Name: Generación de subcutánea e intrahepática hepatocelular carcinoma humano xenoinjertos en ratones inmunodeficientes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-25T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Aprenda a generar xenoinjertos de carcinoma hepatocelular humano en ratones inmunodeficientes mediante implantación subcutánea e intrahepática. Este modelo permite estudiar la biología tumoral y evaluar respuestas terapéuticas en investigación oncológica.

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Esta labor fue apoyada por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud de la Fase 1 premio Clínico Scientist (AG) de y una subvención de funcionamiento de la Sociedad de Investigación del Cáncer (AG). Los autores agradecen al Dr. John Dick por su apoyo a este proyecto.

Una visión general esquemática del protocolo se presenta en la Figura 1. 1. El procesamiento de las muestras de HCC humano Obtener muestras de HCC humano primarias con el consentimiento del paciente por escrito y con la aprobación del comité de ética de investigación institucional. Estos protocolos se han realizado en nuestra institución con la aprobación de la Junta de Ética de Investigación de la Red de Salud de la Universidad en el cumplimiento de todas las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano. Obtener muestras de HCC frescos tan pronto como sea posible después del procedimiento quirúrgico muestras una vez apropiadas han sido tomadas para fines clínicos. Idealmente, esto debería tener lugar dentro de 30 min después de la eliminación del tejido del paciente. Como se ilustra en la Figura 2, una muestra de al menos 1 cm 3 obtenida a partir de la periferia del tumor es óptima, como la parte central del tumor puede ser necrótico.Los tumores que no han recibido ningún tratamiento antes de la resección, tales como radiación, quimioterapia o ablación se prefieren a fin de maximizar la probabilidad de que las células tumorales son viables. Mango tejidos humanos primarios de conformidad con los protocolos de protección personal estándar para materiales biológicamente peligrosos. Realice todas las manipulaciones de laboratorio de los tejidos tumorales y preparaciones de células en un gabinete de bioseguridad clase II usando técnicas asépticas. <ol><li> Coloque la muestra HCC fresca en 10-25 ml F12 Modificado Medio Eagle / Ham &#39;s de Dulbecco libre de suero a 4 ° C y transferir en hielo al laboratorio para su procesamiento inmediato y la preparación de fragmentos y / o células de tejido de xenoinjerto en ratones. </li><li> Usando una pinza estéril, coloque la muestra de tumor en un 100 mm x 20 mm placa de Petri u otra superficie de trabajo estéril adecuado. Dividir la muestra de tumor en fragmentos de aproximadamente 2-3 mm 3 utilizando una hoja de bisturí quirúrgico N º 10. En este punto, considere complemento de congelación o formalina fijadoras slgunos fragmentos tumorales para otros experimentos o análisis según sea necesario. </li><li> Para los xenoinjertos de fragmentos de tumor, colocar algunos de los fragmentos de HCC en uno o más tubos de microcentrífuga que contiene suficiente Matrigel para permitir que los fragmentos permanezcan sumergidos. Mantenga estos tubos en hielo. </li><li> Para la preparación de una suspensión de células tumorales, usar la hoja de bisturí quirúrgico para picar el tejido HCC restante tanto como sea posible y mezclar con 5-10 ml de DMEM-F12 en un tubo cónico de 50 ml, dependiendo del volumen de tejido picado. </li><li> Añadir colagenasa tipo IV y dispasa II a concentraciones finales de 200 unidades / ml y 0,8 unidades / ml, respectivamente. Pipetear la mezcla de arriba y abajo, así con una pipeta 25 ml. </li><li> Sellar el tubo e incubar la mezcla de la etapa 1.6 a 37 ° C en un incubador de dióxido de carbono al 5% durante 30-60 min en función de la suavidad del tejido tumoral. Pipetear la mezcla arriba y abajo un par de veces cada 10 min para evaluar la marcha de la digestión enzimática. </li><li> Después digestion es completa, pasar la solución del tumor a través de un colador de 100 micras de células. Machacar suavemente el tejido que queda en el filtro de células usando una punta de pipeta de 25 ml para que el máximo número de células tumorales que pasar a través. Recoger la suspensión de células tensa en un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Centrifugar