Name: Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Aprende a crear nanosensores de pH y andamios de autoinforme para monitorear en tiempo real el crecimiento celular en cultivos tridimensionales. Esta técnica no invasiva mejora la comprensión de las condiciones microambientales.

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Se agradece la financiación del BBSRC (número de subvención BB H011293/1).

Resumen
La sección 1 describe la preparación de nanosensores sensibles al pH y la caracterización de la respuesta de los nanosensores al pH utilizando espectrometría de fluorescencia y su tamaño utilizando SEM.
La sección 2 describe la preparación de andamios de polímero electrohilado y la caracterización de su morfología y tamaño utilizando SEM. La sección 2 también describe la preparación de andamios autoinformados, que son andamios electrohilados con la inclusión de los nanosensores sensibles al pH. Los andamios autoinformados resultantes se caracterizan mediante SEM para evaluar si se han producido cambios morfológicos en las fibras electrohiladas. La fluorescencia de los andamios autoinformados resultantes de los nanosensores incorporados se evalúa mediante microscopía confocal.
La sección 3 describe el cultivo de células en el andamio electrohilado y el andamio autoinformado. Los andamios se esterilizan primero en preparación para el cultivo celular, tras lo cual se evalúan los andamios para determinar si la esterilización y el cultivo de células afectan a la capacidad de fluorescencia de los andamios autoinformados. El protocolo también describe la entrega de nanosensores a células que se cultivan en andamios electrohilados. El colorante Lysotracker se utiliza para garantizar que los nanosensores no se hayan llevado a compartimentos ácidos celulares.
1. Preparación y análisis de nanosensores Sol-gel sensibles al pH
1.1 Preparación de Nanosensores Sol-gel sensibles al pH
Nota: Esta preparación debe realizarse en una campana extractora.
<ol>
	<li>Prepare los fluoróforos para su uso en los nanosensores de pH disolviendo 5-(y-6)-carboxifluoresceína, éster de succinimidilo (FAM-SE) (1,5 mg) en dimetilformamida (DMF) (1 ml) en un matraz de fondo redondo y 6-carboxitetrametilrodamina, éster de succinimidilo (TAMRA-SE) (1,5 mg) en DMF (1 ml) en otro matraz de fondo redondo. Añadir 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) (1,5 mL) a cada matraz y agitar bajo una atmósfera de nitrógeno seco (21 °C) durante 24 horas en la oscuridad, es decir, envolver las muestras en papel de aluminio.</li>
	<li>Añadir los dos colorantes anteriores (250 μl) a una mezcla de etanol (6 ml) e hidróxido de amonio (30 % en peso, 4 ml) contenida en un matraz de fondo redondo y agitar durante 1 hora (21 °C).</li>
	<li>Agregue lentamente tetraetiloto ortosilicato (TEOS) (0,5 ml) a la mezcla, continúe revolviendo durante 2 horas más. La mezcla se volverá turbia. Los nanosensores se pueden recoger por evaporación rotativa. Los nanosensores pueden almacenarse en un vial de vidrio a 4 oC para su uso futuro. ATENCIÓN: la manipulación posterior de los nanosensores en su forma seca debe realizarse en una campana extractora o, en el caso de pesarlos, la balanza debe estar encerrada, por ejemplo, en una pesadora.</li>
</ol>
1.2 Respuesta del nanosensor al pH
<ol>
	<li>Prepare las soluciones tampón de fosfato de Sørensen con un pH comprendido entre 5,5 y 8,0 mezclando proporciones específicas de soluciones madre de fosfato de sodio monobásico (0,2 M) y fosfato de sodio dibásico (0,2 M). Compruebe el pH final con un medidor de pH. Realice cualquier ajuste menor en el pH utilizando hidróxido de sodio (NaOH) (4 M) o ácido clorhídrico (HCl) (2 M).</li>
	<li>Suspenda los nanosensores de pH en los tampones de pH (5 mg/ml) sujetando primero el recipiente que contiene la solución del nanosensor en un vórtice durante 3 minutos y, a continuación, sumergiendo el recipiente en un ultrasonido hasta que la solución se vuelva turbia (aproximadamente 5 min). Repita estos pasos para suspender completamente los nanosensores en solución.</li>
	<li>Coloque la primera solución en una cubeta óptica y utilice longitudes de onda de excitación de 488 nm para la 5-(y-6)-carboxifluoresceína (FAM) y de 568 nm para la 6-carboxitetrametilrodamina (TAMRA). Recoja las longitudes de onda de emisión a 500-530 nm para FAM y 558-580 nm para TAMRA utilizando un espectrómetro de fluorescencia.</li>
	<li>Cambie las soluciones en la cubeta óptica para que el pH se pueda observar a diferentes pH y continúe recopilando los espectros de emisión.</li>
	<li>Calcule la relación de los máximos de emisión producidos en cada valor de pH para producir una curva de calibración.</li>
</ol>
1.3 SEM de Nanosensores
<ol>
	<li>Coloque una muestra de los nanosensores en un trozo de microscopio electrónico recubierto de carbono y rocíe con oro durante 5 minutos bajo una atmósfera de argón.</li>
	<li>Observación mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Durante la toma de imágenes, ajuste la distancia de trabajo, el voltaje y el aumento para minimizar la carga de electrones (Figura 1).</li>
</ol>
2. Preparación y análisis de andamios PLGA
2.1 Andamios PLGA de electrospinning
<ol>
	<li>En una campana extractora, disuelva el poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) en diclorometano (DCM) (20% (p/p)) con formiato de piridinio (PF) (1% (p/p)). Coloque la solución en una jeringa de 10 ml con una aguja de llenado romo de 18 G y colóquela firmemente en una bomba de jeringa.</li>
	<li>Distancia la punta de la aguja a 20 cm de una placa colectora de aluminio de 20 cm x 15 cm.</li>
	<li>Conecte el electrodo de una fuente de alimentación de alto voltaje a la punta de la jeringa y la tierra a la placa colectora de aluminio.
