Name: Medición de fuerza durante la contracción para evaluar la función muscular en larvas de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprende a medir la fuerza de contracción muscular en larvas de Danio rerio para evaluar la función y salud muscular. Este protocolo permite estudiar respuestas a fármacos y toxicantes en modelos de enfermedad.

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Los autores agradecen a Angela Busta para obtener ayuda con la cría de pez cebra. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (AG-020591 de SVB y 1K08AR054835 a JJD).

Nota: todos los procedimientos relacionados con el pez cebra se deben realizar de acuerdo con las directrices, reglamentos, y las agencias reguladoras. Todos los procedimientos de uso de animales que aparecen en este artículo fueron aprobados por la Universidad de Michigan, el Comité de Uso y Cuidado de los Animales (UCUCA). 1. Haga sutura Loops <ol><li> Use unas pinzas para separar la sutura no estéril (USP 10/0 monofilamento de nylon, 3 capas) en tres vertientes. </li><li> Empezar a hacer un nudo doble simple en una de las cadenas. Detener antes de apretar el nudo completamente para hacer un pequeño bucle (~ 1 mm de diámetro) en lugar de un nudo. </li><li> Utilice unas tijeras para cortar el exceso de sutura de las colas de bucle. Un ejemplo de un bucle terminado se muestra en la Figura 1. </li><li> Coloque el lazo en el lado adhesivo de un Post-it para su uso posterior. Los lazos de sutura se utilizan para mantener las larvas en su lugar durante la prueba de fuerza. </li><li> Repita los pasos 1.1 a 1.4, según sea necesario. Make dos bucles de sutura para cada larva que se pondrá a prueba. </li></ol> 2. Haga Solución Pruebas <ol><li> Hacer solución Tyrodes mediante la adición de 7,977 g de cloruro de sodio, 0,373 g de cloruro de potasio, 0,265 g de cloruro de calcio dihidrato, 0,102 g de hexahidrato de cloruro de magnesio, 0,048 g de fosfato de sodio monobásico, 1,000 g de bicarbonato de sodio, y 0,037 g de ácido etilendiaminotetraacético disódico dihidrato de la sal a 1000 ml de agua purificada. </li><li> Se agita la solución hasta que las sales se disolvieron por completo. Esta solución se puede almacenar durante un mes a 4 ° C. </li><li> Añadir 2,1 ml de 4 mg / ml tricaína, preparado de acuerdo con el Libro de pez cebra 24, a 47,9 ml solución Tyrodes y mezclar. Proteja esta solución de la luz guardándolo en una botella de vidrio oscuro o en una botella de vidrio cubierto con papel de aluminio. Esta solución debe ser almacenada a temperatura ambiente y se hizo fresco cada día. </li></ol> 3. Ate Larva Aanesthetized en Sala Experimental <ol> &lt;li&gt; Coloque el aparato de prueba (Figura 2) en el escenario de un microscopio estereoscópico. </li><li> Conecte el transductor de fuerza y ​​los cables del controlador longitud del aparato de prueba. Encienda el transductor de fuerza. Encienda el regulador de duración para que quede rígida. (Nota:.. El controlador longitud proporciona la capacidad para estirar o acortar una preparación de músculo durante una contracción Sin embargo, esta característica del regulador de duración no se utiliza en el método descrito en este documento Por lo tanto, el controlador de la longitud puede ser pensado como un accesorio rígido punto montado en un sistema de posicionamiento XYZ). </li><li> Con una pipeta de transferencia desechable, llenar la cámara experimental con solución de prueba. </li><li> Utilice pinzas para recoger un lazo de sutura por una de las colas y colgarlo en el tubo transductor de fuerza. Espera un segundo lazo de sutura en el tubo conectado al regulador de duración. (Nota: agarra un lazo de sutura en la parte curva puede doblar la sutura y cauSE que se rompa durante las etapas posteriores). </li><li> Con una pipeta de transferencia desechable, transferir una larva de pez cebra a una pequeña placa de Petri llena de solución de prueba. Espere a que el anestésico en la solución de prueba (tricaína) entre en vigor (~ 1 min). Con unas pinzas, empujar suavemente la cola y compruebe que la larva está anestesiado por la falta de tacto-evocó la natación. </li><li> Usar una pipeta de vidrio para transferir las larvas a la cámara experimental. </li><li> Por empujando suavemente la larva con unas pinzas cerradas, guiar a la porción anterior de la larva a través del lazo de sutura en el tubo del transductor de fuerza. Guía de la porción anterior de la larva a través del lazo de sutura en el tubo. Agarre ambos bucle colas de sutura con unas pinzas y tirar de ellos simultáneamente para apretar el lazo de sutura posterior al saco vitelino o vejiga natatoria (Figura 3A). </li><li> Con unas pinzas, mantenga un lazo de sutura y tirar de la cola, haciendo que la larva de girar 90 ° alrededor del tubo hasta que el lado lateral de la cara larvas arriba (Figura 3B). Si el bucle se ha reforzado lo suficiente, habrá algo de resistencia a la tracción; la larva no debe girar fácilmente. Si el bucle se aprieta demasiado, la larva no girará alrededor del tubo. </li><li> Utilizando el dispositivo de posicionamiento XYZ conectada al controlador longitud, mueva el tubo de controlador de longitud a lo largo del eje X (eje de las definiciones en la Figura 2A) y en el tronco y la cola de la larva. Deje espacio entre los extremos del tubo regulador de duración y el tubo transductor de fuerza. </li><li> Guía del lazo de sutura sobre la cola de la larva y apretar el lazo de sutura como se ha descrito anteriormente (Figura 3C). Puede que tenga que girar la parte posterior de la larva para que el lado lateral hacia arriba. Corte las colas de bucle de sutura (Figura 3D). </li></ol> 4. Posición Larva en la Cámara Experimental <ol><li> Mover la larva a una distancia apropiada