la suspensión de células tumorales a 1.200 rpm durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Decantar con cuidado el sobrenadante. Dependiendo del tamaño de la pastilla, añadir 2-5 ml de hielo 1x frío de glóbulos rojos (RBC) tampón de lisis y suavemente pipetee arriba y hacia abajo para volver a suspender el sedimento. Mantener en hielo durante 5 min. </li><li> Añadir DMEM-F12 hasta un volumen total de 15 ml y centrifugar a 1000 rpm durante 5 min a 4 ° C para lavar el tampón de lisis RBC. </li><li> Decantar con cuidado el sobrenadante y resuspender el botón celular tumoral RBC-libre en DMEM-F12. </li><li> Contar las células viables mediante exclusión con azul de tripano, ya sea manualmente o con un contador de células automatizado. </li><li> Alícuotas de células tumorales de centrífuga que contiene la Numbe deseadaR de las células para inyección como se describe anteriormente, resuspender el sedimento celular resultante en 30 l de Matrigel enfriado con hielo, y almacenar en hielo. </li></ol> Opcional: Después del paso 1.11, que rutinariamente agotamos + células CD45 humanos (leucocitos) de la suspensión de células tumorales a granel y / o purificar subconjuntos de células tumorales mediante citometría de flujo o perlas inmunomagnéticas. Los protocolos detallados para estas técnicas están bien descritos por los fabricantes de los anticuerpos pertinentes, perlas, y citómetros de flujo. Nota: El protocolo descrito anteriormente también se puede utilizar para procesar xenoinjertos tumorales humanos recogidas de ratones con el fin de realizar el trasplante en serie, sustituyendo el tejido de xenoinjerto para el tejido HCC humano primario en el paso 1.1. En esta situación, después de la etapa 1.11, que rutinariamente agotamos la infiltración de células murinas de la suspensión celular utilizando un anticuerpo contra el antígeno de histocompatibilidad de ratón H2K. 2.Xenoinjertos Llevar a cabo todos los procedimientos con animales en el cumplimiento de los protocolos aprobados por el comité de cuidado de los animales institucional. Los procedimientos descritos en este documento se han cumplido en un Protocolo específico la utilización de animales aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Health Network de conformidad y el cumplimiento de todos los organismos pertinentes de las normativas e institucionales, normas y directrices. Equipo para suministro de agentes anestésicos volátiles inhalatorios a los animales pequeños se debe utilizar de acuerdo con los procedimientos operativos estándar de las instalaciones de animales y el instituto de investigación. Llevar a cabo todos los procedimientos quirúrgicos complejos que requieren una técnica aséptica e instrumentos estériles en un gabinete de seguridad biológica de clase II. Utilizar los no obesos de inmunodeficiencia combinada severa diabético (NOD / SCID) o NOD / SCID / interleucina 2 cadena de nulos receptor gamma (GSN) cepas de ratones de ambos sexos en las 6-8 semanas de edad (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 9,10. Estosratones debe ser alojado y mantenido en una instalación capaz de proporcionar condiciones libres de patógenos adecuados para los animales inmunodeficientes. Preparar los ratones para la cirugía en una cámara de suministro de 5% (v / v) de inhalación de isoflurano en 1 L / min de oxígeno. Mantener la anestesia hasta que haya pérdida de la córnea y la punta reflejo en el animal (s). Para xenoinjerto subcutáneo, afeitarse una o más áreas pequeñas en el dorso del animal (s) y limpiar la piel con etanol al 70%. Para los xenoinjertos intrahepática, afeitar el tórax ventral y el abdomen del animal (s) de la axila hasta la región inguinal y limpiar la piel con etanol al 70%. 