	 PRECAUCIÓN: Se debe tener cuidado ya que se utiliza alto voltaje, es decir, siempre apague el suministro eléctrico antes de manipular cualquiera de los equipos de electrohilado.</li>
	<li>Suministre la solución utilizando un caudal constante de 3,5 m/h a 12 kV durante 2 horas. El electrohilado utilizando estas condiciones dará una profundidad de andamio de aproximadamente 60 μm.</li>
	<li>Deje el andamio en una campana extractora durante 24 horas para permitir que se evaporen los residuos de solvente.</li>
</ol>
2.2 Andamios PLGA sensibles al pH de electrohilado
<ol>
	<li>Preparar andamios que incorporen nanosensores sensibles al pH como se describe en la sección 2.1, pero con la modificación de añadir nanosensores a la solución polimérica (5 mg/ml). Suspenda los nanosensores en la solución de PLGA con la ayuda de ultrasonidos (aproximadamente 5 min) antes de colocarlos en una jeringa de 10 ml.</li>
</ol>
2.3 SEM de andamio PLGA y andamio sensible al pH
<ol>
	<li>Coloque una muestra del andamio PLGA o andamio sensible al pH en un trozo de microscopio electrónico recubierto de carbono y proceda como se describe para SEM de nanosensores (Figura 1).</li>
</ol>
2.4 Calibración del andamio sensible al pH
<ol>
	<li>Coloque una muestra de andamio sensible al pH en una placa de cultivo de 35 mm y sumérjala en soluciones tampón adecuadas.</li>
	<li>En un microscopio confocal, utilice un láser de argón de 488 nm para excitar el FAM y un láser de criptón de 568 nm para excitar el TAMRA dentro de los nanosensores. Observe la emisión de fluorescencia para andamios sensibles al pH a 500-530 nm para FAM y 558-580 nm para TAMRA. (Figura 2). Utilice el escaneo secuencial para evitar la acumulación de longitudes de onda de excitación.</li>
</ol>
3. Cultivo celular sobre andamios PLGA y andamios PLGA sensibles al pH
Nota: Lo siguiente debe realizarse en un gabinete de cultivo celular.