desde el fondo de la cámara para asegurar el w larvamal estar dentro de &quot;trabajo a distancia&quot; de un objetivo de microscopio invertido durante los pasos siguientes. Para lograr esto, utilizar los dispositivos de posicionamiento XYZ para bajar lentamente los tubos (con larva adjunto) a lo largo del eje Z hasta que los tubos sólo tiene que tocar la parte inferior de la cámara. A continuación, elevar los tubos hasta que la larva es una distancia apropiada desde el fondo de la cámara (~ 100 micras). </li><li> Utilizando el dispositivo de posicionamiento XYZ conectada al controlador longitud, ajustar el controlador de tubo de longitud a lo largo del eje Y para alinear el eje largo de la larva con el eje largo del tubo de transductor de fuerza. </li></ol> 5. Registro de la Fuerza durante una contracción máxima Twitch <ol><li> Mueva el aparato de prueba para la etapa de un microscopio invertido. </li><li> Ajuste la temperatura de la cámara a un valor deseado. Para empezar, conectar el baño de recirculación de agua, termómetro, y controlador de temperatura para el aparato de prueba. Encienda los componentes necesarios y ajustar las configuraciones en el contr temperaturaoller hasta que el termómetro informa el valor deseado. Los datos incluidos en este artículo se recogieron a 25 ° C, pero las mediciones también se pueden realizar a temperatura ambiente o a 28,5 ° C. </li><li> Conectar los cables del estimulador para el aparato de prueba. Encienda la alimentación del estimulador pero no estimulan la larva hasta el paso 5.6. </li><li> Asegúrese de que la larva es paralelo al fondo de la cámara. A través de un objetivo de 40X, ver la parte de la larva entre los extremos de los tubos. Si paralela a la parte inferior, los dos extremos de la larva estarán en foco. Si es necesario, ajustar el tubo de transductor de fuerza a lo largo del eje Z hasta que ambos extremos están en foco. </li><li> Compruebe que la longitud larva es más corto que el óptimo. Encienda el sistema de longitud del sarcómero vídeo y girar la cámara de vídeo de tal manera que las estrías son paralelos a los lados de la trama de vídeo. Este sistema controla espaciamiento estriación mediante el análisis de las variaciones de intensidad de los píxeles a lo largo de cada fila horizontal de pixeles dentro de una región definida por el usuario de interés(ROI). Los resultados de todas las filas en el retorno de la inversión se promedian y se informaron con una frecuencia equivalente a la velocidad de fotogramas (≥ 80 s-1) video. El espaciado de estriación se utiliza como un indicador de la longitud del sarcómero. </li><li> Ajuste el microscopio para centrarse en las fibras periféricas y anote la longitud del sarcómero indicado. Si es necesario, utilizar el dispositivo de posicionamiento XYZ conectada al controlador longitud para ajustar la longitud de la larva (eje X) hasta que la longitud del sarcómero es menos que óptima (por ejemplo, 1,90 m). </li><li> Ajuste la corriente para optimizar la fuerza de contracción estimulación. Para empezar, ajustar la corriente en el estimulador a una baja magnitud (por ejemplo, 100 mA) de salida. El estimulador se puede activar de forma manual o mediante un equipo que ejecuta un programa de LabVIEW personalizado. Provocar una contracción de los músculos de larvas con un impulso de corriente de 0,2 mseg de duración. </li><li> Utilice un osciloscopio para registrar la salida de la fuerza y ​​medir la fuerza de contracción máxima utilizando los cursores del osciloscopio. Aumente la corrienteen incrementos de 50 mA y medir la fuerza de contracción máxima en cada nivel de curso. Espere 30 segundos entre las contracciones para evitar la fatiga. Como aumenta la corriente de estimulación, la fuerza de contracción pico típicamente aumenta hasta un máximo y luego disminuye gradualmente. La corriente a la cual la larva genera la fuerza más grande es la corriente de estimulación óptima. Ajuste la amplitud de la corriente a la corriente de estimulación óptima. </li><li> Utilizando el dispositivo de posicionamiento XYZ, ajustar la longitud de la larva (y por lo tanto, la longitud del sarcómero) a fin de obtener la máxima fuerza de contracción. Larvas de pez cebra de tipo salvaje (3-7 dpf) generar la máxima fuerza de contracción del sarcómero en longitudes de 2,10 m o 2,15 micras. Sin embargo, la longitud del sarcómero se puede ajustar a 2,08 micras para evitar el exceso de tensión en la larva. </li><li> Provocar una contracción de los músculos de las larvas. Utilice el osciloscopio para registrar la respuesta de la fuerza y ​​guardar el registro para su posterior análisis. </li></ol> 6. Mida musculatura Dimensiones con Larva en Optimal Longitud <ol&gt; <li> Mueva el aparato de prueba de nuevo al microscopio estereoscópico. </li><li> Usando la escala ocular, medir la altura de la musculatura como se ve desde el lado. Luego, con cuidado de no cambiar la longitud de la larva, la larva bascular 90 ° con el bucle de sutura en la cola para poder ver la larva de la parte inferior. Mida el ancho de la musculatura como se ve desde la parte inferior. Tome las medidas en un punto de referencia anatómica (por ejemplo, apertura urogenital) (Figura 4). </li><li> Cortar los lazos de sutura con un microcuchilla para liberar la larva del equipo de prueba. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Este método mide la generación de fuerza durante una contracción para evaluar la función muscular en los músculos del tronco de larvas de pez cebra. Aunque las contracciones tetánicas pueden ser provocados en larvas de pez cebra (por ejemplo, por 200 pulsos de estimulación / seg para una duración de 0,2 segundos), la fuerza tetánica máxima es sólo un 10-15% mayor que la fuerza máxima de contracción. Por lo tanto, la fuerza generada durante un tic es una medida razonable de la capacidad de generación de fuerza. Twitches se prefieren sobre las contracciones tetánicas debido a contracciones nerviosas son menos propensos a causar que rasga o se deslice en los lazos de sutura. Con el fin de generar datos significativos con esta técnica, la máxima fuerza de contracción se debe lograr para cada larva y la variabilidad entre los grupos experimentales debe reducirse al mínimo. Con estos objetivos en mente, ofrecemos las siguientes sugerencias. En primer lugar, tenga cuidado al atar la larva al transductor de fuerza y ​​los tubos del regulador de longitud. Si los bucles de sutura se aprietan demasiadomucho, la sutura se corte a través del tejido muscular. Si los bucles de sutura no se aprietan lo suficiente, la fuerza generada por la larva no será totalmente transmitido al transductor de fuerza. Ambas situaciones, pero sobre todo este último, subestiman la fuerza máxima de contracción. En segundo lugar, dado que las pruebas múltiples grupos experimentales pueden tardar varias horas (20-30 min / larva), alternan entre grupos porque las larvas continuará desarrollando durante el periodo de prueba. Mientras que algunos de los equipos mencionados es esencial para la medición de la fuerza máxima de contracción (por ejemplo, transductor de fuerza, estimulador de corriente), otros artículos no son absolutamente necesarias. El sistema de la longitud del sarcómero vídeo es deseable, pero no necesario. Como una alternativa, una serie de contracciones nerviosas se puede utilizar para encontrar la longitud óptima, durante el cual la longitud de la larva se ajusta hasta que se consigue la máxima fuerza de contracción. Un sistema de control de la temperatura también no es absolutamente necesario. El control de temperatura es crítico cuando measuring cinética de contracción, que son altamente sensibles a la temperatura, mientras que la máxima fuerza de contracción no es particularmente sensible a pequeños cambios en la temperatura y se puede medir a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que, independientemente de la temperatura en la cámara durante la prueba de fuerza, las larvas debe mantenerse a la temperatura óptima de crecimiento de 28,5 ° C 24 antes de forzar a las pruebas para la estadificación precisa. Las larvas se ponen a prueba en una solución que contiene Tyrodes tricaína. Utilizamos 0,02% (w / v) tricaína, la concentración recomendada para la anestesia 24, para eliminar las contracciones espontáneas evocadas por el sistema nervioso y por lo tanto prevenir la fatiga durante las pruebas de fuerza. Tricaína también facilita el paso para atar y reduce el tiempo total de prueba. Sin embargo, se observa que la inclusión de tricaína en la solución de prueba se reduce constantemente la fuerza máxima de contracción en un 30%. Un efecto similar se ha observado también en el músculo cola de renacuajo, donde tricaine reduce la generación de fuerza después de que se bloquea la transmisión neuromuscular, lo que sugiere que tricaína tiene un efecto directo sobre el músculo 25. Tricaína puede reducir la excitabilidad de las células musculares mediante la reducción de la conductancia de sodio a través de la membrana de la célula, como lo hace en las células nerviosas 26. Otras opciones para el bloqueo de la activación de las neuronas motoras son d-tubocurarina y α-bungarotoxina pero, a diferencia de tricaína, estos compuestos no son la piel permeable y deben ser inyectados directamente en la cabeza, la médula espinal, o del corazón 27. Investigadores individuales tendrán que evaluar si tricaína es conveniente para su aplicación específica. Si tricaína se incluye en la solución de prueba, la concentración debe ser consistente entre los experimentos y los investigadores deben verificar que el efecto de la tricaína no varía entre los grupos experimentales. Se describe este método para las larvas de tan sólo 3 dpf y tan viejo como 7 dpf. Aunque las fibras musculares parecen ser functional tan pronto como 17 horas después de la fertilización, cuando los movimientos espontáneos comienzan cola 27, la corta longitud de la cola antes de 3 dpf impide atar la larva para el equipo de prueba. Por lo general no probamos larva después de 7 dpf ya que muchos modelos de enfermedad no sobreviven mucho más tiempo esta vez. Si las pruebas larvas allá 5 dpf, las larvas deben ser alimentados. Hemos observado que las larvas sin alimentar tienen los músculos más pequeños y genera menos fuerza máxima de contracción de las larvas alimentadas, probablemente debido a la disminución de saco vitelino. Por lo tanto, puede ser deseable para probar las larvas entre 3-5 dpf, para evitar la variable adicional de alimentación externa. En resumen, se describe un método cuantitativo y fiable para medir la generación de la fuerza durante una contracción contracción máxima de los músculos del tronco larvas de pez cebra. Este método se puede utilizar para evaluar la salud general de los músculos de larvas de pez cebra y proporciona específicamente información sobre la función muscular. Además de proporcionar información acerca de lamagnitud de generación de la fuerza, esta técnica se puede utilizar para estudiar la cinética de generación de la fuerza o ser adaptado para estudiar la fatiga muscular 22. Aunque se describe esta técnica para su uso con larvas de tipo salvaje, este método se puede utilizar para las larvas modificado genéticamente o para larvas tratadas con los medicamentos o las sustancias tóxicas, para caracterizar modelos de enfermedades musculares y evaluar los tratamientos, o para estudiar el desarrollo muscular, lesión muscular, o muscular relacionada con la toxicidad química.