2.1 Implantación subcutánea de fragmentos de tumor <ol><li> Coloque el ratón anestesiado propensos, el mantenimiento de la anestesia por inhalación de isoflurano (2% (v / v) en 1 L / min de O 2) con una boquilla. Aplicar Tear-Gel para proteger los ojos del animal de una lesión traumática. </li><li> Esterilizar el área afeitada dorsal (s) con Betadinelavado quirúrgico seguido de etanol al 70% y finalmente con solución de povidona yodada. </li><li> Haga una incisión en la piel 5 mm usando unas tijeras afiladas estériles. </li><li> Inserte una tijera romo cerrado suavemente en el espacio subcutáneo y extender suavemente para desarrollar un bolsillo lo suficientemente grande como para dar cabida a un fragmento de tumor. </li><li> Inserte el fragmento de tumor preparada en el paso 1.3 en el bolsillo subcutáneo usando unas pinzas finas estériles. </li><li> Cierre la incisión de la piel con suturas o grapas. </li><li> Proporcionar cuidados postoperatorios para el ratón, como se describe a continuación. </li></ol> 2.2 La inyección subcutánea de células tumorales <ol><li> Preparar el animal tal como se describe en los pasos 2.1.1 y 2.1.2. </li><li> Cargar la suspensión de células tumorales en Matrigel preparados en la etapa 1.13 en una jeringa de insulina con un 29 G 1/2 en la aguja. </li><li> Insertar la aguja en el espacio subcutáneo y descargar el contenido de la jeringa. Avanzar la aguja varios milímetros a lo largo del plano subcutáneo de distancia from el sitio de la punción de la piel evita la fuga de la suspensión de células del tumor fuera de la zona de punción después de la retirada de la aguja. </li><li> Proporcionar cuidados postoperatorios para el ratón, como se describe a continuación. </li></ol> 2.3 Implantación intrahepática de fragmentos de tumor <ol><li> El uso de un 27 G 1/2 en la aguja en una jeringa de 1 ml, administrar 350 l de estéril por vía subcutánea solución salina normal en el dorso del cuello del animal anestesiado para compensar las pérdidas de líquido intraoperatorias. Para la analgesia, administrar 350 l de solución salina estéril que contiene buprenorfina normal (0,1 mg / kg) por vía subcutánea en el flanco del animal, utilizando una aguja de 27 G en 1/2-in una jeringa de 1 ml. </li><li> Coloque el ratón en posición supina sobre una almohadilla de calefacción con la nariz y la boca posicionado dentro de la boquilla para entregar el mantenimiento de anestesia por inhalación de isoflurano (2% (v / v) en 1 L / min de O 2). </li><li> Extienda las extremidades y fijarlos con cinta a la superficie de operación para optimizar la exposición deel abdomen y el tórax ventral. </li><li> Lleve a cabo el procedimiento bajo una lámpara de aumento para optimizar la visualización. </li><li> Esterilizar la piel afeitada en la parte ventral del abdomen y el tórax con lavado quirúrgico Betadine seguido de etanol al 70% y finalmente con solución de povidona yodada. </li><li> Usando unas tijeras afiladas estériles, hacer una incisión en la piel subcostal bilateral transversal y dividir las capas musculares para entrar en la cavidad peritoneal para permitir una exposición adecuada de todo el hígado. </li><li> Coloque una puntada en la piel por encima de la apófisis xifoides y fijarlo a la boquilla con cinta adhesiva a fin de permitir una mejor exposición del hígado y de las estructuras circundantes. </li><li> Utilice dos hisopos adyacentes y posterior al hígado para estabilizarlo. </li><li> Hacer una incisión de 3 mm de longitud y la profundidad en la superficie del hígado utilizando una hoja de bisturí No. 10 estéril. </li><li> Aplique inmediatamente Surgicel y leve presión sobre la zona de la incisión para lograr la hemostasia, retire después de 60-90 segundosy proceder solamente si la hemostasia completa se ha logrado. </li><li> Coloque un fragmento del tumor paso 1.3 en la incisión del hígado con unas pinzas finas estériles o con una aguja de 18 G. </li><li> Aplique una pequeña pieza de Surgicel sobre la incisión del hígado para evitar el desplazamiento del fragmento del tumor y asegurar la hemostasia continuado. </li><li> Cerrar la incisión con puntos de sutura o grapas. </li><li> Proporcionar los cuidados postoperatorios, como se describe a continuación </li></ol> 2.4 Implantación intrahepática de células tumorales a través inyección directa en el hígado <ol><li> Preparar el ratón como se describe en los Pasos 2.3.1 a 2.3.7 anteriores. </li><li> Cargar la suspensión de células tumorales (preparado en la etapa 1.13) en una jeringa de insulina usando un 29 G 1/2 en la aguja. </li><li> Con el hígado estabilizado utilizando un aplicador de punta de algodón, inserte la aguja de la jeringa de insulina en el hígado y avanzar en la punta unos milímetros más allá del sitio de la punción por un plano subcapsular. </li><li> Descargar suavemente los contenidos de la jeringa y Tgallina retire la aguja del hígado. </li><li> Lugar Surgicel sobre el sitio de la punción y aplique una presión suave con un aplicador