3.1 Preparación de andamios PLGA para cultivo celular
<ol>
	<li>Corte los andamios PLGA o PLGA sensibles al pH en2 piezas de 2 cm.</li>
	<li>Esterilice los andamios irradiándolos con luz ultravioleta (UV) a una distancia de 8 cm durante 15 minutos por cada lado.</li>
	<li>Transfiera los andamios a una placa de cultivo de 12 pocillos y coloque un anillo de acero en la parte superior. Añadir una solución de penicilina/estreptomicina (5% v/v) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en el interior y exterior del anillo de acero, incubar durante la noche (37 °C, 5% CO2). Tenga en cuenta que el anillo de acero fue fabricado en la Universidad de Nottingham y tiene las siguientes dimensiones: 2 cm de diámetro exterior, 1 cm de diámetro interior, 1 cm de profundidad.</li>
	<li>Retire la solución esterilizante y lave con PBS.</li>
	<li>Añadir medios de cultivo celular en el interior (500 μl) y en el exterior (500 μl) del anillo de acero, colocar en una incubadora (37 °C, 5% CO2) mientras se prepara una suspensión celular.</li>
	<li>Prepare una suspensión celular y realice un recuento de células utilizando un ensayo de exclusión de azul de tripano.</li>
	<li>Cree una suspensión celular para lograr un número de celdas de 1 x 106 células/ml.</li>
	<li>Retire los medios del interior y el exterior del anillo de acero.</li>
	<li>Reemplácelo con medios de cultivo celular precalentados en el exterior del anillo de acero (1 m).</li>
	<li>Agregue 300 μl de la suspensión de celdas al interior del anillo de acero: la placa de roca retrocede y avanza suavemente para distribuir las celdas.</li>
	<li>Coloque la placa de cultivo celular en una incubadora (37 °C, 5% CO2): la unión de las células debe haberse realizado dentro de las 24 horas, sin embargo, continúe el cultivo durante el tiempo que requiera el experimento, actualizando el medio cada 2-3 días.</li>
</ol>
3.2 Entrega de nanosensores a células cultivadas en andamio PLGA
<ol>
	<li>Células de siembra en andamio de PLGA como se describe en la sección 3.1. Para este estudio se utilizó un andamio PLGA en blanco (que no contiene nanosensores) debido a la superposición de la emisión de fluorescencia durante la toma de imágenes.</li>
	<li>Coloque el andamio sembrado con células en una incubadora (37 °C, 5% CO2) durante 72 horas para permitir que las células crezcan y migren por todo el andamio antes de la administración del nanosensor.</li>
	<li>Antes de la administración del nanosensor, lave las células con PBS y cambie el medio de cultivo estándar a un medio libre de antibióticos y suero, incube (37 °C, 5% CO2) durante 1 hora. Nota: el medio de cultivo estándar para células 3T3 se compone de medio de Dulbecco Modified Eagle suplementado con suero de ternera fetal (10% (v/v)), solución de L-glutamina (2 mM), penicilina/estreptomicina (1% (v/v)).</li>
	<li>Durante el período de incubación, prepare el complejo nanosensor-liposoma sonicando brevemente nanosensores (5 mg) con Optimem (50 μl) para crear la solución A.</li>
	<li>Cree la solución B añadiendo Lipofectamine 2000 (5 μl) a Optimem (45 μl), incube a temperatura ambiente durante 5 min.</li>
	<li>Agregue la solución A a la solución B, incube a temperatura ambiente durante 20 minutos para formar la solución C, que es el complejo nanosensor-liposomado.</li>
	<li>Añadir la solución C (100 μl) a las células e incubar (37 °C, 5% CO2) durante 3 horas.</li>
	<li>Retire los andamios sembrados de células de la incubadora, aspire el medio y lávese dos veces con PBS antes de agregar PBS (1 ml) para permitir la visualización de células vivas por microscopía confocal. Nota: En este protocolo se utilizó PBS para que el indicador de rojo de fenol presente en los medios de cultivo celular no causara autofluorescencia y también porque se estaba realizando una calibración a pH diferente. Sin embargo, los medios libres de rojo de fenol podrían utilizarse para el análisis a largo plazo de cultivos celulares.</li>
	<li>Sumerja el andamio sembrado en tampones de diferentes pH y controle la respuesta de los nanosensores asociados con las células.</li>
	<li>Monitorizar el pHi determinando la relación entre las intensidades de fluorescencia de FAM y TAMRA mediante la observación de la fluorescencia mediante microscopía confocal (Figura 3).</li>
</ol>
3.3 Ubicación de nanosensores dentro de células de mamíferos
<ol>
	<li>Incubar células con nanosensores que contengan solo el colorante FAM como se describe en la sección 3.2 (esto se debe a que la emisión de fluorescencia de TAMRA se encuentra en la misma región espectral que el LysoTracker Red). Prepare estos nanosensores como se describe en la sección 1.1 pero con la omisión de preparar y agregar TAMRA.</li>
	<li>Después del período de entrega del nanosensor, diluya la solución madre de LysoTracker Red a 50 nM.</li>
	<li>Añadir una alícuota de la solución diluida (2 μl) a las células cultivadas en andamios de PLGA.</li>
	<li>Incubar las células con LysoTracker Red durante 1 hora (37 °C, 5% CO2).</li>
	<li>Después del período de incubación, retire el medio y lave las células dos veces con PBS (pH 7,4) antes de cambiar el medio a PBS (pH 7,4) (2 ml) en preparación para la visualización mediante microscopía confocal. Nota: Se pueden utilizar medios libres de rojo de fenol en lugar de PBS.</li>
	<li>Añadir la tinción nuclear Draq5 al PBS para que la concentración final sea de 5 μM e incubar con las células durante 3 min (37 °C 5% CO2). No es necesario cambiar el medio después del período de incubación con Draq5.</li>
	<li>Utilice un láser de argón de 488 nm para excitar los nanosensores FAM solamente, un láser de criptón de 568 nm para excitar el LysoTracker Red y un láser de helio/neón de 633 nm para excitar el cromóforo Draq5 y observar fluorescencia a 500-530 nm, 580-600 nm, 650-750 nm respectivamente (Figura 3). Utilice el escaneo secuencial para evitar la acumulación de longitudes de onda de excitación.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La ingeniería tisular aspira a crear sustitutos biológicos que puedan usarse tanto in vivo como modelos de tejido in vitro y en la terapia de reemplazo tisular para reparar, reemplazar, mantener o mejorar la función de un tejido u órgano en particular. Los sustitutos sintéticos se han utilizado durante muchos años para reemplazar o ayudar a reparar los tejidos, pero a menudo fallan debido a una mala integración con el tejido huésped y / o una infección, lo que finalmente conduce al rechazo o a una cirug...

