Síntesis, Entrega y Celular En vivo Aplicación de sensores de pH basadas en dendrímeros

El objetivo general del siguiente experimento es desarrollar nuevos sensores fluorescentes basados en tambores Dun con propiedades mejoradas para la obtención de imágenes de pH in vitro en células vivas e in vivo. Esto se logra conjugando primero tintes sensibles al pH a un andamio dendrítico junto con otras fracciones, como grupos objetivo o pH en tintes sensibles. Y se toman mediciones in vitro para generar una curva de calibración de pH junto al pH de la imagen en células vivas.

El sensor se administra por electroporación y se generan mapas de pH mediante microscopía confocal para obtener imágenes del pH en el espacio extracelular del cerebro. Durante la actividad neuronal fisiológica y patológica, el sensor se microinyecta en el cerebro de los ratones anestesiados. A continuación, los datos de fluorescencia se adquieren mediante microscopía de dos fotones.

Los resultados obtenidos muestran que los sensores basados en drimmer logran medir los cambios de pH con alta resolución espacial y temporal, tanto en células vivas como in vivo. Aunque ya se han empleado varios tintes de chimenea con comportamiento sensible al pH, sufren de varios inconvenientes, como la poca movilidad y la fuga celular. Además, no permiten la medición absoluta del sistema métrico temerario.

Aquí demostramos la conación de tintes sensibles al pH al andamio genético D, y dado que los rendimientos permiten una medición precisa con la resolución especial y temporal, este método podría ser una herramienta útil para estudiar el proceso fisiológico y patológico regulado por el pH en células vivas. La interrupción en la regulación del pH en el sistema neurológico se asocia con varias afecciones como el accidente cerebrovascular y la epilepsia, y el sensor de pH disponible demostró ser poco efectivo, lo que llevó al diseño del sensor presentado. Aunque este método se ha aplicado aquí a imágenes de pH h, es un enfoque general y se puede aplicar a otras especies biológicas relevantes.

Al elegir el tinte sensor de ganancias, el enfoque sintético fácil y versátil hace que estos procedimientos sean sencillos. Demostrando el procedimiento hoy estarán Giovanni re, Barbara ti, Marco Brody y Sebastian Suli para conjugar los indicadores de pH con Piam Demers. Comience disolviendo el rimer en DMSO anhidro a una concentración final de 50 micromolares.

Prepare 10 soluciones madre micromolares de fluoresceína NHS y tetraetilo RUMINE NHS, también conocido como TMR en anhidro, DMSO en un tubo de microcentrífuga combinado, un mililitro de solución de G 4 peram dederer con ocho equivalentes, o 40 microlitros de fluoresceína y ocho equivalentes, o 40 microlitros de TMR. La proporción molar en la mezcla reflejará la cantidad de tintes cargados en el demer. Revuelva la solución a temperatura ambiente durante 12 horas.

A continuación, diluya la mezcla de uno a 10 con agua desionizada y cargue la mezcla de reacción en una bolsa de diálisis con un corte de peso molecular de 10 kilodaltons, dialice contra agua desionizada y reemplace el agua en el depósito tres veces durante 24 horas. Al día siguiente, transfiera la solución a un frasco de vidrio y congélelo a menos 80 durante unas horas. Cuando la solución esté completamente congelada, transfiera el vial a un liofilizador y liofilicelo durante 24 horas.

Se debe obtener un polvo púrpura, ondulado y sólido y disolverlo en mqe agua. A una concentración final de 10 micromolares. Dispense la solución en alícuotas de 50 microlitros en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros y guárdelos a menos 20 grados centígrados.

Para la calibración in vitro, prepare una solución de 500 nanomolares de D drummer en dos milimolares PBS en un cuarzo Q vet. Se utiliza un tampón PBS muy diluido para evitar cambios bruscos de pH durante la valoración. Mida los espectros de emisión de fluoresceína y TMR y optimice la configuración óptica del fluorímetro para lograr una buena relación señal/ruido.

A continuación, realice una valoración del pH añadiendo pequeños volúmenes de hidróxido de sodio normal 0,1 y ácido clorhídrico normal 0,1. Después de cada adición, agite el Q vet para mezclar. Espere un minuto para que se equilibre y luego mida el pH por medio de un pH.

Los espectros de emisión de microelectrodos de fluoresceína y TMR deben registrarse para cada paso sin ningún cambio. En los ajustes ópticos, trace la intensidad de fluorescencia frente al pH. Para la valoración, la señal de domine de la varilla no debe verse afectada por el pH.

