Name: Un Minuto, Sub-Uno-Watt fototérmica Ablación Usando Porphysomes, Intrinsic Multifuncional nanovesículas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-17T19:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprende a sintetizar porfisomas mediante extrusión de alta presión para terapia fototérmica en modelos de tumor xenotrasplantado. Este método demuestra eliminación completa de tumores con supervivencia del 100%.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Princess Margaret Hospital Nacional de Ciencia e Ingeniería de Investigación de Canadá, el Instituto Canadiense para la Investigación de la Salud, la Fundación Canadiense de la Innovación y el Joey y Toby Tanenbaum / silla de la bola de Brasil en el cáncer de próstata Research, una subvención de la Fundación de Investigación de SUNY y soporte el arranque desde la Universidad de Buffalo.

1. Síntesis de pirofeofórbido-lípido <ol><li> Combinar 200 pirofeofórbido mmol (preparado a partir de Spirulina Pacifica algas como se describe anteriormente;... Zheng et al, Bioconj Chem., 2002, 13 -392) 4, 98,7 mg 16:00 lysophophatidylcholine (1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero -3-fosfocolina, Avanti Polar Lipids # 855675), 76,3 mg de EDC, 48,7 mg de DMAP (4 - (dimetilamino) piridina) en 5 ml de cloroformo de amileno estabilizado para una proporción de 1:1:2:2 Pyro: Lípidos: EDC : DMPA. </li><li> Se agita la mezcla de reacción a temperatura ambiente bajo argón durante 24 h. Evaporar el cloroformo bajo presión reducida utilizando un evaporador rotatorio con calentamiento a 40 ° C. La mezcla de isómeros-piro piro lípidos (adjuntas en la posición sn-1 o sn-2) se produce. </li><li> Resuspender-piro lípidos mezcla de isómeros en 1 mM de CaCl2, 50 mM Tris (pH 8), 0,5% de Triton X-100 y 10% de metanol a la concentración de 5 mg / ml. Añadir fosfolipasa A2 (PLA2) de miel veneno de abeja en el/ Ml de concentración 0,1 mg e incubar la solución a 37 ° C durante 24 horas para digerir sn-1 piro-lípido y para producir la posición sn-2-piro lípidos isómero puro. </li><li> Añadir 2 volúmenes adicionales de cloroformo y 1,25 volúmenes de metanol, extraer, y luego eliminar el disolvente mediante evaporación rotatoria a presión reducida a 40 º C. Resuspender el producto de escisión en 1% de MeOH en DCM y se purifica sobre una columna de sílice diol pequeño para el isoméricamente pura piro-lípido. </li></ol> 2. Preparación de Porphysomes <ol><li> Disolver pirofeofórbido-lípido, diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-metoxi (polietilenglicol) (PEG-2000-PE) y colesterol en cloroformo separado, y registrar las concentraciones respectivamente. </li><li> Preparar porphysome película de lípido en un tubo de ensayo de borosilicato de 12x75 mm con un peso total de lípidos de 5 mg / tubo mediante la combinación de 65% molar de porfirina-lípido, 5% molar de PEG-2000-PE y 30% molar de colesterol. </li><li> Secar las películas lipídicas en una corriente de nitrogas generador y deje que se secan adicionalmente a vacío durante 1 hora. Almacenar las películas lipídicas a -20 ° C en atmósfera de argón hasta que la hidratación y extrusión futuro. </li><li> Añadir 1 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS, NaCl 150 mM, fosfato 10 mM, pH 7,4) a cada tubo de película de lípidos. Congelar el tubo de ensayo en nitrógeno líquido hasta que esté completamente congelado, y luego descongelar el tubo de 65 ° C baño de agua hasta que la muestra se ha derretido. Vortex el tubo para un total de 30 seg (3x en 10 segundos cada uno, con 5 segundos de re-calentamiento en 65 ° C baño de agua entre cada agitación). </li><li> Repita la congelación-descongelación para 5 ciclos o más sobre sea necesario hasta que no hay grandes agregados pueden ser observados en la solución hidratada. Deje la suspensión porphysome en hielo cuando haya terminado. </li><li> Montar la extrusora de alta presión (10 ml) con dos filtros de policarbonato apilados de 100 nm instalados pulg Conecte la extrusora thermobarrel a un circulador termostatizado para 65 ° C baño de agua circulante, y conecte el sistema extrusor a un tanque de nitrógeno de alta presiónAsegúrese de suministro. </li><li> Transferir la suspensión porphysome a la cámara de la extrusora con una pipeta de transferencia de vidrio de 9 pulgadas. Ajuste la presión girando el dial en el regulador del tanque de nitrógeno hasta que se observe una lectura de entre 200 y 300 psig como presión inicial de extrusión. Abrir la válvula del regulador de la presión gradualmente hasta que se alcanza la tasa de flujo suficiente porphysome o se alcanza un máximo de 800 psig (5440 kPa) de presión. </li><li> Después de la primera pasada de extrusión es completa, cerrar la válvula de control de presión y liberar la presión de la extrusora mediante la apertura de la válvula de alivio de presión en la parte superior del extrusor. Vuelva a llenar la extrusora con la solución porphysome recién extrusionados, y repetir la extrusión de al menos 10 veces para asegurar la solución extruido final es homogénea. </li><li> Determinar la concentración de la solución de porphysome final por la medición de la absorción de una muestra diluida en metanol por UV-Vis. Calcular la concentración usando la siguiente ecuación ingenioh el coeficiente de extinción de 97000 M -1 cm -1 a 410 nm para pirofeoforbida