Joven pez cebra (Danio rerio) larvas, 3-7 días después de la fertilización (dpf), se reconoce cada vez más como un organismo útil para la investigación del músculo esquelético. Las larvas jóvenes se utilizan para modelar la enfermedad del músculo humano 1-9, evaluar medicamentos y estrategias terapéuticas 10-11, estudio lesión muscular 12, entender el desarrollo muscular 13-16, e investigar muscular relacionada con la toxicidad química 17-19. Los estudios típicos en estas áreas examinar el grado en el que el músculo sano se representa anormal por manipulación genética o la exposición a sustancias tóxicas, y algunos estudios examinan el grado en el cual el músculo anormal responde al tratamiento. Crítico para el éxito de estos estudios es la capacidad para evaluar con precisión la salud del músculo. Mientras que hay una variedad de métodos disponibles para evaluar la salud del músculo en larvas de pez cebra, pocos proporcionan información directa sobre la función muscular. Salud muscular generalmente es evaluada por appearance, según la evaluación de la tinción histológica 6,8,11, inmunotinción 9,15,16,18, microscopio óptico 3,13, microscopía electrónica 3,4,14,16 o birrefringencia 7,9,11, pero estas técnicas proporcionan información morfológica solamente. Tronco y desplazamientos cola y velocidad de nado 4,17 evaluar la función motora, pero éstas no son medidas directas de la función muscular, ya que también reflejan la entrada de los nervios, el metabolismo energético, y otros procesos. En contraste, la medición de generación de la fuerza durante la contracción proporciona una evaluación directa de la función muscular y representa una medida de la salud del músculo general. Los beneficios adicionales de este enfoque incluyen el análisis de datos sencilla y los resultados cuantitativos. En este artículo de vídeo, se proporciona un procedimiento detallado para medir la generación de fuerza por parte de los músculos de las larvas, con la esperanza de que más investigadores utilizarán este método para complementar las medidas existentes de salud del músculo en sus investigaciones. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; El objetivo general de este método es medir la generación de fuerza durante la contracción de los músculos del tronco larvas de pez cebra. Para lograr este objetivo, una larva de pez cebra se anestesia y se colocaron en una cámara llena con una solución de sal. El extremo anterior de la larva está ligado a un transductor de fuerza y ​​el extremo posterior de la larva está ligado a un controlador de longitud. La activación del músculo se logra por la estimulación de campo eléctrico, y la corriente de estimulación y la longitud de la larva se ajusta para producir la máxima fuerza de contracción. Una contracción contracción isométrica y se provoca la respuesta de la fuerza se registra para el análisis. Para que quede claro, esta técnica no mide las fuerzas generadas por los músculos de larvas durante la natación. Debido a que ambos extremos de la larva se atan a los equipos y porque la larva permanece anestesiado, que no pueden iniciar el movimiento durante la prueba. Por otra parte, la estimulación de campo se activa todas las fibras musculares al mismo tiempo para inducir una BILcontracción ateral, que no es lo que naturalmente se produce 20. Por lo tanto, en lugar de medir las fuerzas reales generados durante la natación, esta técnica determina la capacidad de generación de la fuerza de los músculos de las larvas. Hemos usado esta técnica para demostrar la debilidad muscular en un modelo de pez cebra de nemalínica miopatía 21, así como para evaluar el efecto del tratamiento antioxidante sobre la función muscular en un modelo de pez cebra de la enfermedad de múltiples MiniCore 22. Otros han utilizado una técnica similar 23 para examinar los efectos de un contaminante del medio ambiente sobre la función muscular 19.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;REACTIVOS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Polvo de tricaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monobásico de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Sal disódica de ácido etilendiaminotetraacético dihidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;EQUIPO&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sutura no estéril</td><td>Ashaway Line Twine</td><td>S30002</td><td>Nailon monofilamento USP 10/0 (3 hilos)</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Dumont n.º 5</td></tr><tr><td>Tijeras de resorte</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td>Vannas</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ8</td><td>Iluminado con fuente de luz Fostec EKE ACE I</td></tr><tr><td>Transductor de fuerza</td><td><a href="http://www.aurorascientific.com/product/series-400/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aurora Scientific</a></td><td>400A</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de longitud</td><td><a href="http://www.aurorascientific.com/product/mp-length-controllers/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aurora Scientific</a></td><td>318B</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivos de posicionamiento XYZ</td><td>Parker Hannifin</td><td>3936M</td><td></td></tr><tr><td>Termómetro</td><td>Physitemp</td><td>BAT-12</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta desechable de transferencia</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9AM</td><td>Cortar el extremo para ensanchar la abertura y facilitar la transferencia de larvas</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-11YZ</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8B</td><td>Cortar el extremo (y pulir con llama) para ensanchar la abertura y facilitar la transferencia de larvas</td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>Axiovert 100</td><td></td></tr><tr><td>Circulador de baño de agua</td><td>Neslab Instruments</td><td>RTE-111</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Alpha Omega Instruments</td><td>Series 800</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador</td><td><a href="http://www.aurorascientific.com/product/mp-model-701/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aurora Scientific</a></td><td>701C</td><td>Alta potencia, seguir estimulador</td></tr><tr><td>Sistema de video para longitud de sarcómero</td><td><a href="http://www.aurorascientific.com/product/mp-model-901/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aurora Scientific</a></td><td>900B-5A</td><td></td></tr><tr><td>Software LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osciloscopio</td><td>Nicolet Technologies</td><td>ACCURA 100</td><td></td></tr><tr><td>Microcuchilla</td><td>Fine Science Tools</td><td>10050-00</td><td></td></tr><tr><td>Soporte para microcuchilla</td><td>Fine Science Tools</td><td>10053-13</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis de datos (Signo)</td><td>Alameda Applied Sciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