con punta de algodón para evitar la fuga de la suspensión de células tumorales y para lograr la hemostasia completa. </li><li> Cerrar la incisión con puntos de sutura o grapas y proporcionar los cuidados postoperatorios, como se describe a continuación. </li></ol> 2.5 xenotrasplante intrahepática de células tumorales a través de la inyección en el bazo <ol><li> Preparar el ratón como se describe en los pasos 2.3.1 y 2.3.5 anteriores. </li><li> Con unas tijeras afiladas estériles, hacen un 1 cm incisión subcostal izquierda para entrar en la cavidad peritoneal. </li><li> Utilice un aplicador con punta de algodón para reflejar el estómago craneal y hacia el lado derecho del animal con el fin de exponer el bazo. </li><li> Por la manipulación de los tejidos adiposos de los alrededores con pinza atraumática finas estériles, entregar el bazo en la incisión y colocar un aplicador con punta de algodón detrás del bazo para estabilizarlo. </li><li> El uso de sutura de seda 5-0, lugarun nudo flojo pre-atado alrededor del bazo por encima del polo inferior. </li><li> Cargar la suspensión de células tumorales (preparado en la etapa 1.13) en una jeringa de insulina usando un 29 G 1/2 en la aguja. </li><li> Inserte la aguja de la jeringa de insulina en el polo inferior del bazo y avanzar más allá del nivel del nudo pre-atado flojo. </li><li> Se descargan lentamente el contenido de la jeringa, retire la aguja del bazo, y apretar el nudo para evitar cualquier fuga de la suspensión de células tumorales inyectadas. </li><li> Vuelva a colocar el bazo en la cavidad peritoneal. </li><li> Cerrar la incisión con puntos de sutura o grapas y proporcionar los cuidados postoperatorios, como se describe a continuación. </li></ol> 2.6 hepatectomía parcial para Facilitar intrahepática injerto de tejido tumoral humano <ol><li> Preparar el ratón como se describe en los pasos 2.3.1 al 2.3.7. </li><li> Con unas tijeras afiladas estériles, se divide el ligamento falciforme unido al lóbulo medio del hígado. </li><li> El uso de un aplicador con punta de algodón, movilizarel lóbulo izquierdo del hígado y la posición de un nudo flojo pre-atado de sutura de seda 5-0 alrededor del lóbulo izquierdo. Avanzar el nudo flojo tan cerca como sea posible hacia el pedículo bilio-vascular del lóbulo izquierdo y apriete el nudo. </li><li> Extirpar el lóbulo izquierdo distal a la ligadura utilizando tijeras estériles, dejando un pequeño tocón para evitar el deslizamiento del nudo y posterior hemorragia. </li><li> Usando una técnica similar, ligar y resecar la mayoría de la lóbulo medio del hígado, evitando la vesícula biliar. </li><li> Uso Surgicel y una presión suave con un aplicador con punta de algodón a lo largo de las superficies de corte en el parénquima hepático para lograr la hemostasia completa. </li><li> Para los xenoinjertos intrahepática de un fragmento de tumor o células tumorales, proceder con pasos 2.3.8 a 2.3.11 o 2.4.2 a 2.4.5 como se describe anteriormente. </li><li> Para xenoinjertos intrahepática de las células tumorales a través de la inyección esplénica, utilizar bastoncillos de algodón para reflejar suavemente el estómago craneal y hacia el lado derecho del animal, exposión del bazo. Continúe con los pasos 2.5.4 al 2.5.9 como se describió anteriormente. </li><li> Cerrar la incisión con puntos de sutura o grapas y proporcionar los cuidados postoperatorios, como se describe a continuación. </li></ol> 2.7 Cuidado Postoperatorio <ol><li> Retire el ratón desde la boquilla de anestesia inhalatoria. </li><li> Coloque el ratón en una jaula bajo una lámpara de calor durante aproximadamente 20 min hasta que se recupere de la anestesia y la movilización totalmente. </li><li> Repetir la dosis de buprenorfina cada 8-12 horas durante los primeros 2 a 3 días del postoperatorio. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Hemos descrito una variedad de técnicas para establecer subcutánea y intrahepáticos xenoinjertos de HCC humano en ratones inmunodeficientes que se pueden aplicar a una amplia variedad de preguntas experimentales y ensayos. Mientras xenoinjertos subcutáneos se han utilizado ampliamente para estudiar diversos aspectos de la biología de HCC, xenoinjertos intrahepáticos raramente se describen en la literatura. Además, la mayoría de los estudios que describen el uso de xenoinjertos han generado estos partir de líneas celular...

