La muerte celular asociada con Mitosis anormal observada por Imagen confocal en vivo las células cancerosas

El objetivo general del siguiente experimento es observar el efecto citotóxico del derivado de philanthotoxina PJ 34 durante la mitosis en células cancerosas somáticas humanas multicéntricas. Esto se logra marcando los centrosomas con GFP-tubulina gamma y los cromosomas con H2B rojo mediante transfección. El objetivo de la transfección es permitir el seguimiento de la migración y agrupamiento de los centrosomas, así como la disposición de los cromosomas durante la mitosis en células cancerosas somáticas multicéntricas vivas.

Como segundo paso, algunas de las células transfectadas se exponen a PJ 34, una molécula que actúa como agente desagregador de centrómeros adicionales. A continuación, se escanean células cancerosas transfectadas y vivas mediante microscopía confocal para capturar eventos durante la mitosis asociados a la migración de centrómeros y cromosomas. La reorganización o agrupación de imágenes secuenciales obtenidas muestra los efectos desagregadores y citotóxicos del tratamiento con PJ 34 en células cancerosas durante la mitosis, basándose en imágenes confocales de células vivas.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia una terapia contra el cáncer dirigida que elimina exclusivamente las células cancerosas autosómicas durante la mitosis. La demostración de esta técnica estará a cargo de nuestro colaborador, el Dr. Asher Castillo del Centro de Investigación del Cáncer en el Centro Médico Sheba, y del Dr. Leonid Middleman de la unidad de imágenes de la Escuela de Medicina Sacko en la Universidad de Telaviv. Para preparar células de cáncer de mama M-D-A-M-B 231 para imágenes confocales en vivo, siembre dos veces 10 a la quinta células en placas de cultivo de fondo de vidrio recubierto con poli-L-lisina de 35 milímetros de diámetro, en dos litros de medio completo, e incube al 5 % de dióxido de carbono a 37 grados Celsius.

El cultivo celular está listo para la transfección cuando alcanza una confluencia del 60 al 70 %. Las células se transfectarán con dos plásmidos, uno que codifica la tubulina gamma, GFP para la detección fluorescente de los centrosomas, y el otro que codifica la histona roja para la detección fluorescente de los cromosomas. La transfección se realiza utilizando el reactivo de transfección liposomal jet PI siguiendo el protocolo del fabricante. Lave las células una vez con PBS y luego reemplace el medio celular con dos mililitros de DMEM tibio sin suplementos. Añada suavemente la mezcla de transfección a las células en DMEM y luego devuelva las células al incubador durante ocho horas. Después de ocho horas.

Sustituya el DMEM con dos mililitros de medio completo e incube las células en el incubador durante 24 horas. 24 horas. Después de la transfección, sustituya el medio con dos mililitros de medio completo que contenga 20 micromolares de PGA 34.

Incube las células durante 18 horas adicionales antes de la imagen confocal en vivo. A continuación se indican los parámetros técnicos de la configuración del escáner para la imagen confocal en vivo. Modo de escaneo XYZT, diafragma de campo de Airy 1.00, zoom 3.5, resolución de ocho bits, láser DPSS 561 nanómetros, láser visible de argón 488 nanómetros, láser visible de helio-neón 633 nanómetros.

Objetivo H-C-X-P-L-A-P-O-C-S 63 veces 1.40 Aceite UV apertura numérica 1.4. Velocidad de escaneo, 700 hercios e índice de refracción 1.52. Somete las células a imágenes confocales en vivo durante al menos 16 horas en una cámara de imagen, manteniendo las células a 5% de dióxido de carbono y 37 grados Celsius.

Se examinará la eficacia de la transfección mediante microscopía de fluorescencia. Comience este procedimiento sembrando dos veces diez a la quinta células MDA MB 231 en una placa de seis pocillos que contenga un cubreobjetos por pocillo, en dos mililitros de medio completo. Transfecte las células de la misma manera que antes, utilizando el reactivo de transfección liposomal jet PI siguiendo el protocolo del fabricante.