medición de fuerza durante la contracción para evaluar la función muscular en larvas de pez cebra

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Larvas de pez cebra proporcionar modelos de desarrollo muscular, enfermedades musculares y los músculos relacionados con la toxicidad química, pero los estudios relacionados a menudo carecen de las medidas funcionales de la salud muscular. En este artículo de vídeo, se demuestra un método para medir la generación de la fuerza durante la contracción de los músculos del tronco larvas de pez cebra. Mediciones de la fuerza se llevan a cabo mediante la colocación de una larva anestesiados en una cámara llena con una solución de sal. El extremo anterior de la larva está ligado a un transductor de fuerza y ​​el extremo posterior de la larva está ligado a un controlador de longitud. Una contracción contracción isométrica se provoca por la estimulación de campo eléctrico y la fuerza de respuesta se registra para el análisis. Generación de la fuerza durante la contracción proporciona una medida de la salud muscular general y establece específicamente una medida de la función muscular. Aunque se describe esta técnica para su uso con larvas de tipo salvaje, este método se puede utilizar con larvas modificado genéticamente o con larvas tratadas con los medicamentos o las sustancias tóxicas,para caracterizar modelos de enfermedades musculares y evaluar tratamientos, o para estudiar el desarrollo muscular, lesión o toxicidad química.