lípidos. </li></ol><img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/50536/50536eq1.jpg" /><ol start="10"><li> Medir la distribución de tamaño final de porphysomes utilizando un Malvern Zetasizer ZS90 por dispersión de luz dinámica. Diluir solución porphysome en PBS y se realizan tres mediciones con 15 carreras cada uno para los resultados promediados. </li><li> Determinar la extinción de la fluorescencia de porphysome mediante la comparación de la emisión de fluorescencia de porphysome se inactivó (1 mM en PBS) y porphysome insaciable (1 mM en 1% de Triton X-100) utilizando espectrofluorómetro. Tome los espectros antes y después de que el detergente (Tirton X-100) se añade, y normalizar la señal de lectura a la fluorescencia máxima. Establezca la excitación de ser 410 nm, y la emisión de longitudes de onda para ser 600-800 nm. </li><li> Mantenga solución porphysomes bajo argón a 4 ° C hasta su uso en el futuro, y protegerlo de la luz por el aluminio faceite. </li></ol> 3. Preparación de los animales modelo de xenoinjerto <ol><li> Cultura de las células KB en RPMI-1640 (con 10% de SFB), y mantener las células en 5% de CO 2 y la atmósfera humedecida a 37 ° C. </li><li> Células Harvest KB utilizando la técnica de cultivo celular estándar. Mantener la suspensión de células (20000 células / ml) en tampón fosfato salino (PBS) en hielo durante el almacenamiento a corto plazo hasta el momento de la inyección. </li><li> Preparar una KB xenoinjertos en ratones desnudos. Los ratones desnudos son adquiridos de Charles River Laboratories cuando son 20 g (Categoría # Crl: NU (NCR)-Foxn1 nu, de 6-7 semanas de edad), teniendo en cuenta la dieta estándar y ropa de cama (Harlan Laboratorios; Dieta: irradiado LM-485, # 7912; Ropa de cama: camas Mazorca de maíz, ¼ &quot;, # 7097). Esterilizar todas las herramientas de manejo de animales (jeringas, pinzas, y la almohadilla animales) antes de los experimentos. Anestesie ratones con 2% de isoflurano v / v en el gas portador de oxígeno 100%. Todos los animales protocolos sean aprobados por la institución (Universidad Health Network en este caso) cuidado de los animales y el uso comité. </li><li> Inyectar las células tumorales suspendidas en PBS por vía subcutánea al flanco derecho de ratones. Los ratones son listo para ser utilizado después de 10 días cuando el tumor alcanza un diámetro de 4-5 mm y espesor de 2-3 mm. </li></ol> 4. In vivo la terapia fototérmica <ol><li> Inyectar porphysomes (que contienen 750 nmol piro a 200 l de volumen) por vía intravenosa a través de la vena de la cola. Llevar a cabo la irradiación láser de 24 horas después de la inyección de porphysomes. </li><li> En esta sección, llevar a cabo todos los procedimientos en una sala de seguridad del láser adjunto. Use gafas de seguridad láser durante la irradiación láser. </li><li> Configure el equipo de irradiación láser. Mantenga la fibra de láser y un difusor por una abrazadera en un soporte. Ajuste la potencia del láser a un nivel bajo y encienda el láser. Ajuste la altura de la fibra láser para lograr un área de irradiación de 9 mm de diámetro (DPSS Laser, LaserGlow Technologies, Toronto, Canadá), calibrar la potencia del láser a 750 mW (1,18 W / cm 2) utilizando apower metros y luego se apaga el láser para preparar a los animales. </li><li> Se anestesia a los animales con isoflurano al 2% v / v en el gas portador de oxígeno 100% a través de cono de la nariz sin barrido evidente de isoflurano un peligro de riesgo para la salud humana). Confirme que el animal está anestesiado suficientemente profundo mediante la realización de una pizca dedo del pie con unas pinzas o los dedos a las patas traseras de los animales. Los animales están listos para la irradiación de láser cuando no responden a este procedimiento. </li><li> Controlar la temperatura del tumor mediante una cámara infrarroja térmica (Mikroshot, LumaSense Technologies). Coloque la cámara cerca del tumor, se centran bien y tomar una imagen pre PTT, así como una imagen de luz blanca regular antes de comenzar la irradiación de PTT. </li><li> Encienda el láser de nuevo, y aumentar la potencia de luz de 750 mW. Coloque el tumor en el centro del rayo láser para hacer el tumor totalmente cubierto, y empezar a cronometrar el irradiación. Tomar la imagen de la temperatura del tumor cada 5 s durante un tratamiento con láser un minuto. Apague el láser a 1 min. Stop el suministro de gas de 2% de isoflurano, espere hasta que se recupere de la anestesia de los animales y lo devolvió a la jaula. </li><li> Mantenga ratones a normotermia sala de animales bajo las 12:12 h oscuridad ciclo y la luz de acuerdo a los animales protocolos aprobados por la Universidad Health Network. Inyectar buprenorfina (0,05 mg / kg, por vía subcutánea dos veces al día durante una semana después de la irradiación con láser para reducir el dolor causado por la cicatriz. Cada dos días, mida el diámetro del tumor usando una pinza y tomar una foto. Calcular el volumen de los tumores utilizando la siguiente ecuación: V = π / 6 · a · b 2, donde a es el diámetro de largo, y b es el corto. </li><li> Sacrificio de los animales poniéndolos en CO cámara 2 cuando el diámetro largo del tumor llega a 10 mm, ya que es el punto final definido en nuestro laboratorio. Realice dislocación cervical después del tratamiento CO2. Trazar la curva de supervivencia. </li></ol>