36 horas posteriores a la transfección. Retire el medio de cada pocillo tras lavar las células transfectadas montadas sobre un cubreobjetos con PBS. Fije las células mediante incubación en una solución fría de metanol y acetona en una proporción de uno a uno durante siete minutos a 20 grados Celsius negativos.

Después de siete minutos, aspire la solución de fijación y deje secar la laminilla con las células montadas en una campana química durante 30 minutos. A continuación, aplique el reactivo antidesvanecimiento prolongado con oro y DAPI y deje secar la laminilla en la oscuridad durante seis horas. Examine la preparación bajo un microscopio de fluorescencia y calcule el porcentaje de células transfectadas con señales rojas y verdes.

De la población total de células, el porcentaje deseado de transfección es de aproximadamente 20 a 40% cuando se cuentan de 100 a 200 células. Para comenzar este procedimiento, siembre dos veces 10 a la quinta células de cáncer de mama M-D-A-M-B 231 sobre cubreobjetos de vidrio en una placa de seis pocillos con dos mililitros de medio completo. Añada PJ 34 al medio e incube las células durante el período requerido.

Tras finalizar el período de incubación, lave las laminillas una vez con PBS y fije las células mediante incubación en una solución de metanol y acetona fríos a 4 °C en una proporción uno a uno durante siete minutos a veinte grados bajo cero. A continuación, aspire la solución de fijación y deje secar las laminillas en una campana extractora durante 30 minutos. Lave las laminillas una vez con PBST para permeabilizar las membranas celulares y luego bloquee las células con suero normal de asno al 10 % en PBST durante una hora a temperatura ambiente.

Cree la primera mezcla de anticuerpos añadiendo los anticuerpos primarios antitubulina y antitubulina gamma a la solución bloqueadora y vortexeando. A continuación, aplique 100 microlitros de la mezcla de anticuerpos para cada cubreobjetos sobre la tapa de una placa de seis pocillos. Gire el cubreobjetos boca abajo y colóquelo suavemente sobre la gota de anticuerpo; incube durante dos horas.

Añada temperatura ambiente. Esto tiñirá los husos y los centrosomas. Devuelva las laminillas a los pocillos y lave las células tres veces con PBST.

Luego, agregue los anticuerpos secundarios, LOR 488 y LOR 568, una gota por cubreobjetos en una placa de seis pocillos. A continuación, coloque los cubreobjetos boca abajo sobre las gotas de anticuerpos, incube durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Al finalizar la incubación con los anticuerpos secundarios, devuelva los cubreobjetos a los pocillos y lave las células tres veces con PBST.

Por último, monte los cubreobjetos utilizando el reactivo antidesvanecimiento prolongado gold con incubación de dappy durante toda la noche a temperatura ambiente en la oscuridad para secar antes de obtener imágenes de las células fijadas mediante microscopía confocal. PJ 34 es una fenatrodina estable y soluble en agua que previamente se observó que erradica exclusivamente células cancerosas con multicentrosomas sin afectar las células normales que experimentan mitosis con dos centrosomas y husos bifocales. En este estudio, se examinó la actividad citotóxica de PJ 34 utilizando células vivas de cáncer de mama humano M-D-A-M-B 231, que presentan una alta frecuencia de centrosomas adicionales.

Las células fueron transfectadas con GFP de tubulina gamma para marcar los focos de tubulina gamma y con histona H dos B roja para marcar los cromosomas. El escaneo de las células M-D-A-M-B 231 durante al menos 16 horas mediante imágenes confocales reveló la agrupación bifocal de los centrosomas, que representa la agrupación bifocal de centrosomas extras en la mayoría de las células en mitosis, como se ilustra en los siguientes clips de video. Este primer video muestra una célula viva seleccionada al azar durante la mitosis, con los centrosomas marcados en verde mediante la tubulina gamma.