En las larvas de pez cebra de tipo silvestre sano, las fibras musculares deben estar paralelos el uno al otro sin grandes espacios entre ellos y tienen estrías evidentes (Figura 5A). Larvas de pez cebra de tipo salvaje que no presentan estas características, o con daños evidentes, tales como fibras separadas (Figura 5B), debe desecharse. Un gráfico representativo de la fuerza de contracción pico frente a la corriente para una sola larva de pez cebra estimulación se muestra en la Figura 6. Para las larvas de pez cebra de tipo salvaje entre 3-7 dpf, la corriente de estimulación óptima es normalmente entre 400-600 mA, con 3 larvas dpf generalmente requiere una mayor corriente de larvas dpf 6-7 estimulación. Los datos de la fuerza primas (recogidas durante el paso 5.8) tiene que ser procesados ​​y analizados con el software de análisis de datos. En primer lugar, la línea de base del registro de la fuerza se establece en cero. En segundo lugar, la salida de tensión del transductor de fuerza se convierte a la fuerza (mN) (ver las instrucciones del fabricante para generar una curva de calibración para el transductor de fuerza). Una respuesta de fuerza representativa recogida durante una contracción contracción máxima de una sola larva se muestra en la Figura 7. Software de análisis de datos se puede utilizar para medir el pico de fuerza y ​​otras características de la respuesta de la fuerza. Un conjunto representativo de datos de la fuerza pico de las contracciones de contracción máxima se muestra en la Figura 8A. Valores de la fuerza de contracción máximas típicas de 3-7 variedad de tipo salvaje larvas dpf 0,9 a 1,7 mN, con larvas mayores generar más fuerza que las larvas jóvenes. Las diferencias en la fuerza de contracción pico puede ser debido a los procesos normales como el crecimiento y el desarrollo (Figura 8) o procesos anormales, tales como mutación del gen relacionado con la patología 21,22. La normalización por área de sección transversal del músculo (CSA) se puede utilizar para determinar el grado en que las diferencias en la fuerza de contracción máxima son simplemente debido a diferir<html> rencias en tamaño de la musculatura 21,22. CSA muscular puede ser estimada mediante la fórmula: CSA = π (A / 2) (B / 2), donde A es la altura de la musculatura como se ve desde el lado, B es la anchura de la musculatura como se ve desde la parte inferior, y se asume una sección transversal elíptica. Los valores típicos para CSA 3-7 rango larvas dpf de tipo salvaje 0,027 a 0,034 mm 2, con larvas dpf generalmente 3-4 muestra los valores CSA menores de larvas dpf 5-7. Un conjunto representativo de datos de la fuerza de pico normalizadas de contracciones máximas de contracción se muestra en la Figura 8B. Los valores típicos normalizados pico de contracción de fuerza para 3-7 rango de tipo salvaje larvas dpf 34-51 mN / mm 2, con 4-7 larvas dpf general muestra valores superiores a 3 larvas dpf. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig1.jpg" /> Figura 1. Lazo de sutura. Flechas apuntan a las colas de bucle de sutura. ve_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="La figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig2.jpg" /> Figura 2. (A) un aparato de pruebas con componentes etiquetados. (B) vistas Close-up de la cámara experimental. (A) de la cámara experimental con fondo transparente. (B) transductor de fuerza. (D) dispositivos de posicionamiento XYZ (c) regulador de duración.. La X, Y, y Z se definen en la esquina superior derecha. (E) Sistema de control de temperatura que utiliza módulos termoeléctricos. Tubería acomoda el flujo de agua para la refrigeración de los módulos termoeléctricos. (F) de tubo de acero inoxidable unido a la fuerza transductor. (G) de tubo de acero inoxidable conectado al controlador longitud. (H) microsonda Termómetro (i). Platino electrodos de placas paralelas, que abarca la longitud de lacámara. Placas de platino son de 2,5 mm de alto y 0.255 mm de espesor. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig3.jpg" /> Figura 3. Atar larva dentro de la cámara experimental. (A) Larva ató al extremo anterior, pero aún no están girados 90 °. (B) Larva después girado 90 º. (C) Larva atado en al extremo posterior, pero aún no giró. (D) Larva después girados y sutura colas bucle se recortan. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig4.jpg" /> La Figura 4. Medidas para la estimación de área de sección transversal. Musculatura visto desde la (A) y lateral (B) </strong&gt; fondo. La colocación de las barras rojas indican la localización de la abertura urogenital. La longitud de las barras rojas indican la altura y la anchura de la musculatura, visto desde el lateral e inferior, respectivamente. <img alt="La figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig5.jpg" /> Figura 5. Vista lateral de larvas de pez cebra musculatura del tronco. (A) el tejido sano. (B) tejido con daño evidente. Las contracturas resultantes de destacamentos de fibra están marcados con asteriscos. <img alt="La figura 6" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig6.jpg" /> La Figura 6. Gráfico representativo de la fuerza de contracción máxima frente a la estimulación actual. La corriente de estimulación óptima es de 500 mA. Figura 7. Record vigente Representante de una sola contracción contracción. Esta contracción se obtuvo con un pulso de estímulo a 0 ms. La fuerza máxima es 1,56 mN. <img alt="Figura 8" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig8.jpg" /> Figura 8. Datos de la fuerza representativos 3-7 larvas dpf. (A) datos sobre la fuerza de las contracciones máximas de contracción máxima. (B) datos sobre la fuerza de las contracciones máximas de contracción máxima normalizaron a CSA. Las larvas más viejas (6-7 dpf) fueron alimentados Hatchfry Encapsulon Grado 0 con Spirulina (Argent Laboratories) a partir del 5 dpf. Medios + desviaciones estándar se informó con N = 5 en cada grupo. Grupos significativamente diferentes de 3 larvas dpf (*) y 4 larvas dpf (#) se indican (ANOVA, P &lt;0,05). El aumento significativo en la fuerza normalizada entre 3 y 4 dpf (B) indica un aumento en la capacidad de generación de la fuerza intrínseca durante este período de tiempo, mientras que el aumento de la fuerza entre 4 y 6-7 dpf (A) se atribuye a un crecimiento basado en ningún cambiar del 4 al 7 dpf en la fuerza normalizada.

Mediciones de fuerza se pueden utilizar para demostrar los cambios en la función muscular debido al desarrollo, lesión, enfermedad, tratamiento o toxicidad química. En este vídeo, se demuestra un método para medir la fuerza durante una contracción máxima de los músculos del tronco larvas de pez cebra.

Medición de fuerza durante la contracción para evaluar la función muscular en larvas de pez cebra

