Medición de fuerza durante la contracción para evaluar la función muscular en larvas de pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es medir la generación de fuerza durante una contracción máxima del pez cebra, larva y músculo del tronco. Esto se logra haciendo primero bucles de sutura que se utilizarán para mantener las larvas en su lugar durante las mediciones de fuerza. A continuación, las larvas anestesiadas se colocan dentro de la cámara experimental.

Una vez en su lugar, la fuerza se registra durante una contracción máxima de contracción. El paso final es medir las dimensiones de la musculatura del tronco para que la fuerza máxima pueda normalizarse al área de la sección transversal del músculo. En última instancia, la medición de la generación de fuerza durante la contracción se utiliza para mostrar los cambios en la función muscular y la salud muscular en general.

Aunque demostramos este método utilizando larvas de pez cebra de tipo salvaje, también se puede utilizar con larvas modificadas genéticamente o con larvas tratadas con medicamentos o tóxicos. El método se puede utilizar para caracterizar modelos de enfermedades musculares y evaluar tratamientos o para estudiar el desarrollo muscular, las lesiones o la toxicidad química. El primer paso es preparar los bucles de sutura que se utilizarán para mantener las larvas en su lugar.

Durante la prueba de fuerza, use pinzas para separar la sutura no estéril en tres hebras. Una vez separados, comience a hacer un nudo doble por encima de la cabeza en una de las hebras, pero deténgase antes de apretar el nudo por completo para hacer un pequeño bucle. En lugar de terminar el bucle, usa unas tijeras para cortar el exceso de sutura de las colas.

Coloque el lazo en el lado adhesivo de una nota adhesiva para usarla más tarde. Haga dos asas de sutura para cada larva que se va a analizar. Primero, coloque el aparato de prueba en la plataforma de un microscopio estereoscópico.

A continuación, conecte el transductor de fuerza y los cables del controlador de longitud al aparato de prueba. Encienda el transductor de fuerza y el controlador de longitud y accione el interruptor en la parte frontal del controlador de longitud. Eso hace que el tubo del controlador de longitud esté puenteado con una transferencia desechable. Pipeta.

Llene la cámara experimental con solución de prueba. Use pinzas para recoger un lazo de sutura por una de las colas como agarre. El bucle de la parte curva puede doblar la sutura y hacer que se rompa durante los pasos posteriores.

Cuelgue un bucle en el tubo del transductor de fuerza y otro en el controlador de longitud Con una pipeta de transferencia desechable, transfiera una larva de pez cebra a una pequeña placa de Petri llena de solución de prueba. Una vez que el anestésico haya hecho efecto, empuje suavemente la cola para verificar que haya una falta de natación evocada por el tacto. A continuación, utilice una pipeta de vidrio para transferir las larvas a la cámara experimental con pinzas.

Guíe suavemente la porción anterior de la larva a través del asa de sutura en el tubo transductor de fuerza, agarrando ambas colas del asa de sutura. Tire de ellos simultáneamente para apretar el lazo posterior al saco de roble o a la vejiga natatoria con pinzas. Sostenga una cola de sutura y tire de ella, haciendo que las larvas giren 90 grados alrededor del tubo hasta que el lado lateral de la larva quede hacia arriba.

Usando el dispositivo de posicionamiento X, Y, Z conectado al controlador de longitud, mueva el tubo del controlador de longitud a lo largo del eje x y debajo del tronco y la cola de las larvas. Deje espacio entre los extremos del tubo controlador de longitud y el tubo del transductor de fuerza. A continuación, guíe el bucle de sutura sobre la cola de las larvas y apriete el bucle de sutura.

Como se demostró anteriormente, es posible que deba girar la parte posterior de las larvas para que el lado lateral quede hacia arriba. Una vez en su lugar, recorte las colas del bucle de sutura. Utilice los dispositivos de posicionamiento XY, Z para bajar lentamente los tubos hasta que toquen el fondo de la cámara.

A continuación, eleve las larvas a una distancia adecuada del fondo de la cámara. Esto debe estar dentro de la distancia de trabajo de un objetivo de microscopio invertido utilizado posteriormente. Finalmente, ajuste el tubo controlador de longitud para alinear el eje largo de la larva con el eje largo del tubo del transductor de fuerza.