<ol><li>Lovell, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphysome+nanovesicles+generated+by+porphyrin+bilayers+for+use+as+multimodal+biophotonic+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents.</a> Nat. Mater. 10, 324-332 (2011).</li>
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<li>Zheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+reconstituted+by+pyropheophorbide+cholesteryl+oleate+as+target-specific+photosensitizer%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer.</a> Bioconjug Chem. 13, 392-396 (2002).</li>
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</ol>

No tenemos nada que revelar.

En el desarrollo de tecnologías de administración de fármacos, las nanopartículas multifuncionales son actualmente en amplias investigaciones para un seguimiento preciso del vehículo de suministro de fármaco mientras se mantiene una carga útil elevada de fármaco. Liposomas de porfirina-cargada se han desarrollado para mejorar las propiedades farmacocinéticas y la entrega más eficiente que la administración directa de porfirina, sino que existen obstáculos, incluyendo la cantidad de carga restringido de porfirina y rápid...

Porphysomes son novedosos nanovesículas multifuncionales que hemos desarrollado recientemente, que son capaces de imagen multimodal y la terapia 1. Se forman a partir bicapas de porfirina auto-ensambladas y contienen una gran densidad de porfirina (más de 83, 000/porphysome de partículas), que genera gran coeficiente de extinción y los resultados en la fluorescencia única de auto-extinción dependiente de la estructura. Porphysomes tienen buenas in vivo farmacocinéticos y de biodistribución propiedades: que exhiben una vida media de 12 h de sangre después de la administración sistemática, y de forma pasiva se acumulan en los tumores de xenoinjertos con 7,5% ID / g a las 24 h después de la inyección 2. Su singular estructura y las propiedades físico-químicas hacen porphysome un buen candidato para la imagen multimodal y la terapia guiada por imágenes. En primer lugar, que contiene porfirina, porphysomes son intrínsecamente adecuados para imágenes de fluorescencia de los tumores de la acumulación del tumor 1.Además, cada uno de porfirina tiene un sitio estable para radioisótopos quelantes, por lo tanto, porphysomes pueden ser fácilmente etiquetados con radioisótopos tales como 64Cu para formación de imágenes de PET 3. Además, la energía de la luz absorbida se disipa térmicamente bajo exposición de irradiación láser cuando porphysome estructura está intacta, por lo porphysomes también exhiben formación de imagen fotoacústica único y capacidades de PTT. Se ha demostrado que 24 horas después de la inyección intravenosa de porphysomes, la irradiación con láser del tumor porphysome-acumulada indujo un aumento rápido de la temperatura y fuerte ablación del tumor fototérmica. Esto demostró que porphysomes son potenciadores fototérmicos eficientes, con un coeficiente de extinción tan alto como las nanopartículas de oro (AuNPs) 1. Por otra parte, en comparación con otros agentes fototérmicos inorgánicos, incluyendo AuNPs, porphysomes muestran una ventaja excepcional en la bioseguridad debido a su naturaleza orgánica. Porphysomes son enzimáticamente biodegradable e inducen toxicit aguda mínimay en ratones con dosis intravenosas tan altas como 1000 mg / kg 1. Además, de forma similar a los liposomas, la gran núcleo acuoso de porphysomes podría ser pasiva o activamente cargado con agentes terapéuticos o de formación de imágenes. Las propiedades ópticas y biocompatibilidad de porphysomes demuestran el potencial multimodal de nanopartículas orgánicas para imagen biofotónica y la terapia. En este trabajo, presentamos el método de síntesis de los conjugados pirofeoforbida lípidos, la fabricación y el método de caracterización de porphysomes por extrusión a alta presión. In vivo PTT en ratones se lleva a cabo también para demostrar la eficiencia de porphysome habilitados PTT en el tumor tratamiento usando un modelo de tumor de xenoinjerto subcutáneo.