El carcinoma hepatocelular (CHC) es el quinto cáncer más común en todo el mundo y el más rápido aumento de la causa de muerte por cáncer en Estados Unidos. El factor de riesgo más frecuente para el CHC es la cirrosis hepática, que ocurre con mayor frecuencia debido a la hepatitis crónica viral, el uso indebido de alcohol, enfermedades autoinmunes o trastornos metabólicos hereditarios 1. A pesar de la pesada carga de enfermedades impuesta por HCC en las poblaciones de todo el mundo, la fisiopatología de la HCC es relativamente poco conocida en comparación con otros cánceres comunes como los colorrectales, de mama o cáncer de próstata. Por ejemplo, los eventos moleculares y celulares específicos tumorigénesis de conducción aún no se han definido claramente 2. Al igual que la mayoría de los otros cánceres epiteliales sólidos, los enfoques genómicos han revelado la heterogeneidad en las aberraciones asociadas con HCC 3. Un número de estudios han puesto de manifiesto la actividad desordenada de una variedad de vías de señalización implicadas en la proliferación celular, sursupervivencia, la diferenciación, y la angiogénesis 4. Además, el papel de las células madre de cáncer en el CHC patobiología Queda por aclarar 5. Con una comprensión limitada de HCC fisiopatología, el arsenal de terapias efectivas para el CHC también ha permanecido relativamente limitada. Pacientes en etapa temprana con tumores confinados al hígado son candidatos para tratamiento curativo mediante la ablación del tumor o la resección quirúrgica, aunque la recurrencia es común. Para los pacientes con enfermedad más avanzada, la quimioterapia y la radiación son de eficacia limitada, y se utilizan principalmente para el control de la enfermedad con intención paliativa 6. Alta calidad en modelos experimentales in vivo de HCC humano por lo tanto proporciona una valiosa plataforma para la investigación básica tan necesaria en la fisiopatología de HCC humano, así como para la evaluación de nuevos enfoques terapéuticos. En comparación con el uso de líneas celulares o modelos de ratón altamente definidos, xenoinjertos de PRImary tumores humanos en ratones inmunodeficientes han surgido como herramientas valiosas para tales estudios ya que son capaces de recapitular la enfermedad humana con alta fidelidad, mientras que también la captura de la heterogeneidad que está presente dentro y entre diferentes pacientes 7,8. Para este fin, hemos desarrollado una variedad de métodos para establecer xenoinjertos de HCC humanos en ratones inmunodeficientes. Mientras que la mayoría de los estudios publicados que implican xenoinjertos de HCC describen el uso de líneas celulares de HCC humano bien establecidos para este propósito, nos hemos centrado en la optimización de nuestros ensayos para generar los xenoinjertos a partir de muestras de HCC primarios obtenidos inmediatamente después de la resección quirúrgica de pacientes. Diferentes técnicas de xenoinjertos pueden ser necesarios para diferentes aplicaciones de investigación. Por ejemplo, xenoinjertos subcutáneos generados a partir de fragmentos de tumor se generan rápidamente, se monitorizan fácilmente, y pueden ser más apropiadas para la administración local de nuevas terapias con convenienteseguimiento de la respuesta del tumor. Xenoinjertos intrahepáticos pueden ser más relevantes para los estudios relativos a la función del microambiente hepática en biología HCC. Los xenoinjertos generados a partir de suspensiones de células tumorales son necesarios para la identificación y caracterización de los subconjuntos de células iniciadoras del tumor o para experimentos que requieren en manipulaciones in vitro de células tumorales antes de los xenotrasplantes. Así, hemos desarrollado y validado los siguientes protocolos para establecer subcutánea o xenoinjertos intrahepáticas de las suspensiones de células o fragmentos tumorales derivadas de muestras de HCC humano primarios.