La manipulación genética en

El objetivo general de este procedimiento es lograr un reemplazo genético eficiente y confiable utilizando cepas tipo uno y tipo dos delta dos 80 de Toxoplasmic ndii. Esto se consigue primero mediante la construcción de una molécula de ADN de direccionamiento que fusione el marcador selectivo HX GPRT en orientación directa entre extremos de ADN de direccionamiento génico cinco prima y tres prima distintos. El segundo paso del procedimiento consiste en transfectar la molécula de ADN de direccionamiento en una cepa de toxoplasma DYI tipo uno o tipo dos.

El tercer paso consiste en seleccionar pacientemente los eventos de recombinación homóloga de doble cruce y aislar clones individuales. El paso final es validar la presencia del evento de direccionamiento génico en los clones mutantes aislados. En última instancia, los resultados de este procedimiento pueden mostrar la función de los genes del parásito mediante el análisis de eliminaciones dirigidas de genes, reemplazos génicos y genes marcadores a través de diversas aplicaciones posteriores.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes que utilizan cepas de tipo salvaje de este parásito es que los fondos genéticos tipo uno y tipo dos delta dos 80 permiten ahora una selección extremadamente confiable de eventos de recombinación homóloga por doble recombinación cruzada dirigida para producir cepas genéticamente definidas con precisión. Esta técnica acelerará considerablemente el descubrimiento de nuevos blancos para la terapia farmacológica con antitoxinas en plasma y el desarrollo de cepas de vacunas atenuadas seguras y eficaces, especialmente cuando se combina con los recursos genómicos bien diseñados disponibles en línea en @toxodb.org. En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades para diseñar moléculas de ADN dirigidas o realizar manipulaciones genéticas con Toxoplasma gondii.

Sin embargo, la práctica clínica y el diseño de moléculas de direccionamiento fiables garantizarán el éxito. Comience el protocolo amplificando por PCR los extremos genómicos de direccionamiento cinco prime y tres prime para el gen de interés a partir de ADN genómico. Luego, amplifique por PCR el marcador seleccionable HX GPRT con sus extremos DHFR cinco prime y tres prime a partir del casete mini génico HX GPRT CD NA.

Utilice la recombinación en levadura o un método similar para fusionar las moléculas de ADN 3D en su orientación correcta de cinco prima a tres prima con el plásmido PRS cuatro 16, generando así el plásmido p delta GOI que dirigirá la eliminación en el gen de interés. A continuación, prepare una muestra de 100 microlitros que contenga entre 15 y 30 microgramos del plásmido diana linearizado para la transfección en T gia 68 a 72 horas después de inocular un matraz de 25 centímetros cuadrados con células HFF confluentes. Verifique la presencia de parásitos recién lisados mediante confirmación visual de que entre el 90 y el 95 % de las células HFF han sido lisadas; los parásitos viables son esenciales para la localización génica.

Agite los parásitos viables en solución agitando vigorosamente el frasco cerrado sin salpicar líquido en el interior de la tapa ni en el cuello del frasco. Recoge los parásitos del frasco y prepáralos para la transfección según se describe en el protocolo escrito. Electroporar el plásmido de direccionamiento en la cepa delta CO 80 de toxoplasma.

Transfiera la mezcla electro porada a un frasco de 150 centímetros que contenga células HFF confluentes y 30 mililitros de medio de infección. Incube la cultura infectada durante la noche a 37 grados Celsius, aproximadamente 20 horas después de la transfección. Reemplace el medio con medio de selección MPA más X.

Ahora, deje que los parásitos se incuben a 37 grados Celsius durante aproximadamente ocho días sin perturbarlos. Una vez que sean visibles las placas, agite el frasco para desprender los parásitos extracelulares de la monocapa, obteniendo así una solución de parásitos. Transfiera aproximadamente medio mililitro de la solución de parásitos a un nuevo frasco de 25 centímetros con células HFF confluentes que contengan cinco mililitros de medio de selección MPA más X.

Designe este cultivo como PAs uno A aproximadamente tres días después. Repita la transferencia de medio mililitro de la solución de parásitos desde el matraz original a otro matraz de células HFF con el mismo medio de selección. Designe este cultivo como PAs uno B durante los siguientes cinco días.

El pase uno A y uno B para pfu. Seleccione ya sea el pase uno A o uno B para subclonación según un número adecuado de más de 25 zonas de infección. Cada vez que los parásitos lisen las células HFF, pase el cultivo a un nuevo matraz de 25 centímetros con células HFF confluentes utilizando medio de selección; tres semanas después de la transfección, subclone parásitos recién aparecidos diluyendo los parásitos a la concentración adecuada en medio MPA más X, y distribuyendo uniformemente la solución parasitaria en una placa de 96 pocillos que contenga células HFF confluentes.