Se visualiza la GFP en la segunda grabación durante la reorganización cromosómica en mitosis en una célula M-D-A-M-B 231 seleccionada al azar, transfectada con histona H two B roja. Esta tercera grabación corresponde a una célula MDA MB 231 que experimenta mitosis, en la cual los focos verdes de centrómeros extra nucleares agrupados en modo bifocal están marcados en verde y los cromosomas en rojo. En contraste, se detectaron centrómeros no agrupados y una disposición aberrante de los cromosomas en células M-D-A-M-B 231 transfectadas y vivas incubadas con 20 micromolar de PJ 34, y la mitosis en estas células terminó en muerte celular, tal como se muestra en esta película.

Esta documentación en tiempo real de la muerte celular durante la mitosis respalda firmemente una correlación positiva previamente definida entre el número de células malignas humanas con husos multipolares en mitosis y el porcentaje de muerte celular en células incubadas con PJ 34. Dado que PJ 34 actúa como un potente inhibidor de PARP uno, se investigó la posibilidad de que la inhibición de PARP uno provocara la muerte celular asociada a la falla mitótica. Se evaluó la actividad citotóxica de concentraciones crecientes de PJ 34 en fibroblastos embrionarios de ratón normales y deficientes en PARP uno, y aquí se muestran los resultados.

El gráfico de la izquierda muestra el porcentaje de husos multifocales calculado en fibroblastos embrionarios normales de ratón, representados por la línea negra, y en fibroblastos deficientes en PARP uno, representados por la línea gris, incubados durante 48 horas con PJ 34 en las concentraciones indicadas. Estos porcentajes se calcularon a partir de 20 husos totales detectados en tres experimentos diferentes. El gráfico de la derecha muestra la supervivencia de fibroblastos embrionarios de ratón normales y deficientes en PARP uno incubados durante 72 horas con 20 micromoles.

La supervivencia celular de PJ 34 se evaluó mediante la producción de ATP en las células. Se presentan los valores medios de cuatro mediciones para cada línea celular en tres experimentos diferentes. Estos resultados muestran que las dosis de PJ 34 provocaron de manera dependiente del fármaco husos distorsionados y muerte celular en fibroblastos embrionarios de ratón deficientes en PARP1, pero no en fibroblastos normales.

El hecho de que PJ 34 erradicara los metas deficientes en PARP1 a pesar de su deficiencia en PARP1, y la correlación entre la formación de husos multifocales y la erradicación celular en fibroblastos embrionarios de ratón deficientes en PARP1 incubados con PJ 34 a concentraciones superiores a las necesarias para la inhibición de PARP1, no es consistente con una relación causal entre la desaglomeración de centrosomas en fibroblastos embrionarios de ratón deficientes en PARP1 y la inhibición de PARP1. Estas imágenes de microscopía confocal muestran fibroblastos embrionarios de ratón normales y deficientes en PARP1 en mitosis, fijados, permeabilizados y marcados inmunológicamente para alfa y gamma tubulina, que marcaron sus husos en verde y sus centrosomas en rojo, respectivamente. Los cromosomas fueron marcados en azul con el reactivo DPI.

Las células no recibieron tratamiento o fueron incubadas con PJ 34 durante 48 horas a las concentraciones indicadas. Se observaron focos de tubulina gamma no agrupados, husos distorsionados y muerte celular en fibroblastos embrionarios de ratón deficientes en PARP uno tratados con PJ 34, pero no en fibroblastos embrionarios de ratón normales tratados con PJ 34. Algunos de los cultivos celulares examinados fueron tratados con dos inhibidores potentes no arínicos de PARP uno, A BT 8 88 y a G 0 1 4 6 9, que inhiben la actividad enzimática de PARP uno.

Ninguno de los inhibidores de PARP uno evaluados afectó a los fibroblastos embrionarios normales de ratón en concentraciones que inhibían la actividad de PARP uno. Estos inhibidores de PARP uno tampoco afectaron la agrupación de centrosomas en fibroblastos embrionarios de ratón deficientes en PARP uno. Estos resultados indican que la actividad citotóxica de PJ 34 sobre células con múltiples centrosomas no fue compartida por otros inhibidores potentes de PARP uno Una vez dominado.

Esta técnica puede utilizarse en otros tipos de células vivas para una variedad de propuestas.