes, cuantifique el grosor de al menos 10 fibras por imagen para determinar el espesor promedio de las fibrillas. Con el software Image J, después del secado de las películas multicapa de colágeno de alginato de colágeno 24 bicapas, el grosor de las películas se puede determinar mediante pruebas de rayado. Usando un FM primero, use una aguja de jeringa para rascar la película después de la localización del rasguño con un microscopio óptico, obtenga imágenes con un FM en superficies de 10 por 10 micras cuadradas en el límite del rasguño.

Calcule las alturas a partir de los perfiles obtenidos con el software A FM, que proporciona el espesor de la capa de película. Después de implantar el dispositivo en la tráquea de los conejos como se describe en el texto, obtenga muestras de sangre de sus venas auriculares, centrifugue las muestras a 5.000 RPM durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Utilizar el sobrenadante obtenido para el análisis después de extraer el plasma del conejo con un 0,1% de ácido trior acético.

Realice la purificación por HPLC en fase inversa del contenido de proteínas plasmáticas mediante la purificación del extracto utilizando una columna de fase inversa 305 C 18 de células del núcleo. Registre la absorbancia a 214 y 280 nanómetros utilizando el sistema de solvente y el caudal que se encuentran en el protocolo de texto. Recoja las fracciones pico antes de concentrarlas a través de la evaporación.

Con la aplicación de vacío de velocidad, es importante detener el vacío de velocidad antes de que se seque por completo. Correlacionar los picos obtenidos en diferentes momentos a lo largo del periodo de implantación. Utilice los péptidos purificados que muestran tendencias consistentes durante el curso de la implantación para su identificación mediante secuenciación automática de Edmond.

Cargue la muestra en filtros de fibra de vidrio tratados con polietileno para determinar la secuencia terminal final de los péptidos purificados mediante degradación automática de Edmond utilizando un microsecuenciador profesional preciso. El siguiente paso es la identificación de los aminoácidos fenil, th y uno, por cromatografía en una columna de C 18. Una vez obtenida la secuencia, se puede identificar mediante un software de voladura utilizando la base de datos Swiss Prote.

Al cambiar la concentración de la solución PLLA, es posible controlar el tamaño de los poros en el lado extra luminal de los implantes. El tamaño y la forma de los poros se vieron significativamente afectados por la presencia de implantes de titanio. Los tamaños de los poros oscilaron entre 40 y 100 micrómetros, con la utilización de concentraciones más bajas que dieron lugar a poros más pequeños, mientras que el tamaño de los poros laterales intraluminales se rigió por la extracción restringida y fue de alrededor de nueve micras, que es menor que el tamaño promedio de los fibroblastos.

Al agregar un paso de incubación a temperatura ambiente, se pueden obtener estructuras porosas dobles donde las paredes de los poros más grandes tienen su propia porosidad. Esta característica es importante para los implantes gruesos, ya que facilitaría el movimiento de gases y nutrientes. Una vez que se forma el gradiente de poros, es posible agregar la capa de película de alginato de colágeno sobre la estructura.

Esta capa de película es estable en la parte superior de la espuma PLLA y también se puede mantener en la superficie en ausencia de la formación de fibras de colágeno a nanoescala de espuma. A medida que crece la capa de película, el crecimiento de la película es exponencial. Por lo tanto, se puede obtener una película gruesa de varios cientos de nanómetros.

Los implantes porosos de titanio se integran con el tejido huésped y se llenan por completo entre cuatro y seis semanas in vivo, como se muestra en las secciones transversales del implante explantado. El tejido dentro de los poros es un tejido conectivo maduro con un buen nivel de vascularización. Durante este período, el análisis de HPLC mostró distintos picos que fluctúan durante el curso del tiempo de implantación.

Se secuenciaron las fracciones máximas de interés y se determinó que eran medias cadenas de hemoglobina alfa y beta, que habían mostrado una tendencia similar con las lecturas de proteínas C reactivas. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en un día si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir gradientes PO multiescala en 3D para la modificación de implantes metálicos y para experimentos de cultivo celular.

La extracción por congelación y la capa por la formación de la película son metales simples para desarrollar sus propios implantes modificados o microambientes para células.