Una estrategia clave en la ingeniería de tejidos es el uso de materiales biocompatibles para fabricar andamios cuya morfología se asemeje al tejido que va a reemplazar y que además sea capaz de soportar el crecimiento y la función celular1,2. El andamio proporciona soporte mecánico al permitir la unión y proliferación celular, al mismo tiempo que permite la migración celular a través de los intersticios de una construcción celular 3D. El andamio también debe permitir el transporte masivo de nutrientes celulares y no inhibir la eliminación de desechosmetabólicos 3.
El electrospinning ha surgido como un método prometedor para la fabricación de andamios poliméricos capaces de soportar el crecimiento celular4-6. Las fibras electrohiladas no tejidas producidas son adecuadas para el crecimiento celular, ya que a menudo son porosas y permiten la interacción célula-célula, así como la migración celular a través de los intersticios de una construcción celular 3D7. Es importante monitorear la viabilidad celular durante el período de cultivo y garantizar que la viabilidad celular se mantenga a lo largo de toda la construcción 3D. Por ejemplo, las condiciones de cultivo, como el oxígeno y el pH, requieren un control cuidadoso, ya que pueden existir gradientes en la concentración de analito dentro de la construcción 3D. Los biorreactores o sistemas de perfusión pueden emplearse para imitar in vivo las condiciones de flujo intersticial y, como resultado, aumentar la transferencia de nutrientes y la eliminación de desechos metabólicos8. La cuestión de si estos sistemas garantizan condiciones microambientales constantes puede abordarse evaluando el microambiente celular en tiempo real.
Las métricas clave del microambiente que podrían monitorearse en tiempo real incluyen: temperatura, composición química de los medios celulares, concentración de oxígeno disuelto y dióxido de carbono, pH y humedad. De estas métricas, la temperatura se puede monitorear más fácilmente utilizando sondas in situ. Los métodos para monitorear las métricas restantes enumeradas comúnmente involucran la eliminación de una alícuota para el muestreo y, por lo tanto, perturban el cultivo celular y aumentan el riesgo de contaminación. Se están buscando métodos continuos y en tiempo real. Los métodos de monitoreo actuales generalmente se basan en instrumentos que sondean físicamente la construcción celular, como un monitor de pH o una sonda de oxígeno. Sin embargo, estos métodos intrusivos pueden dañar la construcción celular y perturbar el experimento en curso. El monitoreo no invasivo de las concentraciones de analitos dentro de la construcción 3D podría permitir el monitoreo en tiempo real de varios aspectos ambientales, como el agotamiento de nutrientes9. Esto permitiría evaluar el suministro de nutrientes a regiones más profundas dentro de la estructura y determinar si los desechos metabólicos se estaban eliminando de manera efectiva10,11. Los sistemas que intentan abordar el problema de la invasividad generalmente implican el uso de una cámara de perfusión que hace pasar el medio de cultivo tanto a través del recipiente de cultivo como a sensores externos para monitorear el pH, el oxígeno y la glucosa12. Existe un interés creciente en el desarrollo de sensores que puedan integrarse directamente en el recipiente de cultivo que no requieran la extracción de una alícuota para el muestreo y, como tales, proporcionarían un seguimiento in situ.
Para abordar estas deficiencias en el monitoreo in situ y no invasivo de las condiciones microambientales, hemos incorporado nanosensores sensibles al analito en andamios electrohilados para producir andamios autoinformados13. Anteriormente se han preparado andamios que actúan como dispositivos de detección mediante el monitoreo de la actividad de fluorescencia, donde el dispositivo de detección era el andamio polimérico real creado por electrohilado o mediante el uso de un colorante sensible al analito que se incorpora al polímero antes de la formación del andamio14,15. Sin embargo, estos dispositivos de detección tienen el potencial de dar salidas ópticas erróneas causadas por posibles interferencias de otros analitos. El uso de un dispositivo de detección radiométrico como los preparados en el protocolo descrito tiene el potencial de eliminar estos posibles efectos adversos y proporcionar una respuesta específica para el analito en cuestión.