<table><tbody><tr><td>Evaporador rotativo</td><td>Thermo-Savant</td><td>SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Votex</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236 Número de</td><td>modelo: G560</td></tr><tr><td>Extrusora de alta presión</td><td>LIPEX, Northern Lipids Inc.</td><td>T.001</td><td>Extrusora Thermobarrel de 10 ml</td></tr><tr><td>Circuladores de baño calentado (Circulador termostático)</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>SC100-S5P</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de policarbonato </td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005</td><td>Tamaño de poro 100 nm y diámetro de membrana 19 mm</td></tr><tr><td>Zetasizer</td><td>Malvern Instruments</td><td>ZS90</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV/Visible</td><td>Varian Australia</td><td>Cary 50 Bio UV / Espectrofotómetro</td><td> </td></tr><tr><td>Visible Espectrofluorómetro</td><td>HORIBA Scientific</td><td>FluoroMax-4</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía electrónica de transmisión (TEM)</td><td>Hitachi</td><td>H-7000</td><td></td></tr><tr><td>incubadora de cultivos celulares</td><td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>Medidor</td><td>de potencia Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>con sensor S142C</td></tr><tr><td>671nm Láser</td><td>LaserGlow Technologies</td><td>LRS-0671_PFN-02000-05</td><td>S/N:10097270</td></tr><tr><td>Termómetro infrarrojo</td><td>Mikroshot, LUMASENSE Technologies</td><td>9102409</td><td></td></tr><tr><td>Gafas protectoras láser</td><td>LaserGlow Technologies</td><td>AGF6602XX</td><td>Densidad óptica: 1,5+ a 630-700 nm</td></tr></tbody></table>

un minuto, sub-uno-watt fototérmica ablación usando porphysomes, intrinsic multifuncional nanovesículas

One Minute, Sub-One-Watt Photothermal Tumor Ablation Using Porphysomes, Intrinsic Multifunctional Nanovesicles

Recientemente hemos desarrollado porphysomes como nanovesículas intrínsecamente multifuncionales. Un fotosensibilizador, pirofeoforbida α, se conjugó con un fosfolípido y luego auto-ensamblado de vesículas esféricas en liposomas similares. Debido a la altísima densidad de porfirina en la bicapa lipídica-porfirina, porphysomes generan grandes coeficientes de extinción, dependiente de la estructura de la fluorescencia de auto-extinción, y una excelente eficacia fototérmica. En nuestra formulación, porphysomes se sintetizaron usando extrusión de alta presión, y muestran un tamaño medio de partícula de alrededor de 120 nm. Inyección Veinticuatro horas después de la intravenosa de porphysomes, la temperatura local del tumor aumentó de 30 ° C a 62 ° C rápidamente tras la exposición durante un minuto de 750 mW (1,18 W / cm 2), 671 nm irradiación con láser. Tras la ablación térmica completa del tumor, escaras formado y curado en 2 semanas, mientras que en los grupos de control de los tumores continuaron creciendo y todos llegaron a la linea definidapunto d dentro de 3 semanas. Estos datos muestran cómo porphysomes se pueden utilizar como terapia fototérmica potentes agentes (PTT).