Para comenzar, mueva el aparato de prueba a la etapa de un microscopio invertido. A continuación, conecte el termómetro circulador del baño de agua y el controlador de temperatura al aparato de prueba. Encienda los componentes necesarios y ajuste la configuración del controlador de temperatura al valor deseado.

Conecte los cables del estimulador al aparato de prueba. Encienda el estimulador, pero no estimule las larvas en este punto. Para comprobar que las larvas están paralelas al fondo de la cámara, observe la porción de las larvas entre los extremos de los tubos.

Si son paralelos, ambos extremos de las larvas estarán enfocados si es necesario. Ajuste el tubo del transductor de fuerza hasta que ambos extremos estén enfocados y la larva esté paralela. Encienda el sistema de longitud del sarcómero de vídeo y gire la cámara de vídeo de forma que las estrías queden paralelas a los lados del fotograma de vídeo.

El espaciado de las estrías se utiliza como indicador de la longitud del sarcómero. Ajuste el microscopio para enfocarse en las fibras periféricas y observe la longitud indicada del sarcómero. Si es necesario, ajuste el controlador de longitud para acortar las larvas hasta que la longitud del sarcómero sea inferior a la óptima Para optimizar la fuerza de contracción.

Primero, configure la corriente de salida en el estimulador a baja magnitud y luego programe un software especializado para entregar pulsos de corriente. 0,2 milisegundos de duración. Administre el primer pulso y utilice el osciloscopio para medir la fuerza máxima de contracción.

Aumente la corriente en incrementos de 50 miliamperios y mida la fuerza máxima de contracción en cada nuevo nivel de corriente. Espere 30 segundos entre espasmos para evitar la fatiga a medida que aumenta la corriente de estimulación. La fuerza máxima de contracción generalmente aumenta a un máximo y luego disminuye gradualmente la corriente a la que se genera la larva.

La mayor fuerza es la corriente de estimulación óptima una vez identificada, ajuste la amplitud de la corriente a la corriente de estimulación óptima y ajuste la longitud de las larvas para provocar la máxima fuerza de contracción. Finalmente, provoque una contracción de los músculos de la larva. Utilice el osciloscopio para registrar la respuesta a la fuerza y guardar el registro para el análisis posterior.

Para medir las dimensiones de la musculatura, vuelva a colocar el aparato de prueba en el microscopio estereoscópico. Usando la escala IP, mida la altura de la musculatura vista desde un lado. Tome las medidas en un punto de referencia anatómico.

Por ejemplo, la abertura urogenital marcada aquí en rojo. Luego teniendo cuidado de no cambiar la longitud de las larvas. Gire las larvas 90 grados usando las colas del bucle de sutura para ver las larvas desde la parte inferior.

Mide el ancho de la musculatura visto desde la parte inferior. Finalmente, corte los bucles de sutura con una micro cuchilla para liberar las larvas del equipo de prueba en larvas sanas de pez cebra de tipo salvaje, las fibras musculares deben ser paralelas entre sí sin grandes espacios entre ellas y tener evidencia de estrías las larvas de pez cebra de tipo silvestre que no exhiben estas características o con daños evidentes como fibras desprendidas como se ve aquí deben descartarse aquí. La fuerza máxima de contracción frente a la corriente de estimulación se traza para una sola larva de pez cebra.

La corriente de estimulación óptima suele estar entre 400 y 600 miliamperios. Aquí se muestra una respuesta de fuerza representativa recogida durante una contracción de contracción máxima de una sola larva. Aquí. Se muestra que los valores de fuerza máxima de las larvas de tipo silvestre de diferentes edades oscilan entre 0,9 y 1,7.

Mili newtons con larvas más viejas que generan más fuerza que las larvas más jóvenes. Las larvas más viejas generan más fuerza que las larvas más jóvenes, incluso después de que las fuerzas máximas se normalizan en el área muscular de la sección transversal. Al intentar este procedimiento, es importante apretar los bucles de sutura lo suficiente como para que las larvas no puedan girar fácilmente alrededor del transductor de fuerza y los tubos controladores de longitud.

Si los bucles de sutura están demasiado sueltos, la fuerza generada por la larva no se transmitirá completamente al transductor de fuerza y se subestimará la fuerza de contracción máxima.