Robusto PESCADO ADN 3D utilizando sondas marcadas directamente
15 de agosto de 2013
Se describe un protocolo robusto y versátil para el análisis de la arquitectura nuclear por FISH 3D DNA usando sondas fluorescentes marcados directamente.
El objetivo general del siguiente experimento es investigar la organización espacial de loci genómicos específicos en células individuales de una manera robusta. Esto se logra generando primero sondas marcadas con fluorescencia para finalmente unirse y resaltar la región genómica de interés. Los siguientes pasos son adherir, fijar y permear las celdas de interés en una diapositiva para permitir el acceso a la sonda.
A continuación, se realiza una desnaturalización térmica simultánea de la sonda y el ADN celular mediante pasos de lavado de hibridación de la sonda durante la noche para eliminar la sonda no unida específicamente y contrarrestar la resistencia con ppp. Para visualizar el núcleo celular, los resultados obtenidos con microscopía de fluorescencia revelarán finalmente la posición nuclear ocupada por regiones genómicas específicas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la organización nuclear, como la determinación de las interacciones funcionales entre los genes.
La principal ventaja de este protocolo DNA FISH en particular es que es rápido, robusto y versátil. Aunque demostramos este método utilizando celdas E ES, también se puede aplicar a muchos otros tipos de celdas, sondas marcadas directamente hechas de 100 a 250. Las kilobases producen constantemente señales brillantes si se requieren sondas más pequeñas.
Use smid de 40 a 50 kilobases, o incluso plásmidos que contengan insertos de cinco a 10 kilobases. Identifique los clones posteriores o smid correspondientes a genes específicos utilizando los navegadores de genomas de conjunto o UCSC. Para preparar ADN retroactivo de alta calidad, use precipitación repetida o un kit disponible comercialmente, la limpieza de la preparación es proporcional al volumen de sonda requerido.
Realice el etiquetado en dos pasos. En primer lugar, utilice la traducción NIC para introducir el alelo amino, DUTP. En segundo lugar, use el acoplamiento químico para unir un tinte reactivo medio de AM.
Vale la pena invertir tiempo en la fabricación de sondas brillantes, ya que son críticas para las señales fuertes de los peces. Este procedimiento se puede realizar en paralelo al tratamiento de las células y no tiene por qué realizarse al comienzo del día. Primero mezcló de 10 a 20 nanogramos de sonda marcada directamente con seis microlitros de CO 1D NA para seis microgramos.
A continuación, añada un microlitro de ADN monocatenario de testículos de salmón para obtener 9,7 microgramos. Ajusta el volumen de la mezcla a 100 microlitros con agua. A continuación, agregue 10 microlitros de acetato de sodio de tres molares y 275 microlitros de etanol y mezcle por vórtice.
Deje que la mezcla precipite durante al menos una hora a menos 20 grados centígrados. A continuación, haga girar la precipitación en una micro fuga a máxima velocidad durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, lavar el pellet con etanol al 70% y volver a centrifugarlo durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
A continuación, seque el pellet al aire. A continuación, resus. Suspenderlo en cinco microlitros de forma desionizada.
Amida a 37 grados centígrados mientras se agita a 1000 RPM, se lamina para protegerlo de la luz. Después de 30 minutos, agregue cinco microlitros de mezcla de sulfato de dextrina y continúe la incubación con agitación. Durante 10 minutos más, la propensión de las células a adherirse al deslizamiento varía mucho según el tipo de célula.
Para cada tipo de célula, determine empíricamente el tiempo de estabilización y la densidad de célula óptimos. Para obtener resultados consistentes, las células deben estar en una suspensión de una sola célula para adherir las células madre embrionarias del ratón en un portaobjetos. Comience rodeando el área de la diapositiva donde se verán las celdas.
Usando una pluma hidrofóbica, haya preparado una suspensión de 20 a 50.000 células por 80 a 100 microlitros en un medio de cultivo normal, agregue la suspensión celular en el círculo y deje que las células se adhieran durante unas tres horas en una incubadora humidificada. Después de la fijación del portaobjetos, fije las células sumergiendo suavemente el portaobjetos en 4%PFA durante 10 minutos. El portaobjetos debe estar plano en una bandeja como una caja de puntas.
Uso de reactivos a temperatura ambiente en frascos de coplan. Primero apague las células con cloruro de tris durante 10 minutos. En segundo lugar, permear las células con una mezcla de sapin y triton X 100 durante 10 minutos.
Ahora lave las celdas dos veces en PBS durante cinco minutos por lavado. Después de los lavados, incubar las células en glicerol al 20% durante al menos 20 minutos. En este punto, los portaobjetos se pueden almacenar en glicerol al 50% a menos 20 grados centígrados durante varias semanas.
El almacenamiento durante un día o más debería aumentar la intensidad de la señal. Asegúrese de equilibrar las células a temperatura ambiente en glicerol al 20% en PBS antes de continuar. Ahora, congele y descongele el portaobjetos tres veces con nitrógeno líquido.