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

El objetivo general de este procedimiento es medir la generación de fuerza durante una contracción máxima del músculo del tronco de larvas de pez cebra. Esto se logra primero mediante la elaboración de lazos de sutura que se utilizarán para mantener a las larvas en su lugar durante las mediciones de fuerza. A continuación, la larva anestesiada se coloca dentro de la cámara experimental.Una vez en su lugar, se registra la fuerza durante una contracción máxima de espasmo. El paso final consiste en medir las dimensiones de la musculatura del tronco para que la fuerza máxima pueda normalizarse respecto al área transversal del músculo. En última instancia, la medición de la generación de fuerza durante la contracción se utiliza para mostrar los cambios en la función muscular y en la salud muscular general.Aunque demostramos este método utilizando larvas de pez cebra de tipo salvaje, también puede usarse con larvas modificadas genéticamente o con larvas tratadas con fármacos o tóxicos. Luego, el método puede utilizarse para caracterizar modelos de enfermedades musculares y evaluar tratamientos, o para estudiar el desarrollo muscular, lesiones o toxicidad química. El primer paso consiste en preparar los lazos de sutura que se utilizarán para mantener a las larvas en su lugar.Durante la prueba de fuerza, utilice pinzas para separar el hilo no estéril en tres hebras. Una vez separado, comience a hacer un nudo de encapillado doble en una de las hebras, pero deténgase antes de apretar completamente el nudo para formar un pequeño lazo. En lugar de finalizar el lazo, use tijeras para cortar el exceso de hilo de los cabos.Coloque el lazo en el lado adhesivo de una nota adhesiva para usarlo posteriormente. Prepare dos lazos de sutura para cada larva que se vaya a probar. Primero, coloque el aparato de prueba sobre la platina de un microscopio estereoscópico.A continuación, conecte los cables del transductor de fuerza y del controlador de longitud al aparato de prueba. Encienda el transductor de fuerza y el controlador de longitud, y active el interruptor en la parte frontal del controlador de longitud. Esto hace que el tubo del controlador de longitud quede conectado mediante una pipeta de transferencia desechable.Llene la cámara experimental con la solución de prueba. Utilice pinzas para tomar un bucle de sutura por uno de los extremos como punto de sujeción. El bucle en la parte curva puede doblar la sutura y provocar que se rompa durante los pasos siguientes.Cuelgue un lazo en el tubo del transductor de fuerza y otro en el controlador de longitud. Con una pipeta desechable, transfiera una larva de pez cebra a un pequeño plato de Petri lleno con la solución de prueba. Una vez que el anestésico haya hecho efecto, empuje suavemente la cola para verificar la ausencia de nado inducido por el tacto. A continuación, utilice una pipeta de vidrio para transferir la larva al compartimento experimental con pinzas.Guíe suavemente la porción anterior de la larva a través del lazo de sutura en el tubo del transductor de fuerza, sujetando ambos extremos del lazo de sutura. Tírelos simultáneamente para ajustar el lazo posterior al saco de roble o a la vejiga natatoria con pinzas. Sostenga un extremo de la sutura y tire, haciendo que la larva gire 90 grados alrededor del tubo hasta que el lado lateral de la larva quede orientado hacia arriba.Utilizando el dispositivo de posicionamiento X, Y, Z conectado al controlador de longitud, mueva el tubo del controlador de longitud a lo largo del eje x y debajo del tronco y la cola de las larvas. Deje un espacio entre los extremos del tubo del controlador de longitud y el tubo del transductor de fuerza. A continuación, guíe el lazo de sutura sobre la cola de las larvas y apriete el lazo de sutura.Como se demostró previamente, es posible que necesite girar la parte posterior de las larvas para que el lado lateral quede orientado hacia arriba. Una vez en posición, corte los extremos del lazo de sutura. Utilice los dispositivos de posicionamiento XY y Z para bajar lentamente los tubos hasta que apenas toquen el fondo de la cámara.Luego eleve las larvas a una distancia adecuada desde la base de la cámara. Esta distancia debe estar dentro del rango de trabajo del objetivo del microscopio invertido que se utilizará posteriormente. Finalmente, ajuste el tubo del controlador de longitud para alinear el eje largo de la larva con el eje largo del tubo del transductor de fuerza.Para comenzar, mueva el aparato de prueba a la platina de un microscopio invertido. A continuación, conecte el termómetro del circulador del baño de agua y el controlador de temperatura al aparato de prueba. Encienda los componentes necesarios y ajuste la configuración del controlador de temperatura al valor deseado.Conecte los cables del estimulador al aparato de prueba. Encienda la energía del estimulador, pero no estimule las larvas en este momento. Para verificar que la larva esté paralela al fondo de la cámara, observe la porción de la larva entre los extremos de los tubos.Si el larva está paralelo, ambos extremos estarán enfocados si es necesario. Ajuste el tubo del transductor de fuerza hasta que ambos extremos estén enfocados y el larva esté paralelo. Encienda el sistema de video de longitud del sarcómero y gire la cámara de video de manera que las estrías queden paralelas a los lados del encuadre del video.La distancia entre las estrías se utiliza como indicador de la longitud del sarcómero. Ajuste el microscopio para enfocar las fibras periféricas y observe la longitud del sarcómero indicada. Si es necesario, ajuste el controlador de longitud para acortar las larvas hasta que la longitud del sarcómero sea inferior a la óptima para optimizar la fuerza de contracción.Primero, ajuste la corriente de salida del estimulador a una magnitud baja y luego programe un software especializado para entregar pulsos de corriente de 0,2 milisegundos de duración. Aplique el primer pulso y utilice el osciloscopio para medir la fuerza máxima del espasmo.Aumente la corriente en incrementos de 50 miliamperios y mida la fuerza máxima del espasmo muscular en cada nuevo nivel de corriente. Espere 30 segundos entre espasmos para prevenir la fatiga a medida que aumenta la corriente de estimulación. La fuerza máxima del espasmo muscular generalmente aumenta hasta un valor máximo y luego disminuye gradualmente a medida que aumenta la corriente con la que genera la larva.La mayor fuerza es la corriente de estimulación óptima una vez identificada; ajuste la amplitud de la corriente a la corriente de estimulación óptima y regule la longitud de las larvas para provocar la fuerza máxima de contracción. Finalmente, provoque una contracción de los músculos de la larva. Utilice el osciloscopio para registrar la respuesta de fuerza y guarde el registro para su posterior análisis.Para medir las dimensiones de la musculatura, mueva el aparato de prueba de regreso al microscopio estereoscópico. Utilizando la escala IP, mida la altura de la musculatura tal como se observa desde el lateral. Realice las mediciones en un punto de referencia anatómico.Por ejemplo, la abertura urogenital marcada aquí en rojo. Luego, teniendo cuidado de no cambiar la longitud de las larvas. Gire las larvas 90 grados utilizando los extremos de la lazada de sutura para observarlas desde la parte inferior.Mida el ancho de la musculatura tal como se observa desde la parte inferior. Finalmente, corte los lazos de sutura con una microhoja para liberar las larvas del equipo de prueba. En larvas de pez cebra de tipo salvaje sanas, las fibras musculares deben ser paralelas entre sí sin grandes espacios entre ellas y deben presentar estriaciones evidentes. Las larvas de pez cebra de tipo salvaje que no exhiban estas características o que presenten daños evidentes, como fibras desprendidas como se observa aquí, deben descartarse. Se representa gráficamente la fuerza máxima de contracción tetánica frente a la corriente de estimulación para una sola larva de pez cebra.La corriente de estimulación óptima suele estar entre 400 y 600 miliamperios. Aquí se muestra una respuesta de fuerza representativa registrada durante una contracción de espasmo máximo de una larva individual. Los valores máximos de fuerza de larvas de tipo silvestre de diferentes edades varían entre 0,9 y 1,7.Mili newtons, con larvas mayores generando más fuerza que larvas más jóvenes. Las larvas mayores generan más fuerza que las larvas más jóvenes incluso después de normalizar las fuerzas máximas respecto al área transversal del músculo. Al realizar este procedimiento, es importante ajustar lo suficiente los lazos de sutura para que las larvas no puedan girar fácilmente alrededor de los tubos del transductor de fuerza y del controlador de longitud.Si los bucles de sutura están demasiado sueltos, la fuerza generada por la larva no se transmitirá completamente al transductor de fuerza y la fuerza máxima de contracción será subestimada.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El método que aquí se presenta incluye el daño exacto de embriones de pez cebra en vivo con pulsos láser de alta energía y el posterior análisis de estas lesiones y su recuperación con el tiempo. También mostramos cómo genéticamente etiquetado individual o grupos de células del músculo esquelético se puede seguir durante y después de la luz láser daño inducido.