Prepare una placa a una concentración de un parásito por pocillo y prepare una segunda placa a una concentración de dos parásitos por pocillo. Incube ambas placas a 37 grados Celsius a partir de la fecha original de la transfección. No subclone los parásitos antes del día 20 para los parásitos de tipo uno ni antes del día 25 para los parásitos de tipo dos.

Continúe pasando el matraz de 25 centímetros según un programa semanal, como se describe en el texto en línea, hasta que la cepa de eliminación genética haya sido validada. Después de aproximadamente una semana, examine las placas de 96 pocillos con un aumento de 40 a 60 veces. Seleccione únicamente los pocillos que contengan una sola UFP, identificada como una única zona de infección, utilizando una pipeta ajustada a 50 microlitros.

Mezcle el contenido de estos pocillos dirigiendo el flujo de líquido sobre las UFP para dispersar los parásitos alrededor del pocillo. Cuatro o cinco días después de mezclar los pocillos seleccionados, elija una docena de clones con células lisadas. Transfiera 12 clones de la placa de 96 pocillos a 12 pocillos de una placa de 24 pocillos. Haga esto rayando con la punta de una pipeta el fondo del pocillo y aspirando seis microlitros.

Transfiera la solución a un pocillo de una placa de 24 pocillos con células HFF confluentes en un mililitro de medio MPA más selección X. Incube la placa de 24 pocillos a 37 grados Celsius y supervise la lisis de las células HFF. Pase los parásitos de un pocillo lisado en la placa de 24 pocillos según un horario semanal.

Utilice la técnica de rayar y dibujar para transferir dos microlitros de la solución de parásitos a una nueva placa con MPA y selección X. Después del paso, recoja los parásitos de la placa original de 24 pozos y transfiéralos a tubos pequeños para la recolección de ADN.

Para finalizar, utilice PCR para comprobar la eliminación del gen de interés y verificar la integración de los extremos diana cinco prima y tres prima. Y para comprobar la presencia del marcador selectivo HX GPRT. Este protocolo es para la eliminación del marcador HX GPRT del cepa delta Q 80 manipulada y se describe en el texto en línea.

P delta GOYC dirige la eliminación de HX GPRT del parásito mediante selección negativa utilizando seis medios TX. Luego, se utiliza PCR para confirmar la pérdida de HX GPRT, evidenciada por una banda de 1,2 pares de kilobases donde HX GPRT no fue eliminado del locus. Existe una banda de 3,4 pares de kilobases.

La parte final de este protocolo, la etiquetación en el extremo C terminal de proteínas, también se describe en detalle en el texto en línea. Después de seguir el protocolo descrito para realizar una eliminación dirigida de un gen, se utilizó PCR para validar la eliminación de un knockout del tipo uno R 18, un gen generalmente difícil de dirigir. La PCR uno muestra la ausencia del producto de amplificación del gen R 18.

La PCR dos muestra la presencia del flanco genómico de unión en el extremo tres prima R 18; las PCR tres y cuatro muestran la presencia del marcador seleccionable integrado correctamente entre los flancos genómicos de unión en los extremos cinco prima y tres prima, lo que define la eliminación de R 18. Con el fin de reutilizar el marcador seleccionable para realizar eliminaciones sucesivas en una cepa, primero debe eliminarse el HX GPRT original del locus. Después de seguir el protocolo descrito.

Se eliminó HX GPRT del locus GRA dos eliminado en la cepa delta dos 80 delta GRA dos HX.G-P-R-T-P-C-R, que se utilizó para confirmar la pérdida de HX GPRT, evidenciada por una banda de 1,2 KILOBASE. Cuando H-X-G-P-R-T no se eliminó, se observó una banda de 3,4 kilobase tras el paso inicial de localización génica. Se pueden aplicar métodos adicionales de localización génica para construir múltiples eliminaciones en la misma cepa tipo uno o tipo dos, o para etiquetar o complementar una cepa mutante con el fin de responder preguntas adicionales, como, ¿dónde se localiza esta proteína en la célula?

O ¿cuál es el dominio clave o la actividad de esta proteína o vía que explica su función biológica? Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo aumenten la exploración de la función génica de parásitos en el complejo AP modelo y en el parásito Toxoplasma. Gandhi eye.

No olvide que trabajar con toxoplasma puede ser peligroso y que deben tomarse precauciones, como seguir todas las normas del nivel de seguridad biológica dos, durante todo el procedimiento.