Un tobogán a la vez cuando el sonido crepitante se detiene. Después de unos segundos, retire el portaobjetos y colóquelo en una toalla de papel para descongelarlo, espere a que desaparezca el glicerol congelado opaco antes de volver a congelar el portaobjetos, se pueden hacer hasta 15 portaobjetos cómodamente en rotación durante tres ciclos de congelación y descongelación. Ahora lave los portaobjetos dos veces en PBS durante cinco minutos por lavado.
A continuación, incubar los portaobjetos en ácido clorhídrico 0,1 molar durante 30 minutos. Siga el tratamiento con ácido clorhídrico con otro lavado de cinco minutos en PBS. Ahora vuelva a permear las células con una savia más fuerte y mezcle Triton X 100 durante 30 minutos para lavar los tensioactivos de los portaobjetos, use dos lavados de PBS de cinco minutos.
Las correderas ahora están listas para equilibrarse en forma de 50% amida en XSSC. Esto debía durar al menos 10 minutos mientras se equilibraba, se recuperaba la sonda pipeteada hacia arriba y hacia abajo varias veces y luego se transferían 10 microlitros por punto de celda a un cubreobjetos del tamaño adecuado. Retire un portaobjetos de la forma amida y seque el exceso de líquido alrededor de las células con una toalla de papel, pero no permita que la mancha celular se seque.
Ahora invierta la portada. Deslízate sobre el tobogán sobre las celdas. Selle el cubreobjetos a la corredera con cemento de caucho.
Deje que el cemento se seque por completo y mantenga el portaobjetos protegido de la luz. A continuación, caliente los portaobjetos a 78 grados centígrados durante exactamente dos minutos en una placa caliente. Esto es fundamental para funcionar correctamente.
Una cubierta debe proteger las células de la luz durante este paso para preservar la morfología nuclear tanto como sea posible. Es fundamental no dejar que las células se sequen y asegurarse de que el lugar de calor tenga la temperatura adecuada. A continuación, coloque los portaobjetos en una caja ligera y hermética con toallas de papel húmedas para proporcionar humedad e incube durante la noche a 37 grados centígrados.
Comience este procedimiento despegando el cemento de goma alrededor de los cubreobjetos. A continuación, coloque cada portaobjetos en X exceso de SC hasta que los deslizamientos de la cubierta se aflojen y se deslicen. A continuación, lavar los portaobjetos en forma de amida al 50% en dos x exceso de SC durante 15 minutos a 45 grados centígrados.
Mantenga una tapa en el baño de agua para protegerlos de la luz. A continuación, lave los portaobjetos en 0,2 XSSC durante 15 minutos a 63 grados centígrados. Luego dos XSSC durante cinco minutos a 45 grados centígrados, y finalmente al exceso de SE a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Los pasos restantes están todos a temperatura ambiente, comenzando con un lavado de cinco minutos y PBS ahora tiñe los portaobjetos con dappy durante dos minutos y luego detiene los portaobjetos con PBS durante cinco minutos. Para montar el cubreobjetos, aplique 10 microlitros de medio de montaje por punto de celda en el cubreobjetos del tamaño adecuado. A continuación, seca el exceso de PBS alrededor de la mancha celular sin dejar que las células se sequen.
Invierta la cubierta, deslícela sobre un portaobjetos y séllela con esmalte de uñas utilizando el protocolo de preparación de sondas para peces. Después de la traducción de la NIC, debería ser visible un frotis de ADN con la mayor parte de los fragmentos entre 150 y 700 pares de bases. Después del acoplamiento químico, la incorporación del tinte fluorescente se puede medir mediante el análisis espectroscópico del paso de la sonda.
Estos pasos de control de calidad para juzgar la calidad de la sonda son críticos mediante el uso de dicha sonda. Fue factible la obtención de imágenes automatizadas con un microscopio de epifluorescencia. Esto requiere señales de peces nítidas y fácilmente identificables con poco fondo.
Esta es una imagen de campo de visión sin procesar. Las siguientes imágenes representan núcleos que han sido identificados y analizados automáticamente. Varias distancias interalélicas e interlocus se muestran en la parte superior derecha y a ambos lados debajo de cada núcleo.
En esta ampliación, las manchas blancas representan los núcleos identificados por campo de visión. Estos histogramas muestran las distancias interalélicas máximas entre las señales verdes por encima y las señales rojas por debajo. Todos los datos provienen de células germinales P 20 con sondas ubicadas en diferentes cromosomas que cubren los genes HBB y HBA y un grupo de histonas.
Estos son ejemplos de núcleos hepáticos fetales teñidos con sondas traseras que cubren los genes mic y KC y Q1. A partir de estas imágenes, se pueden obtener las coordenadas nucleares de las señales de los peces y se pueden calcular las relaciones espaciales de las regiones genómicas. Las distancias interalélicas se representan como una fracción del radio del núcleo.
