Generación de subcutánea e intrahepática hepatocelular carcinoma humano xenoinjertos en ratones inmunodeficientes

El objetivo general de este procedimiento es generar carcinoma hepatocelular humano subcutáneo o int hepático o xenoinjertos de HCC en ratones inmunodeficientes. Esto se logra preparando primero fragmentos tumorales o una suspensión de una sola célula de una muestra fresca de CHC humano para su implantación en los ratones para xenoinjertos subcutáneos. El siguiente paso es inyectar células tumorales o implantar fragmentos tumorales en una bolsa dorsal subcutánea para xenoinjertos intrahepáticos.

El siguiente paso es inyectar células tumorales en el bazo o el hígado, o implantar fragmentos tumorales directamente en el hígado en el paso final. Los animales se observan durante varias semanas hasta que se desarrollan tumores. En última instancia, los xenoinjertos de HCC humano se pueden utilizar para estudiar muchos aspectos de la biología tumoral, incluidos los mecanismos de la génesis tumoral y las respuestas a las nuevas terapias.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el uso de líneas celulares o xenoinjertos subcutáneos solamente, es que con esta técnica, las muestras primarias de cáncer de hígado humano y los xenoinjertos intrahepáticos derivados del paciente proporcionan un modelo biológico más realista del carcinoma hepatocelular humano. Sharif Ahmed, un científico investigador postdoctoral de mi laboratorio para la implantación subcutánea de los fragmentos tumorales, demostrará el procedimiento. Primero coloque el ratón anestesiado en posición prona, manteniendo la dosis inhalatoria de anestesia con flúor con una boquilla.

Aplique gel lacrimógeno para proteger los ojos del animal de lesiones traumáticas y luego esterilice el área dorsal afeitada con exfoliante quirúrgico Betadine, seguido de etanol al 70% y, por último, con una solución de yodo povidona. A continuación, use unas tijeras afiladas para hacer una incisión de cinco milímetros en la piel. Inserte la punta de un par de tijeras romas cerradas en el espacio subcutáneo y luego abra suavemente las tijeras para desarrollar un bolsillo lo suficientemente grande como para acomodar un fragmento de tumor.

Luego, use un par de pinzas finas para insertar el fragmento de tumor en la bolsa subcutánea usando clips para cerrar la incisión después de que el fragmento se haya colocado justo antes de la inyección. A continuación, inserte la aguja en el espacio subcutáneo de un animal anestesiado y afeitado, avanzando la aguja varios milímetros a lo largo del plano subcutáneo lejos del lugar de la punción y descargue el contenido de la jeringa para preparar al animal para el injerto con tejido tumoral humano. Comience administrando por vía subcutánea 350 microlitros de solución salina normal estéril con una aguja de calibre 27 por media pulgada en una jeringa de un mililitro en el dorso del cuello de un animal anestesiado para compensar preventivamente cualquier pérdida de líquido intraoperatorio.

Luego, después de anestesiar al ratón supino en una almohadilla precalentada, extienda las extremidades del animal y asegúrelas con cinta adhesiva a la superficie de operación para optimizar la exposición del abdomen ventral y el tórax. Coloque una lámpara de aumento sobre el animal y luego esterilice la piel afeitada en el abdomen ventral y el tórax como se acaba de demostrar. Con unas tijeras afiladas, haga una incisión bilateral transversal en la piel subcostal y luego divida las capas musculares para exponer todo el hígado.

Coloque una sutura en la piel por encima de la apófisis xifoides y asegúrela a la boquilla con cinta adhesiva para permitir una mejor exposición del hígado y las estructuras circundantes. A continuación, estabilice el hígado con dos aplicadores con punta de algodón adyacentes y posteriores al tejido. A continuación, utilice unas tijeras afiladas para dividir el ligamento falciforme unido al lóbulo mediano del hígado.

Movilice el lóbulo izquierdo del hígado con un aplicador de punta de algodón y coloque un bonito nudo suelto de cinco suturas de seda alrededor del lóbulo. Avance el nudo lo más cerca posible hacia el bipedículo del lóbulo izquierdo y luego apriételo. A continuación, utilice unas tijeras para extirpar el lóbulo distal a la ligadura, dejando un pequeño muñón para evitar el deslizamiento del nudo y la posterior hemorragia.

Usando una técnica similar, ligar y resecar la mayor parte del lóbulo mediano del hígado, y luego usar surgicel y una presión suave con un aplicador con punta de algodón a lo largo de las superficies cortadas del parénquima hepático para lograr una hemostasia completa. Por último, realizar un xenoinjerto intrahepático de un fragmento tumoral o células tumorales, o un xenoinjerto intrahepático de células tumorales mediante inyección esplénica como se demuestra en las siguientes secciones. Para la implantación intrahepática de fragmentos tumorales, utilice una hoja de bisturí número 10 para hacer primero una incisión de tres milímetros de longitud y profundidad en la superficie del hígado.

