Todo el montaje de la tinción de inmunofluorescencia del Neonatal ratón Retina de investigar Angiogénesis En vivo

El objetivo general de este procedimiento es investigar la angiogénesis en la retina neonatal del ratón. Esto se logra primero nucleando los ojos postnatales, y luego aplicando un fijador del tercer paso es diseccionar cuidadosamente la retina murna postnatal en forma de pétalo, y el paso final es teñir la vasculatura de la retina. En última instancia, la visualización de la vasculatura de la retina del ratón se logra mediante tinción fluorescente y microscopía confocal.

Para demostrar este procedimiento estarán el Dr. Simon Tlo, un post-doc en mi laboratorio, y Kathleen Allenson, un miembro anterior de mi laboratorio. A lo largo de este procedimiento, la temperatura predeterminada es la temperatura ambiente. Comience colocando un cachorro de ratón muerto humanamente de lado con unas tijeras.

Retire la piel que cubre el ojo. A continuación, con las tijeras colocadas debajo del ojo, corte el nervio óptico y los tejidos circundantes y levante el ojo. Transfiera el ojo enucleado a una placa de 24 pocillos que contiene fijador, que es 4% de PFA en dos veces.

Los PBS proceden a diseccionar el siguiente ojo mientras uno está en el fijador. El escalonamiento entre las dos disecciones oculares será de medio minuto. Con la práctica.

Deje que cada ojo se fije durante 10 a 15 minutos. Luego transfiéralos a frío dos veces PBS en hielo durante al menos cinco a 10 minutos. Antes de aislar las retinas, recoja tantos ojos en el PBS como desee, utilizando una pipeta de plástico para pastos que se haya cortado para ensanchar el verraco.

Transfiera los ojos a una placa de Petri que contenga dos veces PBS bajo un microscopio de disección. Retire la grasa alrededor del ojo con pinzas y tijeras. Perfore el borde de la córnea con unas tijeras afiladas y corte alrededor de la córnea y el iris, deseche estos tejidos.

A continuación, inserte las pinzas entre la retina y la esclerótica. Retire la esclerótica teniendo cuidado de no desgarrar la retina. La capa coroidea también se puede extirpar siempre que no haya riesgo de dañar la retina.

Dejar la capa de coroides no debería afectar significativamente la calidad de la tinción inmunológica. Ahora, con unas pinzas, retire el cristalino y el humor vítreo. A continuación, retire los vasos aloides.

Use pinzas finas para juntarlos en el centro del ojo. Luego, retírelos rápidamente del centro de la retina. Tenga mucho cuidado de eliminar todo el cardo amarillo porque si deja algo, puede oscurecer sus resultados de pie.

La retina en forma de copa ahora debe transferirse a una placa de Petri limpia y enjuagarse con PBS. Ahora en la retina. Haga cuatro o cinco incisiones radiales que alcancen aproximadamente dos tercios del camino hacia el centro.

Usa unas tijeras de resorte para crear esta retina en forma de pedal. Este paso requiere paciencia y práctica para perfeccionarlo. Ahora extraiga la mayor parte del PBS con una pipeta de pasto.

Esto aplanará la retina. A continuación, retire el exceso de PBS con un pequeño trozo de papel absorbente. A continuación, aplique menos 20 grados de metanol gota a gota sobre la superficie de la retina hasta que esté casi sumergida y, a continuación, agregue generosamente metanol.

Las retinas se volverán blancas. Este paso ayuda a fijar las retinas y facilitará la permeación. Transfiera las retinas en el metanol frío a un tubo pequeño.

Usando una pipeta de plástico de diámetro ancho. Permita que se incuben en el metanol frío durante al menos 20 minutos si es necesario, las retinas pueden permanecer en el metanol a menos 20 grados durante varios meses. El uso de anticuerpos solo aquí.

El cine no se puede utilizar con éxito en la retina fija materna. En este caso, la retina debe proceder directamente a la inmunotinción después de aplanarla hasta obtener forma de pétalo. Comience pipeteando cuidadosamente el metanol de las retinas.

A continuación, enjuague las retinas de una sola vez con PBS. Retirar el PBS y cubrir las retinas con 100 microlitros de solución de permanente con un 5% del suero adecuado. Configura las retinas para que tiemblen suavemente durante una hora después.

Retire la solución de bloqueo permanente con una pipeta y reemplácela con 100 microlitros de solución de bloqueo permanente que contenga el anticuerpo primario o se seleccione antes. A continuación, configure las retinas para incubar durante la noche a cuatro grados centígrados y mecerlas a la mañana siguiente. Lave las retinas cuatro veces en PBS TX durante 10 minutos por lavado.

Aplique un balanceo suave durante todos los pasos de lavado. Si el anticuerpo primario no está conjugado, agregue 100 microlitros del anticuerpo secundario fluorescente apropiado, diluido de uno a 200 en PBS tx. Incubar las retinas durante la noche a cuatro grados centígrados o durante cuatro horas a temperatura ambiente con una suave agitación para eliminar el anticuerpo secundario.

Lave las retinas cuatro veces en PBS TX con un balanceo suave durante 15 minutos por lavado. Ahora proceda con el montaje. Transfiera las retinas a portaobjetos con una pipeta de plástico de diámetro ancho y elimine el exceso de P-B-S-T-X con un pañuelo de papel.

A continuación, monta las retinas en 50 microlitros de oro prolongado y cubre suavemente la solución con un cubreobjetos. Para permitir el fraguado prolongado de oro, refrigere los portaobjetos durante la noche a cuatro grados centígrados, protegidos de la luz al día siguiente. Proceda con la toma de imágenes de las retinas después de la disección.

La retina debe verse como una flor plana usando ISO selectin B 4 Alexa 4 88. Las células endoteliales se tiñeron y aparecen de color verde. Las células musculares vasculares de soporte se visualizaron utilizando el músculo liso de Antifa, la actina la vista de baja potencia utilizando un objetivo de cinco veces, permitió una visión general de la organización vascular de la retina mediante el uso de una combinación diferente de anticuerpos.

Las células endoteliales se pueden ver usando tinción inmunológica anti CD 31, apoyando a los parásitos donde se visualizan usando un anticuerpo contra NG 2. Alternativamente, los parásitos de soporte se tiñeron con anti desmina. La tinción antidesmina visualiza los procesos de los parásitos en forma de dedos y ayuda a determinar si están estrechamente asociados con las células endoteliales.

Por el contrario, la tinción anti NG dos delinea los núcleos de cada parásito, lo que es útil cuando se cuantifica el número de células del parásito en la vasculatura. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe evitar tocar y dañar la superficie de la retina con las herramientas de disección. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la tinción de BD para investigar la proliferación de células específicas.