Pirofeofórbido se conjuga con el fosfolípido como un monómero de lípidos estable (Figura 1a) y el conjugados auto-ensamblan para formar porphysomes por el método de extrusión de la membrana usando una extrusora de alta presión. Por lo general es difícil de extruir suspensión porphysome lípidos en los 3 primeros ciclos de extrusión con una tasa de flujo relativamente lento. Como se repiten más extrusiones, la tasa de flujo de la solución extruido aumenta gradualmente, y la presión se puede disminuir lige...

Desarrollamos nuevos nanovesículas multifuncionales intrínsecas llamados porphysomes, que tienen la estructura dependiente de fluorescencia propiedades fototérmicos únicas de auto-extinción y, por lo que funciona agentes de terapia fototérmica como potentes. Formulamos porphysomes por extrusión a alta presión y se investigó su eficacia de la terapia fototérmica en un modelo de tumor de xenotrasplante.

Un Minuto, Sub-Uno-Watt fototérmica Ablación Usando Porphysomes, Intrinsic Multifuncional nanovesículas

We recently developed porphysomes as intrinsically multifunctional nanovesicles. A photosensitizer, pyropheophorbide &alpha;, was conjugated to a ...

Los objetivos generales del siguiente experimento son demostrar la síntesis de porfurosomas mediante un extrusor de alta presión y la eficacia de la terapia fototérmica mediada por porfurosomas en el tratamiento de tumores en un modelo de tumor xenoinjertado subcutáneo. Esto se logra mediante la conjugación de piro cuatro por alfa a un fosfolípido para formar el piro cuatro por lípido; en un segundo paso, los piro cuatro por lípidos se autoensamblan en porfurosomas mediante extrusión a alta presión y se caracterizan para control de calidad. A continuación, los porfurosomas se inyectan en animales portadores de tumores subcutáneos para demostrar su eficacia en la terapia fototérmica. Tras la irradiación con láser, los resultados muestran que los porfurosomas son nanopartículas con alta homogeneidad y fluorescencia altamente apagada, y que los porfurosomas son un agente fototérmico potente, basado en la tasa de supervivencia del 100 % en el estudio in vivo con animales.Los porfirasomas son las primeras nanopartículas orgánicas que actúan como potenciadores fototérmicos eficientes, manteniendo al mismo tiempo la capacidad de carga de fármacos y la biocompatibilidad de los liposomas co

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Insonación de microburbujas es una estrategia prometedora para la ablación del tumor en un promedio de reducción de tiempo de potencias acústicas, así como para la distribución selectiva de la terapéutica. El propósito del presente estudio es desarrollar estrategias de ultrasonido de baja deber ciclo de pulsación y nanotransportadores para maximizar no de ablación térmica microvascular y la entrega a la carga por vía subcutánea C6 gliomas.

Ecografía de contraste dirigidos tratamiento de los gliomas en ratones a través de la entrega de nanopartículas de drogas y la ablación Teniendo microvascular

Cambio de fase (nanoemulsiones PSNE) puede ser vaporizado mediante ultrasonidos focalizados de alta intensidad para mejorar la calefacción localizada y mejorar la ablación térmica en los tumores. En este informe, la preparación de PSNE estable con una distribución de tamaño estrecha se describe. Además, el impacto de PSNE vaporizado en ablación por ultrasonidos mediada se demuestra en fantasmas que imitan tejidos.

Síntesis de nanoemulsiones de cambio de fase con distribuciones de tamaño estrechas para la vaporización Droplet acústica y Bubble mejorada ablación por ultrasonidos mediada

Un aparato de calentamiento basado en láser de diseño personalizado compatible con MRI ha sido desarrollado para proporcionar calentamiento local de tumores subcutáneos con el fin de activar la liberación de agentes a partir de liposomas termosensibles específicamente a la región del tumor.

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Microburbujas magnéticas, acústicas y ópticas de triple respuesta para la hipertermia magnética y la terapia combinada de cáncer potototérmico

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