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#8217; s Mod. Águila Mediana/Jamón&#8217; s F12 50/50 Mezcla x1 (DMEM-F12) </td><td>WISENT Bioproducts</td><td>319-075-CL</td><td></td></tr><tr><td> Colagenasa Tipo IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td> Dispasa II </td><td>Stemcell Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td> Matrigel Matrix</td><td>Becton-Dickinson Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td> 10 % Solución de formalina tamponada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>0,9 % solución salina Solución (NaCl), estéril</td><td>Marca de la casa</td><td>1011-L8001</td><td></td></tr><tr><td>Betadine exfoliante quirúrgico</td><td>Purdue Pharma</td><td>NPN 00158313</td><td></td></tr><tr><td> Buprenorfina (Temegesic) NR 0,3 mg/ml</td><td>Reckitt Benckiser</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurano USP, 99,9 %, anestésico inhalatorio</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td>M60302</td><td></td></tr><tr><td>Gel de lágrimas </td><td>Novartis Pharmaceuticals</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Compuesto de sección congelada </td><td>VWR</td><td>95057-838</td><td></td></tr><tr><td> Cryomold, Tissue -Tek </td><td>Sakura Finetek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td> Precision Glide Needle 18G 1 &#189; </td><td>Becton-Dickinson Biosciences</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td> Aguja deslizante de precisión 27G &#189; </td><td>Jeringa de insulina Becton-Dickinson Biosciences</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>, 3/10 cc U-100, 29G&#189; </td><td>Becton-Dickinson Biosciences</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td> Cuchilla quirúrgica No.10</td><td>Feather Safety Razor Co.</td><td>08-916-5A</td> #5-0 Sutura quirúrgica de seda <td></td></tr><tr><td> suave, aguja de punta cónica de 3/8" </td><td>Syneture</td><td>VS-880</td><td></td></tr><tr><td> Cinta quirúrgica Transpore</td><td>3M Health care</td><td>1577-1</td><td></td></tr><tr><td> Aplicador de algodón </td><td>Medpro</td><td>018-425</td><td></td></tr><tr><td> Surgicel, celulosa regenerada oxidada</td><td>Ethicon</td><td>1951</td><td></td></tr><tr><td> Colador de células 100 &#956; m nylon</td><td>Becton-Dickinson Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td> Iluminación de aumento con base móvil</td><td>Benson medical Industries Inc.</td><td>modelo: RLM-CLT-120V</td><td></td></tr><tr><td>Petridish estéril 100x20 mm </td><td>Sarstedt</td><td>821474</td><td></td></tr><tr><td> Pinza de tejido, 1x2 dientes, 4-1/2"</td><td>Almedic</td><td>A10-302</td><td></td></tr><tr><td> Pinza de vendaje Adson 4-3/4"</td><td>Almedic</td><td>A10-220</td><td></td></tr><tr><td> Pinza de apósito para ojos, dentada, recta, 4" </td><td>Almedic</td><td>A19-560</td><td></td></tr><tr><td> Pinza hemostática Hartman, curvada, 3-1/2" </td><td>Almedic</td><td>A12-142</td><td></td></tr><tr><td> Tijera de iris, curva, 4-1/4"</td> <td>Almedic</td><td>A8-690</td><td></td></tr><tr><td> Tijera de iris, recta, 4-1/2" </td><td>Almedic</td><td>A8-684</td><td></td></tr><tr><td> Destornillador de aguja Olsen-Hegan, 5-1/2" </td><td>Almedic</td><td>A17-228</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de subcutánea e intrahepática hepatocelular carcinoma humano xenoinjertos en ratones inmunodeficientes