Laser-infligido lesiones de músculo esquelético embrionario de pez cebra

El pez cebra es un sistema emergente para modelar enfermedades humanas del músculo esquelético. Se describe un método rápido y eficaz para aislar las miofibrillas del músculo esquelético de pez cebra embrionario y larval. Este método proporciona una preparación de alta densidad miofibra adecuada para el estudio de la morfología sola fibra muscular esquelética, localización subcelular de proteínas, y la fisiología muscular.

Análisis de embriones y larvas de pez cebra esqueléticas miofibras de Preparativos disociadas

El pez cebra es ahora una herramienta establecida y poderosa para modelar distrofias musculares, miopatías congénitas y enfermedades neuromusculares relacionadas. La birrefringencia y el comportamiento de escape evocado por el tacto son dos ensayos no invasivos comunes que se utilizan para determinar el grado de desorganización muscular y deterioro locomotor de los embriones de pez cebra durante el desarrollo temprano.

Análisis de defectos del músculo esquelético en larvas de pez cebra mediante ensayos de birrefringencia y respuesta de escape de evocación táctil

En este estudio, describimos un método sencillo para realizar el análisis de Evans Blue Dye (EBD) en larvas de pez cebra.  Esta técnica es una herramienta poderosa para la caracterización de la integridad del músculo esquelético y la delineación de modelos de distrofia muscular de pez cebra, y es un método valioso para el desarrollo de nuevas terapias.

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

peces cebra son un excelente modelo para estudiar la función muscular y las enfermedades. Durante la embriogénesis temprana, el pez cebra comienza a realizar contracciones musculares regulares produciendo un comportamiento rítmico de natación, que se altera cuando el músculo se interrumpe. Aquí describimos una respuesta evocada por el tacto y un ensayo de locomoción para examinar el rendimiento de la natación como una medida de la función muscular.

Usando respuesta evocada-Touch y la locomoción ensayos para evaluar el rendimiento muscular y la función en el pez cebra

El análisis de elementos finitos es una herramienta de uso frecuente para investigar el rendimiento mecánico de estructuras bajo carga. Aquí aplicamos su uso para modelar la biomecánica de la mandíbula del pez cebra.

La construcción de modelos de elementos finitos para investigar pez cebra mandíbula Biomecánica

La regeneración del músculo esquelético es impulsada por las células madre musculares residentes en el tejido, que se ven afectadas en muchas enfermedades musculares, como la distrofia muscular, y esto resulta en la incapacidad del músculo para regenerarse. Aquí, describimos un protocolo que permite el examen de la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular.

Examinando la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular

La claridad óptica es una gran ventaja para el trabajo biológico y fisiológico celular en el pez cebra. Se describen métodos robustos para medir el crecimiento celular en animales individuales que permiten nuevos conocimientos sobre cómo el crecimiento del músculo esquelético y los tejidos vecinos se integran con el crecimiento de todo el cuerpo.

Medición repetida y en tiempo real del crecimiento del músculo esquelético en peces cebra vivos individuales sometidos a actividad eléctrica alterada

Este protocolo utiliza imágenes de láminas de luz para investigar la función contráctil cardíaca en larvas de pez cebra y obtener información sobre la mecánica cardíaca a través del seguimiento celular y el análisis interactivo.

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En este artículo de vídeo, se describe un nuevo método que permite la construcción de los gradientes de olor con geometrías estable y controlable. Nos muestra brevemente cómo estos gradientes se pueden utilizar para la detección de defectos olfativos (anosmia total y parcial) y el estudio de las características más sutiles de comportamiento quimiotaxis.

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Aprende a medir la fuerza de contracción muscular en larvas de Danio rerio para evaluar la función y salud muscular. Este protocolo permite estudiar respuestas a fármacos y toxicantes en modelos de enfermedad.

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