Los andamios electrohilados presentados aquí han sido preparados a partir del copolímero sintético poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), seleccionado debido a la aprobación de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA), debido a sus propiedades biodegradables y biocompatibles y un historial de apoyo al crecimiento y la función de varios tipos de células16-18. Los nanosensores sensibles al analito radiométrico preparados responden al pH. Los nanosensores incorporan dos tintes fluorescentes en una matriz sol-gel biocompatible donde un colorante, FAM, responde al pH y el otro, TAMRA, actúa como un estándar interno ya que no responde al pH. Además, la fluorescencia de FAM y TAMRA se puede analizar por separado, ya que no se superponen significativamente. La determinación de la relación de la emisión de fluorescencia de ambos tintes en longitudes de onda específicas proporciona una respuesta de pH independiente de otras condiciones ambientales. Los andamios de autoinforme podrían permitir la evaluación repetida del pH in situ y en tiempo real sin interrumpir el modelo 3D desarrollado. Hemos demostrado que estos andamios son capaces de soportar la unión y proliferación celular y siguen respondiendo al analito en cuestión. La cinética de los subproductos ácidos en las construcciones de ingeniería sigue siendo poco estudiada y, como tal, el uso de los andamios sensibles al pH podría facilitar en gran medida dichos estudios19. Además, el uso de los andamios de autoinforme para aplicaciones de ingeniería de tejidos presenta la oportunidad de comprender, monitorear y optimizar completamente el crecimiento de las construcciones de tejidos de modelos 3D in vitro, de forma no invasiva y en tiempo real.
Los nanosensores sensibles al pH también se han entregado al entorno intracelular de fibroblastos cultivados en andamios PLGA electrohilados. La relación de la emisión de fluorescencia de los colorantes se utilizó para monitorear el pHi y se comparó con un andamio de autoinforme que incorporaba nanosensores de pH. La entrega de nanosensores a células cultivadas en un entorno 3D podría permitir el seguimiento de la concentración de analito en las profundidades de la construcción de forma no destructiva. Por lo tanto, los nanosensores pueden ser una herramienta de imagen viable para evaluar de forma no destructiva el comportamiento de las células a lo largo de las construcciones 3D, lo que permite el análisis a largo plazo. El cribado de la concentración de analitos de las células individuales dentro de una construcción 3D podría garantizar que reciben suficientes concentraciones de nutrientes y oxígeno. El monitoreo de los parámetros del proceso podría ayudar en el desarrollo de técnicas estandarizadas para el transporte efectivo de masa de oxígeno y nutrientes. La entrega de nanosensores al entorno intracelular y la incorporación de nanosensores en andamios poliméricos podrían combinarse para permitir la evaluación de la viabilidad celular, así como el rendimiento de los andamios dentro de construcciones 3D durante el proceso de crecimiento del tejido. Esto puede conducir a un mayor conocimiento de estos constructos y avanzar en la fabricación de sustitutos de tejidos biológicamente relevantes.

<table><tbody><tr><td>Etanol</td><td>Fisher</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilformamida anhidra (DMF)</td><td>Sigma</td><td>270547</td><td></td></tr><tr><td>hidróxido de amonio al 50% (v/v) solución acuosa</td><td>Alfa Aesar</td><td>35574</td><td>diluido al 30% (v/v) con agua pura</td></tr><tr><td>TEOS</td><td>Sigma</td><td>13190-3</td><td></td></tr><tr><td>3-Aminopropiltrietoxisilano (APTES)</td><td>Sigma</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>5-(y-6)-carboxifluoresceína, éster de succinimidilo (FAM-SE)</td><td>Invitrogen</td><td>C1311</td><td></td></tr><tr><td>6-carboxitetrametilrodamina, éster de succinimidilo (TAMRA-SE)</td><td>Invitrogen</td><td>C1171</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico (0,2 M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-9638</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico (0,2 M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fuente Bioscience</td><td>Batch-213-101992</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Invitrogen</td><td>L-7528</td><td></td></tr><tr><td>Draq5</td><td>Biostatus Ltd</td><td>DR50050</td><td></td></tr><tr><td>Gas nitrógeno</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DCM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320269</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Leica TCS-SP</td><td></td><td>equipado con láseres de argón y criptón y una lente de inmersión en agua 63X 0.9NA</td></tr><tr><td>Luz UV</td><td>UVLS28 UVP, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa agitadora</td><td>SB161-3 Jencons-PLS Medidor de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH</td><td>Jenway modelo 3510</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evaporador rotativo</td><td>Buchi Rotary Evaporador Centrífuga