Las sondas rojas estaban significativamente más juntas que las sondas verdes en estos datos. La microscopía confocal, que requiere señales más intensas, también fue factible. Se utilizaron pilas de imágenes para el modelado 3D de las señales de los peces dentro de sus territorios cromosómicos.
Estas dos sondas en rojo y blanco están cerca de cada extremo del cromosoma de ratón siete, la pintura del cromosoma completo se muestra en verde. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar peces de ADN para investigar el posicionamiento espacial de loci genómicos específicos en células individuales. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que todo tratamiento puede afectar la arquitectura nuclear y es importante incluir un tratamiento adecuado.
Se pueden realizar otros métodos, como el inmunopez, para responder a preguntas adicionales como las relaciones espaciales entre genes y proteínas.
Visión general
Este artículo presenta un protocolo robusto para analizar la arquitectura nuclear utilizando FISH de ADN 3D con sondas fluorescentes marcadas directamente. El método permite la investigación de la organización espacial de los loci genómicos en células individuales.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Genómica
Antecedentes
- Entender la organización nuclear es crucial para dilucidar las interacciones genéticas.
- FISH de ADN 3D es una técnica poderosa para visualizar regiones genómicas.
- El protocolo es versátil y puede aplicarse a varios tipos de células.
- Las sondas marcadas directamente mejoran la intensidad de la señal para una mejor visualización.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método rápido y confiable para analizar la arquitectura nuclear.
- Facilitar el estudio de las interacciones funcionales entre genes.
- Proporcionar un protocolo aplicable a diferentes tipos de células.
Métodos utilizados
- Generación de sondas marcadas fluorescentemente para regiones genómicas específicas.
- Fijación y permeabilización celular para permitir el acceso de las sondas.
- Denaturación por calor e hibridación de sondas durante la noche.
- Visualización mediante microscopía de fluorescencia para evaluar el posicionamiento nuclear.
Principales resultados
- El protocolo resalta exitosamente regiones genómicas específicas en células individuales.
- La robustez y versatilidad del método se demuestran en diferentes tipos de células.
- Las señales brillantes de las sondas marcadas directamente mejoran las capacidades de detección.
- Se proporcionan conocimientos clave sobre la organización nuclear y las interacciones genéticas.
Conclusiones
- Este protocolo de FISH de ADN es una herramienta valiosa para los investigadores que estudian la arquitectura nuclear.
- Ofrece un enfoque confiable para investigar la organización espacial genómica.
- Las aplicaciones futuras pueden extenderse a varios campos de investigación biológica.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Robust 3D DNA FISH enables precise spatial mapping of genomic loci in single cells, supporting target validation through direct visualization of chromosomal architecture. This method enhances predictive confidence in early discovery by revealing functional gene interactions and nuclear organization patterns relevant to disease mechanisms. Its versatility across cell types and compatibility with high-throughput imaging positions it as a scalable tool for de-risking therapeutic hypotheses in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing spatial relationships between genes of interest.
- Operational Value: Provides reproducible nuclear positioning data to clarify pathway involvement and functional target engagement.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying loci with disease-relevant spatial configurations that correlate with gene regulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively measurable inter-allelic and inter-locus distances for objective assessment of genomic organization.
- Operational Value: Delivers robust, bright signals from directly labeled probes, enabling reliable automated imaging and reduced background noise.
- Scalability Value: Compatible with high-throughput workflows, allowing screening of multiple genomic regions across diverse cell models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains continuity from discovery to preclinical validation by preserving native nuclear architecture in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Reveals spatial alterations in genomic loci that may indicate pathogenic mechanisms, informing target selection.
- Predictive Confidence: Enables assessment of whether candidate therapeutics normalize aberrant nuclear organization, supporting go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows following target identification, providing spatial genomic data prior to lead optimization and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing whether gene loci co-localize in the nucleus, indicating potential regulatory interactions.
- Screening: Enables assay-ready, standardized nuclear imaging with quantitative distance metrics for comparing compound or genetic perturbations.
- Analytics: Generates measurable outputs such as inter-allelic distances as a fraction of nuclear radius, enabling statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by maintaining nuclear integrity in primary and stem cell models, supporting biomarker-aligned spatial assessments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for nuclear architecture studies across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, visual evidence of genomic spatial relationships in single cells.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized probe labeling, denaturation, and hybridization steps, minimizing variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking nuclear organization phenotypes to target validity, reducing late-stage biological attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on spatial genome organization data from relevant disease models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular probe design, nick-translation, and fluorescence microscopy for accurate signal detection.
- Dependent on access to hybridization ovens, fluorescence microscopes, and automated imaging systems for high-throughput application.
- Necessitates cross-team standardization of probe quality control and nuclear segmentation algorithms for consistent data interpretation.
- Adaptation across model systems may require optimization of permeabilization and denaturation conditions based on cell type and nuclear density.
- Practical limitations include probe size constraints for bright signal generation and the need for careful handling to preserve nuclear morphology during freeze-thaw cycles.