La señal de fluoresceína debe ser una curva sigmoidal y debe estar equipada con un único modelo de unión con una PK de 6,4 para la electroporación. Transfiera seis veces 10 a la quinta celda hela en 72 microlitros a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros a las celdas resuspendidas. Agregue dendri o solución acuosa a una concentración de dos micromolares, agregue tres mililitros, tampón de electroporación a un tubo de micropuración.

Luego, con una punta de electroporación de 10 microlitros, aspire las mezclas de celda y rimer. A continuación, inserte la micropipeta en la estación de pipetas y establezca las condiciones del pulso de micropuración aquí. El voltaje de pulso se establece en 1005 voltios.

El ancho de pulso se establece en 35 milisegundos y el número de pulso se establece en dos después de la placa de pulso. 20 microlitros de las células electroporadas en platos con fondo de vidrio con medio fresco sin antibióticos. 12 horas después de la electroporación Imágenes de las células con un microscopio confocal utilizando un conjunto de filtros estándar para fluoresceína y R Domine.

Concéntrese en la muestra y ajuste la potencia del láser y la ganancia del detector para maximizar la relación señal-ruido. Si la electroporación fue exitosa, las celdas deben ser brillantemente fluorescentes en ambos canales. La localización depende del tamaño y la carga de la D que se utilice. Frecuentemente.

La localización lisosomal solar, que se observa como pequeñas vesículas perinucleares, está presente debido a endocitosis o compartimentación. Si predomina la localización lisosomal, en la que la mayor parte de la fluorescencia se localiza en el interior de las vesículas y se observa señal de poro en el citosol. Esto significa toxicidad y las mediciones deben descartarse.

Adquiera los dos canales secuencialmente, adquiera varias imágenes y promedie las imágenes para mejorar la calidad de la imagen. Para generar una curva de calibración de pH, utilice tampones con opfor a diferentes phs para agrupar el pH intracelular y extracelular al mismo valor. Adquiera al menos 20 imágenes celulares por pH y mida al menos cinco puntos desde pH 5.5 hasta pH 7.5.

Recuerda que el pH B seis son tóxicos para las células, pero pueden tolerarse durante un corto período de tiempo, por lo que debe adquirir imágenes lo más cortas posible. Si ve signos de apoptosis, deseche las células y reinicie. Después de la adquisición.

Utilice la imagen J o un software análogo para el análisis de datos. Primero, determine la proporción de verde a rojo. A continuación, trace la relación frente al pH para producir una tendencia lineal que dará una curva de calibración que se puede utilizar para convertir la relación en pH en futuros experimentos.

Para la preparación de muestras in vivo, se debe comenzar con ratones C 57 black six J y hembras entre los días 28 y 70 del día postnatal. Después de anestesiar a los ratones con uretano, realice un pellizco en los dedos de los pies para asegurarse de que el animal esté completamente anestesiado y aplique ungüento para los ojos para reducir la respuesta al estrés cortical y el edema cerebral. Durante la cirugía, inyecte dos miligramos por kilogramo de peso corporal de dexametasona, fosfato de sodio por vía intramuscular.

A continuación, con unas tijeras quirúrgicas, afeita la cabeza del animal, luego coloca un paño quirúrgico y aplica gel de lidocaína al 2,5% en el cuero cabelludo. Use tijeras para cortar el colgajo de piel que cubre el cráneo de ambos hemisferios. Lave el hueso expuesto con solución salina y con pinzas, retire suavemente el periostio.

Esto proporcionará una mejor superficie de adherencia. Para el pegamento y el cemento dental, aplique un poste de cabeza de acero hecho a medida con una cámara central de imágenes y, con cianocrilato, péguelo en su lugar en un plano aproximadamente paralelo al cráneo sobre la región cortical de interés. Fije el poste en su lugar con cemento dental blanco.

Fije la cabeza del ratón y realice una craneotomía de dos a tres milímetros de diámetro perforando la región de interés. Con frecuencia, a lo largo del procedimiento de perforación, se utiliza una jeringa para aplicar un líquido cefalorraquídeo A estéril fresco en el cráneo para minimizar el calentamiento de la corteza durante la cirugía. Después de la craneotomía, transfiera al animal a la etapa de imagen para mantener la cabeza quieta debajo del objetivo.

Atornille la cámara de imagen al poste ajustable y aplique un bozal de plástico hecho a medida conectado al oxígeno. Esto proporcionará aire enriquecido con oxígeno durante el experimento para ayudar a la respiración de los animales.

