Una plataforma automatizada versátil para Micro escala experimentos de estimulación celular

El objetivo general de este procedimiento es ensamblar y utilizar una plataforma basada en microfluídica semiautomatizada para cultivar y estimular pequeñas poblaciones de células y recuperar lisados celulares para análisis moleculares. Esto se logra primero estableciendo cultivos celulares a microescala en microcapilares recubiertos con fibronectina denominados cámaras de perfusión celular. El segundo paso consiste en conectar las cámaras de perfusión a un módulo de microfluídica digital o DMF, que proporciona un medio flexible para dirigir reactivos hacia y desde los cultivos celulares a microescala.

A continuación, el módulo DMF suministra el estímulo de interés a las cámaras de perfusión y las células se incuban con el estímulo durante un tiempo predeterminado de exposición. Finalmente, las células se lisan por medios químicos y los lisados se recuperan en el módulo DMF para su análisis molecular. Los lisados recuperados luego se analizan mediante R-T-P-C-R cuantitativa para caracterizar la respuesta transcripcional de la población celular al estímulo.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos convencionales de cultivo celular es que permite realizar estudios de estimulación celular utilizando pequeñas cantidades de células, así como pequeñas cantidades de reactivos. Nuestra investigación ha demostrado que el manejo preciso de células y reactivos a escala microscópica por parte de la plataforma minimiza la variabilidad entre experimentos. La plataforma también es muy versátil.

El módulo microfluídico digital puede dirigir células y reactivos hacia y desde las cámaras de perfusión con gran flexibilidad, de modo que los experimentos se pueden personalizar y reconfigurar rápida y fácilmente. Para comenzar, prepare una solución estéril de 50 microgramos por mililitro de fibronectina y utilice una bomba de jeringa de múltiples puertos para aspirar 30 microlitros de la solución en cada microcapilar con el fin de acelerar el recubrimiento de las superficies internas del microcapilar. Incube a 37 grados Celsius durante dos horas, luego retire y deseche la solución de fibronectina y deje secar los microcapilares a temperatura ambiente durante seis horas.

A continuación, conecte las microcapilares recubiertas con fibra o cámaras de perfusión a un tubo de policarbonato y el tubo a la bomba de jeringa utilizando conectores capite. La configuración mostrada aquí utiliza una bomba de jeringa con puerto de ayuda que soporta seis cámaras de perfusión. Utilizando cinta, fije el cuerpo de cada cámara de perfusión a un bloque calefactor y ajuste la temperatura del bloque a 37 grados Celsius.

Luego, sumerja los extremos abiertos de las cámaras de perfusión en un depósito que contenga células, suspendidas en medio de crecimiento fresco, distribuidas uniformemente a una concentración de un millón de células por mililitro. Instruya a la bomba de jeringa para que aspire 10 microlitros de la suspensión celular hacia cada cámara de perfusión. A continuación, retire los extremos abiertos de las cámaras de perfusión de la suspensión celular e instruya a la bomba de jeringa para que aspire suficiente aire y desplace los tapones líquidos hacia las secciones fijadas al bloque calefactor.

Deje que las células se adhieran a las superficies internas recubiertas con fibronectina de las cámaras de perfusión incubándolas a 37 grados Celsius durante una a dos horas. Mientras tanto, transfiera los extremos abiertos de las cámaras de perfusión a un nuevo reservorio que contenga medio de crecimiento fresco. Tras el período de adhesión, indique a la bomba de jeringa que envíe los tapones líquidos al desecho y luego aspire 10 microlitros de medio fresco hacia cada cámara de perfusión, seguidos de suficiente aire para colocar el medio fresco sobre las células adheridas.

Continúe incubando las células a 37 grados Celsius, cambiando el medio cada dos horas hasta que los cultivos estén suficientemente equilibrados y expandidos. Patrón. La placa inferior del módulo de DMF con 46 electrodos de óxido de indio y estaño. Mediante técnicas fotolitográficas estándar, recubra la placa inferior del módulo de DMF con cinco micrones de Lene C mediante deposición química de vapor, y luego aplique un recubrimiento por centrifugación con 50 nanómetros de Teflon af.

A continuación, recubra mediante centrifugado un sustrato de vidrio de óxido de estaño e indio no patroneado con 50 nanómetros de Teflon AF para usarlo como placa superior. Utilice marcos de compresión metálicos para fijar las placas en un molde polimérico con cavidades que mantengan un espaciado de 400 micrones entre las placas. Este espaciado, combinado con el tamaño del electrodo de actuación de 2,5 milímetros cuadrados, define el volumen de la gota como 2,5 microlitros por electrodo.

Luego, inserte microcapilares de transferencia recubiertos con teflón en el espacio entre las placas de DMF. Coloque cada uno de modo que se extienda desde el borde del electrodo de actuación correspondiente hasta el extremo opuesto de cada transferencia. En el microcapilar, fije un conector tipo capite.

A continuación, conecte los conectores eléctricos para suministrar voltaje a los electrodos de óxido de indio 10. Las secuencias de activación de los electrodos se automatizan mediante una interfaz electrónica controlada por computadora que ejecuta scripts predeterminados. Luego, llene los depósitos integrados de los módulos de DMF con los reactivos adecuados para la estimulación celular, lavado y lisis.

