Una plataforma automatizada versátil para Micro escala experimentos de estimulación celular

El objetivo general de este procedimiento es ensamblar y utilizar una plataforma semiautomatizada basada en microfluidos para cultivar y estimular pequeñas poblaciones de células y recuperar lisados celulares para análisis moleculares. Esto se logra estableciendo primero cultivos celulares a microescala en microcapilares recubiertos de fibronectina denominados cámaras de perfusión celular. El segundo paso es conectar las cámaras de perfusión a un módulo de microfluídica digital o DMF, que proporciona un medio flexible por el cual los reactivos se dirigen hacia y desde los cultivos celulares a microescala.

A continuación, el módulo DMF entrega el estímulo de interés a las cámaras de perfusión y las células se incuban con el estímulo durante un tiempo de exposición predeterminado. Finalmente, las células se lisan por medios químicos y los lisados se recuperan en el módulo DMF para su análisis molecular. A continuación, los lisados recuperados se analizan utilizando R-T-P-C-R cuantitativo para caracterizar la respuesta transcripcional de la población celular al estímulo.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos convencionales de cultivo celular, es que es posible que con esta técnica se puedan hacer estudios de estimulación celular utilizando pequeñas cantidades de células, y también utilizar pequeñas cantidades de reactivos. Nuestra investigación ha demostrado que el manejo preciso de las células y los reactivos de la plataforma a microescala minimiza la variabilidad de un experimento a otro. La plataforma también es muy versátil.

El módulo digital de microflujo puede dirigir células y reactivos hacia y desde las cámaras de perfusión con gran flexibilidad, de modo que los experimentos se pueden personalizar y reconfigurar de forma rápida y sencilla. Para comenzar, prepare una solución estéril de 50 microgramos por mililitro de fibronectina y use una bomba de jeringa multipuerto para extraer 30 microlitros de la solución en cada microcapilar para acelerar el recubrimiento de las superficies internas de los microcapilares. Incubar a 37 grados centígrados durante dos horas, luego retirar y desechar la solución de fibronectina y dejar que los microcapilares se sequen a temperatura ambiente durante seis horas.

A continuación, conecte los microcapilares o cámaras de perfusión recubiertos de fibra nin al tubo de policarbonato y el tubo a la bomba de jeringa mediante accesorios de capite. La configuración que se muestra aquí utiliza una bomba de jeringa con puerto de ayuda que soporta seis cámaras de perfusión. Con cinta adhesiva, asegure el cuerpo de cada cámara de perfusión a un bloque de calor y ajuste la temperatura de los bloques de calor a 37 grados centígrados.

A continuación, sumerja los extremos abiertos de las cámaras de perfusión en un depósito que contenga células, suspendidas en crecimiento fresco, dispersas uniformemente en un medio a una concentración de 1 millón de células por mililitro. Indique a la bomba de jeringa que extraiga 10 microlitros de la suspensión celular en cada cámara de perfusión. A continuación, retire los extremos abiertos de las cámaras de perfusión de la suspensión de la celda e indique a la bomba de jeringa que extraiga suficiente aire para mover los tapones de líquido a las secciones aseguradas al bloque de calor.

Permita que las células se adhieran a las superficies interiores recubiertas de fibronectina de las cámaras de perfusión incubándolas a 37 grados centígrados durante una o dos horas. Mientras tanto, transfiera los extremos abiertos de las cámaras de perfusión a un nuevo depósito que contenga medio de crecimiento fresco. Después del período de adhesión, indique a la bomba de jeringa que envíe los tapones líquidos a la basura y luego extraiga 10 microlitros de medio fresco en cada cámara de profusión, seguido de suficiente aire para colocar el medio fresco sobre las células adheridas.

Continúe incubando las células a 37 grados centígrados, intercambiando el medio cada dos horas hasta que los cultivos estén lo suficientemente equilibrados y expandidos. Patrón. La placa inferior del módulo DMF con 46 electrodos de óxido de indio y estaño. Utilizando técnicas fotolitográficas estándar, recubra la placa inferior del módulo DMF con cinco micras de Lene C mediante deposición química de vapor y, a continuación, reboce la capa de centrifugado con 50 nanómetros de teflón af.

A continuación, capa de centrifugación y sustrato de vidrio de óxido de indio y estaño sin patrón con 50 nanómetros de Teflon AF que se utilizará como placa superior. Utilice marcos de compresión metálicos para fijar las placas en un fundido de polímero con huecos que mantengan un espacio de 400 micras entre las placas. Este espaciado, combinado con el tamaño del electrodo de accionamiento de 2,5 milímetros cuadrados, define el volumen de gotas como 2,5 microlitros por electrodo.

A continuación, inserte los microcapilares de transferencia recubiertos de teflón en el espacio entre las placas DMF. Colocando cada uno de modo que se extienda hasta el borde de su electrodo de accionamiento afín hasta el extremo opuesto de cada transferencia. Fijación microcapilar de un accesorio capite.

A continuación, conecte los conectores eléctricos para suministrar voltaje a los electrodos de óxido de indio 10. Las secuencias de activación de electrodos se automatizan mediante el uso de una interfaz electrónica controlada por computadora que ejecuta scripts predeterminados. A continuación, llene los módulos DMF integrados en los depósitos con los reactivos adecuados para la estimulación, el lavado y la lisis celular.