Para inyectar el sensor en la corteza cerebral, cargue una pipeta de vidrio con un diámetro de punta de cuatro milímetros y un electrodo de cloruro de plata. Con la solución ER de un drimador micromolar, el electrodo facilitará el registro de los potenciales de campo extracelular con una configuración de microinyección. Inserte la pipeta en la corteza a una profundidad aproximada de 150 micras.

Inyecte durante uno o dos minutos a una presión de 0.5 libras por pulgada cuadrada para optimizar la configuración óptica para la obtención de imágenes. Ajuste la potencia del láser para minimizar el blanqueo y el daño de las fotos. Por lo general, la potencia del láser empleada es de alrededor de 20 milivatios y la ganancia PMT se mantiene constante en 667 voltios.

Configure la longitud de onda del láser para excitar el sensor a 820 nanómetros y dirija el software para detectar la fluoresceína y la fluorescencia de domine de varillas simultáneamente a través de filtros FTSE y trit estándar. Establezca también la frecuencia de adquisición en una velocidad de fotogramas de dos hercios para la corrección de fondo. Adquiera un marco oscuro con el obturador láser cerrado para medir el ruido térmico medio que surge en los PMT y el pedestal.

Por último, adquiera imágenes de fluorescencia dependientes del pH y guárdelas para su posterior análisis. Analice los datos como hasta ahora para evaluar el comportamiento in vitro de la fluoresceína y el rumino. Cargado en el rimer, se realizó una valoración del pH utilizando un fluorímetro.

Esta figura muestra una valoración típica de un sensor de pH. La fluoresceína y el rumine se pueden excitar por separado a 488 nanómetros y 550 nanómetros respectivamente, lo que permite una diafonía mínima entre los dos canales, como se puede ver claramente. La fluoresceína muestra un comportamiento dependiente del pH, mientras que la señal R domine no cambia significativamente en el rango de pH fisiológico.

Por lo tanto, la relación de estas dos señales no depende de la concentración del sensor, sino solo del pH. A continuación, se electroporaron las células hela intracelulares con los sensores dederer y se realizaron imágenes confocales como se describe en este video. Estas imágenes confocales muestran las células en el canal de fluoresceína a la izquierda, el canal R domine en el medio, y se muestran como un mapa métrico de relación de pH a la derecha.

Se observan fuertes señales de fluoresceína y r domine, que se colocalizan demostrando la integridad de la estructura del sensor. Un mapa métrico de proporción se reconstruye dividiendo las dos imágenes píxel por píxel y se representa con una pseudo escala de colores. Para calibrar la respuesta del sensor dentro de las células, se realizó un pinzamiento del pH con ionóforos como se muestra aquí.

Los indicadores responden fácilmente al pH con un cambio en la proporción de verde a rojo. Los datos resultantes se utilizaron para generar una curva de calibración para mediciones precisas del pH. La tendencia lineal en la calibración demuestra la capacidad del sensor para responder al pH sin ninguna perturbación del entorno celular.

Para demostrar cómo se pueden emplear sensores basados en dendri para la obtención de imágenes in vivo, se realizaron imágenes de pH en el cerebro de un ratón dendri o anestesiado inyectado. Las señales de fluoresceína y r domine se obtuvieron simultáneamente con una excitación de 820 nanómetros, y el mapa de relaciones se construyó píxel por píxel de forma similar a las mediciones de células vivas. En particular, los indicadores se localizan en el espacio extracelular, las áreas no fluorescentes en la imagen identifican cuerpos celulares o pequeños vasos sanguíneos para verificar la respuesta del sensor al pH.

Empleamos el uso de la hipercapnea. De hecho, se sabe que el dióxido de carbono altera el equilibrio de los tampones de carbonato en la sangre y el tejido, lo que resulta en una acidificación del tejido. Como se ve en este gráfico, la inhalación de un 30% de dióxido de carbono es suficiente para inducir una fuerte respuesta del sensor que es completamente reversible tras la ventilación por revoluciones del ratón.

Estos resultados demuestran el potencial de los sensores basados en sensores para resaltar los cambios fisiológicos y patológicos del pH en células vivas e in vivo. A, nuestro procedimiento es compatible con otras mediciones como registros electrofisiológicos. Esto permitió obtener simultáneamente información complementaria sobre el proceso biológico en curso.

Este método, después de su desarrollo, allanó el camino de los investigadores en biología celular y neurobiología para explorar los procesos regulados por el pH en células de cultivo e in vivo.