En algunos casos, lo mejor es cargar el estímulo directamente en una etapa posterior, justo antes de su uso, extrayéndolo de los reservorios integrados cargados, y dispensar microgotas en el módulo DMF. Pruebe y active las microgotas, incluyendo su transporte entre el módulo DMF y las microcapilares de transferencia. Blais. Primero, prepare el estímulo en medio fresco con F127 al 0,1 % en una concentración final de 100 microgramos por mililitro.

Luego, cargue entre 80 y 100 microlitros del estímulo en su depósito integrado designado. A continuación, retire los extremos abiertos de las cámaras de perfusión del depósito de medio e insértelos en los conectores capilares fijados en los extremos de los microcapilares de transferencia; luego, indique a la bomba de jeringa que envíe los tapones líquidos dentro de las cámaras de perfusión al recipiente de desecho. A continuación, indique al módulo DMF que genere gotas de 10 microlitros del estímulo y que las entregue a las cámaras de perfusión mediante los microcapilares de transferencia.

Incube las células con el estímulo a 37 grados Celsius durante una a cuatro horas, si es necesario. Cambie al estímulo fresco a intervalos regulares tras el período de estimulación. Instruya a la bomba de jeringa para enviar el estímulo al recipiente de desecho e instruya al módulo DMF para entregar una gota de 10 microlitros de tampón de lavado a cada cámara de perfusión.

Incube las células con el tampón de lavado durante cinco minutos. Luego, sustituya el tampón de lavado por 10 microlitros de solución de lisis e incube durante cinco minutos adicionales. A continuación, indique a la bomba de jeringa que envíe cada lisado celular al módulo DMF.

Retire la placa superior del módulo DMF teniendo cuidado de no inclinarla lateralmente, ya que esto puede provocar contaminación cruzada entre las gotas. Finalmente, recoja los lisados del módulo DMF abierto utilizando un pipetador manual para análisis fuera de la plataforma, como la cuantificación de la expresión génica mediante R-T-P-C-R cuantitativa, con el fin de preparar la plataforma para el siguiente experimento. Primero, sumerja las microcapilares de transferencia, los conectores CAPITE y las placas del módulo DMF en lejía al 10 % durante 10 minutos a temperatura ambiente; luego, se enjuagan las placas del módulo DMF con isopropanol, seguido de agua desionizada, y se secan con gas nitrógeno, seguido de un horneado a 160 grados Celsius durante 10 minutos.

Los métodos de siembra descritos en este protocolo dieron como resultado la adhesión de aproximadamente 500 macrófagos miren por cámara de perfusión. Después de incubar las células con medio de crecimiento a 37 grados Celsius durante 16 horas, el tamaño de la población se duplicó hasta alcanzar aproximadamente 1000 células por cámara de perfusión. Aquí se muestran los resultados del análisis cuantitativo de R-T-P-C-R de cuatro genes conocidos por desempeñar funciones importantes en las respuestas inmunitarias innatas contra bacterias.

Los macrófagos se cultivaron en cultivos convencionales o en escala microscópica y se estimularon con partículas biológicas de e coli durante una o cuatro horas. Las barras azules indican el aumento promedio en el número de veces de la expresión génica tras la estimulación de células cultivadas convencionalmente, mientras que las barras rojas indican la expresión inducida en células cultivadas y estimuladas. En los cultivos en escala microscópica, las barras de error indican las desviaciones estándar entre réplicas biológicas de tres experimentos independientes.

Los resultados del perfilado de la expresión génica fueron muy similares, aunque los cultivos convencionales utilizaron placas de 96 pocillos con aproximadamente 50.000 células por pocillo, mientras que los cultivos a microescala emplearon microcapilares con aproximadamente 1000 células por cámara de perfusión. La variabilidad entre experimentos fue al menos comparable y a menudo menor en los cultivos a microescala, como lo indican las barras de error más cortas. Se logró una reducción en el consumo de células en un factor de cinco y una disminución en el consumo de reactivos entre tres y 50 veces en comparación con los experimentos convencionales.

El método podría utilizarse para cultivar prácticamente cualquier tipo de célula adherente, en algunos casos utilizando un componente diferente de la matriz extracelular o medio de crecimiento. Los tipos de células no adherentes pueden resultar difíciles, pero las estrategias de anclaje celular han demostrado ser exitosas en contextos similares. El enfoque descrito aquí permite el cultivo a escala microscópica durante hasta 24 horas.

La plataforma incluye todas las funciones necesarias para realizar cultivos a largo plazo también, pero es necesario desarrollar un protocolo de subcultivo celular. Módulos adicionales pueden integrarse en el cubo de microfluídica digital a través de interconexiones microcapilares. De este modo, la DMF sirve como centro central para conectar los módulos periféricos y llevar a cabo flujos de trabajo complejos.

Nos centramos principalmente en caracterizar las respuestas transcripcionales del huésped frente a agentes infecciosos, pero la plataforma está diseñada para ser extremadamente versátil y, por lo tanto, debería apoyar una amplia variedad de aplicaciones de investigación.