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

En modelos experimentales in vivo de carcinoma hepatocelular (HCC) que recapitular la enfermedad humana proporcionan una valiosa plataforma para la investigación en la fisiopatología de la enfermedad y para la evaluación preclínica de nuevas terapias. Se presenta una variedad de métodos para generar subcutánea o ortotópico xenoinjertos de HCC humano en ratones inmunodeficientes que podría ser utilizado en una variedad de aplicaciones de investigación. Con un enfoque en el uso de tejido de tumor primario de pacientes sometidos a resección quirúrgica como punto de partida, se describe la preparación de suspensiones de células o fragmentos de tumor de xenoinjerto. Se describen técnicas específicas para estos tejidos xenoinjerto i) por vía subcutánea, o ii) intrahepatically, ya sea por implantación directa de células tumorales o fragmentos en el hígado, o indirectamente mediante la inyección de células en el bazo de ratón. También describimos el uso de la resección parcial del hígado de ratón nativo en el momento de xenoinjertos como una estrategia parainducir un estado de regeneración hepática activa en el ratón receptor que pueden facilitar el injerto intrahepática de las células tumorales humanas primarias. Los resultados esperados de estas técnicas se ilustran. Los protocolos descritos se han validado utilizando muestras y xenoinjertos humanos HCC primaria, que suelen realizar menos robusta que las líneas celulares de HCC humano bien establecidos que se utilizan ampliamente y frecuentemente citados en la literatura. En comparación con las líneas celulares, se discuten los factores que pueden contribuir a la relativamente baja probabilidad de injerto HCC primaria en modelos de xenotrasplante y hacer comentarios sobre cuestiones técnicas que pueden influir en la cinética de crecimiento de xenoinjertos. También le sugerimos los métodos que deben aplicarse para garantizar que los xenoinjertos obtenidos se asemejan con exactitud HCC tejidos padres.

La Figura 3 muestra la apariencia típica de un xenoinjerto subcutáneo HCC humano y la correspondiente apariencia histopatológica del tumor. El desarrollo y el crecimiento de xenoinjertos subcutáneos pueden ser controlados fácilmente por examen diario de los ratones receptores. El intervalo de tiempo entre los xenoinjertos y el desarrollo de un tumor puede variar mucho dependiendo del tipo de tejido (fragmento de tumor vs suspensión de células), fuente de tejido (muestra primaria paciente, xenoinjerto me...

Xenoinjertos tumorales humanos en ratones inmunodeficientes son herramientas valiosas para el estudio de la biología del cáncer. Se describen los protocolos específicos para generar los xenoinjertos subcutáneos y intrahepática de células de carcinoma hepatocelular humano o fragmentos tumorales. La regeneración hepática inducida por hepatectomía parcial en ratones receptores se presenta como una estrategia para facilitar el injerto intrahepática.

Generación de subcutánea e intrahepática hepatocelular carcinoma humano xenoinjertos en ratones inmunodeficientes

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

El objetivo general de este procedimiento es generar xenoinjertos subcutáneos o intrahepáticos de carcinoma hepatocelular humano o CHC en ratones inmunodeficientes. Esto se logra primero preparando fragmentos tumorales o una suspensión de células individuales a partir de una muestra fresca de CHC humano para su implantación en los ratones para xenoinjertos subcutáneos. El siguiente paso consiste en inyectar células tumorales o implantar fragmentos tumorales en un bolsillo dorsal subcutáneo para xenoinjertos intrahepáticos.El siguiente paso consiste en inyectar células tumorales en el bazo o en el hígado, o implantar fragmentos tumorales directamente en el hígado en la etapa final. Los animales se observan durante varias semanas hasta que se desarrollan tumores. Finalmente, los xenoinjertos de HCC humano pueden utilizarse para estudiar muchos aspectos de la biología tumoral, incluyendo los mecanismos de tumorigénesis y las respuestas a nuevas terapias.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el uso exclusivo de líneas celulares o xenoinjertos subcutáneos, es que con esta técnica, las muestras primarias de cáncer hepático humano y los xenoinjertos in

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Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este video muestra un ensayo para generar un modelo de ratón xenoinjerto humanizado. A un ratón inmunodeprimido se le inyecta ciclofosfamida para provocar el agotamiento de las células inmunitarias. Las células tumorales derivadas del paciente mezcladas con células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) en un hidrogel se inyectan subcutáneamente en el ratón, formando un tumor con células T infiltrantes.