En algunos casos, es mejor cargar el estímulo en un paso posterior, justo antes de su uso, extrayendo de los depósitos integrados cargados, dispensando microgotas en el módulo DMF. Prueba, accionamiento de las micro gotas, incluido su transporte entre el módulo DMF y los micro capilares de transferencia. Blais. En primer lugar, prepare el estímulo en medio fresco con 0,1%onic F1 27 a una concentración final de 100 microgramos por mililitro.

A continuación, cargue de 80 a 100 microlitros del estímulo en el depósito designado a bordo. A continuación, retire los extremos abiertos de las cámaras de perfusión del depósito de medio e insértelos en los accesorios de capita fijados a los extremos de los microcapilares de transferencia, luego indique a la bomba de jeringa que envíe los tapones de líquido dentro de las cámaras de perfusión al contenedor de residuos. A continuación, indique al módulo DMF que genere 10 gotas de estímulo de microlitros y las entregue a las cámaras de perfusión a través de los microcapilares de transferencia.

Incubar las células con el estímulo a 37 grados centígrados durante una a cuatro horas si es necesario. Intercambio por estímulos frescos a intervalos regulares después del período de estimulación. Indique a la bomba de jeringa que envíe el estímulo al contenedor de residuos e instruya al módulo DMF para que entregue una gota de 10 microlitros de tampón de lavado a cada cámara de perfusión.

Incubar las células con el tampón de lavado durante cinco minutos. A continuación, cambie el tampón de lavado por 10 microlitros de solución de lisis e incube durante cinco minutos más. A continuación, indique a la bomba de jeringa que envíe cada lisado de célula al módulo DMF.

Retire la placa superior del módulo DMF teniendo cuidado de no inclinar la placa hacia los lados, ya que esto puede provocar una contaminación cruzada entre las gotas. Por último, recoja los lisados del módulo DMF abierto utilizando un hombre de pipetas para el análisis fuera de la plataforma, como la expresión génica, la elaboración de perfiles a través de R-T-P-C-R cuantitativo para preparar la plataforma para el siguiente experimento. Primero, sumerja los microcapilares de transferencia, los accesorios CAPITE y las placas del módulo DMF en lejía al 10% durante 10 minutos a temperatura ambiente, las placas del módulo DMF se enjuagan con isopropanol seguido de agua desionizada y se secan con gas nitrógeno, y luego hornean a 160 grados centígrados durante 10 minutos.

Los métodos de siembra descritos en este protocolo dieron como resultado una adherencia de aproximadamente 500 macrófagos miren por cámara de perfusión. Después de incubar las células con medio de crecimiento a 37 grados centígrados durante 16 horas, el tamaño de la población se duplicó a aproximadamente 1000 células por cámara de perfusión. A continuación se muestran los resultados del análisis cuantitativo R-T-P-C-R de cuatro genes que se sabe que desempeñan un papel importante en las respuestas inmunitarias innatas a las bacterias.

Los macrófagos se cultivaron en cultivos convencionales o a microescala y se estimularon con biopartículas de E. coli durante una o cuatro horas. Las barras azules indican el aumento medio de la expresión génica tras la estimulación de células cultivadas convencionalmente, mientras que las barras rojas indican la expresión inducida en células cultivadas y estimuladas. En cultivos a microescala, las barras de error indican desviaciones estándar entre las réplicas biológicas de tres experimentos independientes.

Los resultados del perfil de expresión génica fueron muy similares, a pesar de que los cultivos convencionales utilizaron placas de 96 pocillos con aproximadamente 50.000 células por pocillo, mientras que los cultivos a microescala utilizaron microcapilares con aproximadamente 1000 células por experimento de cámara de perfusión para experimentar la variabilidad fue al menos comparable y a menudo reducida en cultivos a microescala, como lo indican las barras de error más cortas que trabajan a microescala. Se redujo el consumo de celdas en cinco veces y el consumo de reactivos de tres a 50 veces. En relación con los experimentos convencionales.

El método podría utilizarse para cultivar, prácticamente cualquier tipo de célula de adherencia, en algunos casos utilizando un componente de matriz extracelular diferente o de crecimiento. Los tipos de células con falta de adherencia media pueden ser un desafío, pero las estrategias de anclaje celular han demostrado ser exitosas en contextos similares. El enfoque descrito aquí admite el cultivo a microescala durante un máximo de 24 horas.

La plataforma también incluye todas las funciones para hacer un cultivo a largo plazo, pero es necesario desarrollar un protocolo de paso celular. Se pueden integrar módulos adicionales en el cubo microfluídico digital a través de las interconexiones microcapilares. De esta manera, el DMF sirve como un eje central para conectar los módulos periféricos para llevar a cabo flujos de trabajo complejos.

Nos centramos principalmente en caracterizar las respuestas transcripcionales del huésped a los agentes infecciosos, pero la plataforma está diseñada para ser extremadamente versátil y, por lo tanto, debería admitir una amplia variedad de aplicaciones de investigación.