R200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(nanosensores)</td><td>Hermle Z300</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga (cultivo celular)</td><td>Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Whirlimixer Fisherbrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonicador</td><td>FB11021 Fisherbrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chapa</td><td></td><td></td><td></td> de aluminio</tr><tr><td>placa de cultivo celular de 35 mm</td><td>Iwaki</td><td>3000035</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 10 ml</td><td>Becton Dickenson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3T3 Células de fibroblastos</td><td>Colección Europea de Cultivos</td><td></td><td></td>Celulares</tr><tr><td>PLGA</td><td>Lakeshore Biomaterials</td><td>7525 DLG 7E</td><td></td></tr><tr><td>Formiato de piridinio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8535</td><td></td></tr><tr><td>Azul tripán</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma Aldrich 320331</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

los andamios de autoinforme para el 3-dimensional cultivo celular

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Se cree que el cultivo de células en 3D en andamios apropiados imita mejor el microambiente in vivo y aumenta las interacciones célula-célula. La construcción celular 3D resultante a menudo puede ser más relevante para estudiar los eventos moleculares y las interacciones célula-célula que experimentos similares estudiados en 2D. Para crear cultivos 3D efectivos con alta viabilidad celular en todo el andamio, las condiciones de cultivo, como el oxígeno y el pH, deben controlarse cuidadosamente, ya que pueden existir gradientes en la concentración de analito en toda la construcción 3D. En este trabajo describimos los métodos de preparación de nanosensores sol-gel biocompatibles sensibles al pH y su incorporación en andamios electrohilados de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) junto con su posterior preparación para el cultivo de células de mamíferos. Los andamios sensibles al pH se pueden utilizar como herramientas para determinar el pH microambiental dentro de una construcción celular en 3D. Además, detallamos la entrega de nanosensores sensibles al pH al entorno intracelular de células de mamíferos cuyo crecimiento fue soportado por andamios PLGA electrohilados. La ubicación citoplasmática de los nanosensores sensibles al pH se puede utilizar para monitorear el pH intracelular (pHi) durante la experimentación en curso.

La distribución de tamaños de los nanosensores sensibles al pH preparados se caracterizó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM), donde se midió la población de nanosensores observados y se encontró que presentaban dimensiones en el rango de 240-470 nm (Figura 1A). El logro de un diámetro estrecho y razonablemente pequeño es consistente con el uso del método de Stöber para la preparación de nanopartículas. Se ha encontrado que el uso de un entorno de pH básico durante la síntesis de nanopartícu...

Los nanosensores sol-gel biocompatibles que responden al pH se pueden incorporar en andamios electrohilados de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA). Los andamios autoinformados producidos se pueden utilizar para el monitoreo in situ de las condiciones microambientales mientras se cultivan células en el andamio. Esto es beneficioso ya que la construcción celular 3D se puede monitorear en tiempo real sin perturbar el experimento.

Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

El objetivo general del siguiente experimento es producir nanosensores sensibles al pH y andamios autorreportantes que puedan monitorearse en tiempo real y en sitio, con el fin de ayudar a comprender las condiciones que influyen en el crecimiento celular. Esto se logra primero preparando nanosensores biocompatibles sensibles al analito, capaces de monitorear el pH mediante señales de fluorescencia. En una segunda etapa, los nanosensores sensibles al pH se incorporan en andamios poliméricos electrohilados, formando un entorno tridimensional sobre el cual se pueden cultivar y monitorear células.A continuación, las células mamíferas se siembran sobre los andamios electrohilados y también se introducen nanosensores en su entorno intracelular para monitorear el pH intracelular. Durante el experimento se obtienen resultados que demuestran la capacidad de los nanosensores intracelulares y de los andamios autorreportables para monitorear el pH dentro de entornos de tejido ingenierilizados, basándose en las relaciones de fluorescencia adquiridas mediante microscopía confocal. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el uso de sondas electrónicas de pH, es que las mediciones pueden realizarse in situ y en tiempo real sin necesidad de interrumpir el crecimiento celular.Para comenzar, prepare los fluoróforos disolviendo 1,5 miligramos de fam SE en un mililitro de dimetilformamida conocida como DMF en un matraz de fondo redondo. También disuelva 1,5 miligramos de Tamara SE en un mililitro de DMF en un segundo matraz. A continuación, agregue 1,5 mililitros de tres amino propil trietoxisilano a cada matraz y agite continuamente en la oscuridad bajo una atmósfera de nitrógeno seco a 21 grados Celsius durante 24 horas.A continuación, agregue 250 microlitros de ambas soluciones de colorante a una mezcla que contiene seis mililitros de etanol y cuatro mililitros de hidróxido de amonio contenidos en un matraz redondo. Agite esta nueva mezcla a 21 grados Celsius tras una hora. Añada lentamente 0,5 mililitros de ortosilicato de tetraetilo a la mezcla y continúe agitando durante otras dos horas.Durante este tiempo, espere que la mezcla se vuelva turbia, luego recoja los nanosensores mediante evaporación rotatoria y almacénelos en un vial de vidrio a cuatro grados Celsius para su uso futuro. A continuación, agregue los nanosensores secos de pH a una concentración de cinco miligramos por mililitro en tampones fosfato de Sorenson, con un rango de pH de 5,5 a pH 7,5 en incrementos de 0,5 unidades de pH. Resuspenda los nanosensores agitando las muestras en vórtex durante tres minutos y luego sométalos a sonicación durante cinco minutos o hasta que la solución se vuelva turbia.Recolecte datos de calibración midiendo las muestras a una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros para FAM y 568 nanómetros para Tamara. Para Tamara, recolecte las emisiones entre 500 y 530 nanómetros para FAM y entre 558 y 580 nanómetros para Tamara, y calcule la relación de los máximos de emisión producidos a cada valor de pH. Luego, prepare la muestra para imágenes de SEM colocando una muestra de nanosensores sobre un portaobjetos para microscopio electrónico recubierto con carbono y recubriendo los partículas con oro mediante pulverización catódica durante cinco minutos bajo una atmósfera de argón.Una vez recubiertos, coloque las muestras en el microscopio electrónico y ajuste la distancia de trabajo, el voltaje y la ampliación para minimizar la carga de electrones y obtener las mejores imágenes en una campana extractora. Prepare una solución al 20% de PLGA en diclorometano con 1% de formiato de perineo. Cargue la solución en una jeringa de 10 mililitros con una aguja romo de 18 calibres y colóquela firmemente en una bomba de jeringa.Esta solución se utilizará para fabricar andamios de control de PLGA. Coloque la punta de la aguja a 20 centímetros de distancia de una placa colectora de aluminio de 20 por 15 centímetros, y conecte el electrodo de una fuente de alimentación de alto voltaje a la punta de la jeringa, conectando a tierra el cable en la placa colectora de aluminio. A continuación, encienda la fuente de alimentación y ajuste el voltaje a 12 kilovoltios. Luego, encienda la bomba de jeringa y suministre la solución utilizando un caudal constante de 3,5 mililitros por hora durante dos horas.Esto producirá una profundidad del andamiaje de aproximadamente 60 micrómetros. Una vez finalizado, apague el equipo y deje el andamiaje en la campana extractora durante 24 horas para permitir que el residuo del disolvente se evapore. Para preparar andamiajes incorporados con nanosensores sensibles al pH, prepare la solución de PLGA como antes, pero esta vez agregue también cinco miligramos por mililitro de los nanosensores.Luego, electrospine el material sensible al pH utilizando los mismos parámetros que antes. A continuación, calibre la sensibilidad al pH del andamio colocando pequeñas muestras del andamio seco con nanosensores incorporados en placas de cultivo de 35 milímetros e inmersas en dos mililitros de tampones fosfato de Sorensen con pH entre 5,5 y 7,5 en incrementos de 0,5 en un microscopio confocal. Utilice un láser de argón de 488 nanómetros para excitar FAM y un láser de criptón de 568 nanómetros para excitar Tamara dentro de los nanosensores.Observe la emisión entre 500 y 530 nanómetros para FAM y entre 558 y 580 nanómetros para Tamara, y luego calcule la relación de los máximos de emisión producidos a cada valor de pH. Primero, esterilice las superficies de los andamios con una fuente de luz UV a una distancia de ocho centímetros durante 15 minutos por cada lado. Luego, transfiera estérilmente los andamios a una placa de cultivo de 12 pocillos y coloque un anillo de acero con un diámetro interno de un centímetro y un diámetro externo de dos centímetros sobre el andamio.A continuación, agregue PBS con 5% pen strep al interior y exterior del anillo de acero e incube las muestras durante la noche. Al día siguiente, retire el PBS con 5% pen strep y lave los andamios con PBS.Luego, agregue 500 microlitros de medio de cultivo celular al interior y al exterior del anillo de acero y caliente previamente la placa en un incubador. A continuación, coseche las células de interés y prepare una suspensión celular de un millón de células por mililitro. Cuando las células estén listas, retire el medio del pocillo y agregue un mililitro de medio fresco al exterior del anillo de acero.Luego, agregue 300 microlitros de la suspensión celular en el interior del anillo de acero y mueva suavemente