Luego, aplique inmediatamente una presión suave y quirúrgica en el sitio de la incisión durante 60 a 90 segundos para lograr la hemostasia. Cuando se haya logrado la hemostasia completa, use una pinza fina para colocar un fragmento de tumor en la incisión hepática. A continuación, aplique un pequeño trozo de surgicel sobre la incisión para la implantación hepática de las células tumorales mediante una inyección directa en el hígado. Inserte una aguja de jeringa de insulina cargada con suspensión de células tumorales en el hígado expuesto y avance la punta unos milímetros más allá del sitio de punción a lo largo del plano subcapsular.

Descargue suavemente el contenido de la jeringa y retire la aguja del hígado. A continuación, coloque surgicel sobre el lugar de la punción y aplique una presión suave con un aplicador con punta de algodón para evitar la fuga de la suspensión de células tumorales y lograr una hemostasia completa para el xenoinjerto intrahepático de células tumorales mediante inyección en el bazo. Coloque a los ratones en la posición de decúbito lateral derecho y use tijeras afiladas para hacer una incisión subcostal izquierda de un centímetro para ingresar a la cavidad peritoneal.

A continuación, utilice un aplicador con punta de algodón para reflejar el crujido del estómago en el lado derecho del animal. Con el fin de exponer el bazo manipulando los tejidos adiposos circundantes con pinzas finas y traumáticas, introduzca el bazo en la incisión y coloque un duplicador de punta de algodón detrás del bazo para estabilizar el tejido. Ahora use una sutura de seda de cinco ohs para colocar un nudo de pretti suelto alrededor del bazo por encima del polo inferior.

Inserte una aguja de jeringa de insulina cargada con suspensión de células tumorales en el polo inferior del bazo y hágala avanzar más allá del nivel del nudo suelto. A continuación, descargue lentamente el contenido de la jeringa, retire la aguja del bazo y apriete el nudo para evitar cualquier fuga de la suspensión celular inyectada. Finalmente, reemplace el bazo en la cavidad peritoneal.

En esta imagen, se muestra una muestra de resección hepática de un paciente con CHC que no había recibido ninguna terapia adyuvante para el tumor. El recuadro blanco indica una porción viable del tumor cerca de la periferia que se obtuvo para el xenoinjerto. El desarrollo y crecimiento de los xenoinjertos subcutáneos se puede controlar fácilmente mediante el examen diario de los ratones receptores.

Por ejemplo, se muestra el aspecto típico de un xenoinjerto subcutáneo de CHC humano, que es visualmente distinto de los tejidos circundantes, y el aspecto histopatológico correspondiente del tumor. La histología del tumor muestra las características típicas del CHC, como células similares a los hepatocitos con AIA nuclear y una relación citoplasmática dec nuclear alta, ausencia de huellas portales y trabéculas distorsionadas con aumento del grosor de las placas hepatocelulares. En estas imágenes, se muestran las apariencias típicas de un xenoinjerto de CHC humano intrahepático logrado a partir de la implantación directa de tejido tumoral en el hígado, así como el logrado a partir de la inyección de células tumorales en el bazo con los tumores intraparenquimatosos indicados por la flecha negra en cada imagen.

Esta sección histológica a través del margen de un injerto de xog intrahepático muestra las características típicas del CHC humano y el hígado de ratón adyacente al normal. La tabla resume las tasas de injerto tumoral alcanzadas después de la implantación de tejidos de carcinoma hepatocelular humano primario en ratones inmunodeficientes. Utilizando las diferentes técnicas que se acaban de demostrar para cada método de implantación, el denominador de la tasa de extracción del tumor refleja una muestra única de CHC humano.

Estos datos demuestran que, en el caso de los tejidos primarios de CHC humano, las tasas de injerto subcutáneo son inferiores a las tasas de injerto intrahepático logrado mediante inyección de células tumorales intraesplénicas o implantación de fragmentos tumorales intrahepáticos, y que la hepatectomía parcial parece mejorar el injerto intrahepático. Al intentar este procedimiento, es importante recordar utilizar una técnica estéril y lograr una hemostasia completa, ya que los ratones inmunocomprometidos pequeños de seis a ocho semanas de edad son susceptibles a las infecciones y es posible que no sobrevivan ni siquiera a una pequeña cantidad de sangrado postoperatorio.