Una técnica para generar un modelo de ratón de xenoinjerto humanizado humano injertado en PBMC

La diseminación metastásica del cáncer es la principal causa de muerte por cáncer. Proporcionamos una descripción en profundidad de nuestra metodología de la cirugía de supervivencia para el establecimiento de un sistema de modelo de ratón singénico "-paciente como" ortotópico para el estudio de los mecanismos de la metástasis en tumores de órganos sólidos.

Un &quot;paciente-Like&quot; ortotópico Singénico modelo de ratón de carcinoma hepatocelular Metástasis

Aquí, presentamos un nuevo modelo de hígado de ratón humanizado generado en ratones knockout celular mediado por el receptor de toxina Alb (TRECK)/SCID tras el trasplante de células madre hepáticas humanas inmaduras y expandibles.

Generación de un ratón humanizado hígado uso de células madre hepáticas humanas

Hemos descrito un protocolo para la realización de hepatectomía parcial (PHx) y trasplante de la célula vía bazo en cabeceo. SCID (CABECEO. CB17-Prkdcscid/j) ratones. En este protocolo, se realiza una incisión para exponer y resecar el lóbulo izquierdo del hígado, seguido por otra incisión para el intrasplenic trasplante de células.

Intrasplenic trasplante de hepatocitos después de Hepatectomy parcial en cabeceo. Ratones de SCID

Aquí, presentamos un protocolo para generar un modelo de ratón quimérico hígado humano de hipercolesterolemia familiar usando hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas. Este es un modelo valioso para probar nuevos tratamientos para la hipercolesterolemia.

Un modelo de ratón quimérico hígado humano de hipercolesterolemia familiar con hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas

Este protocolo proporciona un método confiable para establecer ratones humanizados con el sistema inmunitario humano y las células hepáticas. Los ratones inmunodeficientes duales reconstituidos logrados mediante inyección intraesplénica de hepatocitos humanos y células madre CD34+ hematopoyéticas son susceptibles a la infección por el virus de inmunodeficiencia humana-1 y al daño hepático recapitulado observado en Pacientes infectados por el VIH.

Establecimiento del modelo de ratón TK-NOG humanizado dual para la patogénesis hepática asociada al VIH

Aquí, describimos el desarrollo de un modelo murino clínicamente relevante de cáncer de hígado recapitulando las características inmunitarias típicas del cáncer hepatocelular (HCC).

Un modelo de ratón ortotópico inducido por hepatocitos oncogénicos que surge en el ajuste de la inflamación hepática y la fibrosis

Los modelos de ratón de xenoinjerto de melanoma uveal de hígado humano ortotópico se crearon utilizando técnicas quirúrgicas de implantación ortotópica con técnicas de inyección de agujas y trozos tumorales derivados del paciente con líneas celulares de melanoma uveal humano cultivadas.

Generación de una plataforma de xenoinjerto de melanoma uveal humano ortotópico hepático en ratones inmunodeficientes

Aquí, presentamos un protocolo para crear xenoinjertos de carcinoma hepatocelular ortotópico con y sin ligadura de la arteria hepática y realizar imágenes no invasivas de tomografía por emisión de positrones (PET) de hipoxia tumoral utilizando [18 F] fluoromisonidazol ([18 F] FMISO) y [18 F] fluorodesoxiglucosa ([18F] FDG).

Imágenes PET/MR no invasivas en un modelo ortotópico de ratón de carcinoma hepatocelular

Los organoides generados a partir de los tumores de los pacientes se inyectan ortotópicamente en el hígado del ratón. La resección del tejido hepático no tumoral conduce a un entorno regenerativo en el tejido hepático donde se encuentra el tumor.

Un modelo de xenoinjerto de organoide derivado de pacientes con cáncer hepatocelular para investigar el impacto de la regeneración hepática en el crecimiento tumoral

Aprenda a generar xenoinjertos de carcinoma hepatocelular humano en ratones inmunodeficientes mediante implantación subcutánea e intrahepática. Este modelo permite estudiar la biología tumoral y evaluar respuestas terapéuticas en investigación oncológica.

Generación de subcutánea e intrahepática hepatocelular carcinoma humano xenoinjertos en ratones inmunodeficientes

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