la placa para distribuir uniformemente las células. Coloque la placa en un incubador a 37 grados Celsius con 5%CO2, e incube las células durante el tiempo que sea necesario. Renovando el medio cada dos o tres días, siembre las células sobre los andamios como se describió en la sección anterior, y permita que crezcan sin interrupciones durante 72 horas.Luego, lave las células con PBS y agregue 500 microlitros de medio sin suero en el exterior del anillo y 300 microlitros en el interior del anillo. Incube la placa durante una hora a 37 grados Celsius durante la incubación. Prepare la solución A agregando cinco miligramos de los nanosensores con 50 microlitros de medio óptimo y frote brevemente.Luego, mezcle la solución B añadiendo cinco microlitros de lipectomía 2000 a 45 microlitros de Optum, y deje que la mezcla incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, añada la solución A a la mezcla de la solución B y luego incube a temperatura ambiente durante 20 minutos para formar la solución C, que es el complejo de liposomas nanosensor. Retire la placa del incubador y añada 100 microlitros de la solución compleja al interior del anillo de acero.Luego, coloque la placa de nuevo en el incubador e incube las células con los complejos de reactivo lipectomía durante tres horas tras la incubación. Aspire el medio y lave las células dos veces con PBS precalentado antes de sumergir el andamio celular en tampones de diferentes pHs para monitorear la respuesta de los nanosensores. Ahora, dentro de las células, obtenga imágenes mediante microscopía confocal de fluorescencia para rastrear la ubicación de los nanosensores dentro de células mamíferas.Primero, prepare y agregue únicamente fam que contenga nanosensores a las células ubicadas sobre andamios de PLGA. Luego, añada dos microlitros de marcador rojo lyo de 50 nanomolar a 300 microlitros de medio y incube durante una hora a 37 grados Celsius. Tras el período de incubación, retire el medio y lave las células dos veces con PBS.Luego, agregue dos microlitros de PBS u otro medio libre de rojo de fenol para cubrir las células durante la imagen confocal. A continuación, agregue cinco micromoles del colorante nuclear, drac cinco, al PBS e incube con las células durante tres minutos a 37 grados Celsius. Después de tres minutos, retire la placa del incubador y colóquela en la platina confocal para obtener imágenes del nanosensor, los orgánulos ácidos y el núcleo utilizando diversas longitudes de onda de excitación y emisión, como se describe en el protocolo de texto adjunto, empleando un escaneo secuencial para evitar la recopilación de longitudes de onda de excitación. La distribución de tamaños de los nanosensores sensibles al pH preparados se caracterizó mediante MEB, donde se midió la población de nanosensores observados y se encontró que tenían dimensiones en el rango de 240 a 470 nanómetros.En la izquierda se muestra una imagen de fibras de PLGA electrohiladas, y en la derecha hay fibras de PLGA electrohiladas con nanosensores. Las micrografías de SEM de las fibras proporcionan evidencia de la asociación de nanosensores en la superficie de las fibras. Sin embargo, también pueden incorporarse dentro de las fibras del andamiaje.Una vez electrohilados, los nanosensores conservan su capacidad de permanecer ópticamente y químicamente activos y se muestran aquí asociados con las fibras del andamiaje. A la izquierda está el colorante fam mostrado en verde, y a la derecha está el colorante Tamara mostrado en rojo. La relación de intensidad fluorescente produce una curva de calibración como se muestra aquí.Los nanosensores evaluados por separado y cuando se incorporaron en andamios de PLGA electrohilados se reflejaron mutuamente, demostrando que los nanosensores conservan su actividad óptica tras la incorporación en los andamios. Los nanosensores incorporados también respondieron de manera reversible y adecuada a los cambios en los valores de pH cuando el tampón alternó entre un pH de 5.5 y 7.5. La relación fam Tamra respondió de forma predecible cada vez que se mostró.A continuación se muestran imágenes confocales de fibroblastos a los que se les introdujeron nanosensores intracelularmente mediante un reactivo de transfección. La colocalización puntual de los colorantes fam y Tamara sugiere que los colorantes permanecieron atrapados en la matriz del nanosensor. La introducción intracelular de los nanosensores puede confirmarse midiendo la relación fam-Tamara en células colocadas en diversos tampones.Como puede observarse aquí, la proporción aumenta al medir los nanosensores basados en andamiaje, pero permanece constante al medir los sensores dentro de las células. Tras el desarrollo de esta técnica, los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos podrán investigar el microambiente intracelular de pH en tiempo real y en sitio, dentro de construccos celulares tridimensionales, sin interrumpir el experimento en curso.

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Investigación

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