Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

El objetivo general del siguiente experimento es producir nanosensores sensibles al pH y andamios autoinformados que puedan monitorearse en tiempo real e in situ para ayudar a comprender las condiciones que influyen en el crecimiento celular. Esto se logra preparando primero nanosensores sensibles a analitos biocompatibles, que pueden monitorear el pH a través de salidas de fluorescencia. Como segundo paso, los nanosensores sensibles al pH se incorporan en andamios poliméricos electrohilados formando un entorno 3D en el que se pueden cultivar y monitorizar las células.

A continuación, las células de los mamíferos se asientan en los andamios electros hilados y los nanosensores también se introducen en su entorno intracelular para controlar el pH intracelular. Durante la experimentación se obtienen resultados que muestran la capacidad de los nanosensores intracelulares y los andamios de autoinforme para monitorear el pH dentro de entornos de ingeniería tisular basados en las relaciones de fluorescencia adquiridas por microscopía confocal. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el uso de sondas electrónicas de pH, es que las mediciones se pueden realizar in situ y en tiempo real sin tener que perturbar el crecimiento celular.

Para empezar, prepare los fluoróforos disolviendo 1,5 miligramos de fam SE en un mililitro de dimetilformamida, conocido como DMF, en un fondo redondo. El matraz también disuelve 1,5 miligramos de Tamara SE en un mililitro de DMF en un segundo matraz. A continuación, añada 1,5 mililitros de trietilo propilo de tres aminoácidos a cada matraz y revuelva continuamente en la oscuridad bajo una atmósfera de nitrógeno seco a 21 grados centígrados durante 24 horas.

A continuación, agregue 250 microlitros de ambas soluciones de colorante a una mezcla que contenga seis mililitros de etanol y cuatro mililitros de hidróxido de amonio contenidos en un matraz de fondo redondo. Revuelva esta nueva mezcla a 21 grados centígrados después de una hora. Agregue lentamente 0,5 mililitros de silicato de tetraetilo ortos a la mezcla y continúe revolviendo durante otras dos horas.

Durante este tiempo, espere que la mezcla se vuelva turbia, luego recoja los nanosensores por evaporación rotatoria y guárdelos en un frasco de vidrio a cuatro grados centígrados para su uso futuro. A continuación, agregue los nanosensores de pH secos a cinco miligramos por mililitro en los tampones de fosfato de Sorenson, que van desde pH 5.5 hasta pH 7.5 en incrementos de pH 0.5. Vuelva a suspender los nanosensores mediante vórtice de las muestras durante tres minutos y luego soniquelos durante cinco minutos o hasta que la solución se vuelva turbia.

Recopile datos de calibración midiendo las muestras a una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros para FAM y 568 nanómetros. En el caso de Tamara, recoja las emisiones de 500 a 530 nanómetros para FAM y de 558 a 580 nanómetros para Tamara, y calcule la relación de los máximos de emisión producidos en cada valor de pH. A continuación, prepare la muestra para la obtención de imágenes SEM colocando una muestra de nanosensores en un microscopio electrónico recubierto de carbono, recubriendo las partículas con oro durante cinco minutos bajo una atmósfera de argón.

Una vez recubiertas, coloque las muestras en el microscopio electrónico y ajuste la distancia de trabajo, el voltaje y el aumento para minimizar la carga de electrones y producir las mejores imágenes en una campana extractora. Prepare una solución de PLGA al 20% en di clorometano con formiato de perineo al 1%. Cargue la solución en una jeringa de 10 mililitros con una aguja de llenado romo de calibre 18 y colóquela firmemente en una bomba de jeringa.

Esta solución se utilizará para hacer que los andamios PLGA de control distancien la punta de la aguja a 20 centímetros de una placa colectora de aluminio de 20 por 15 centímetros, y conecten el electrodo de una fuente de alimentación de alto voltaje a la punta de la jeringa y conecten el cable a la placa colectora de aluminio. A continuación, encienda la fuente de alimentación y ajuste el voltaje a 12 kilovoltios. A continuación, encienda la bomba de jeringa y administre la solución con un caudal constante de 3,5 mililitros por hora durante dos horas.

Esto producirá una profundidad de andamio de aproximadamente 60 micras. Una vez terminado, apague el equipo y deje el andamio en la campana extractora durante 24 horas para permitir que se evapore el residuo de solvente. Para preparar andamios incorporados con nanosensores sensibles al pH, prepare la solución de PLGA como antes, pero esta vez también agregue cinco miligramos por mililitro de los nanosensores.

A continuación, electro centrifuga el pH sensible utilizando los mismos ajustes que antes. A continuación, calibrar la capacidad de respuesta del pH del andamio colocando pequeñas muestras del andamio seco con nanosensores incorporados en placas de cultivo de 35 milímetros y sumergiéndolas en dos mililitros de tampones de fosfato sorensen entre pH 5,5 y 7,5 en incrementos de 0,5 en un microscopio confocal. Utilice un láser de argón de 488 nanómetros para excitar FAM y un láser de criptón de 568 nanómetros para excitar Tamara dentro de los nanosensores.

Observe la emisión a 500 a 530 nanómetros para FAM y de 558 a 580 nanómetros para Tamara, y luego calcule la relación de los máximos de emisión producidos en cada valor de pH. Primero, esterilice las superficies de los andamios con una fuente de luz ultravioleta a una distancia de ocho centímetros durante 15 minutos a cada lado. Luego, transfiera estérilmente los andamios a una placa de cultivo de 12 pocillos y coloque un anillo de acero con un diámetro interior de un centímetro y un diámetro exterior de dos centímetros sobre el andamio.

A continuación, agregue PBS con una tira de pluma al 5% en el interior y el exterior del anillo de acero e incube las muestras durante la noche. Al día siguiente. Retire el PBS con estreptococo al 5% en pluma y lave los andamios con PBS.

A continuación, añada 500 microlitros de medios de cultivo celular en el interior y el exterior del anillo de acero y precaliente la placa en una incubadora. A continuación, coseche las células de interés y prepare una suspensión celular de una por 10 a seis células por mililitro. Cuando las celdas estén listas, retire el medio del pocillo y agregue un mililitro de medio fresco al exterior del anillo de acero.

A continuación, añada 300 microlitros de la suspensión de células en el interior del anillo de acero y balancee suavemente la placa para distribuir uniformemente las células. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de CO2 e incube las células durante el tiempo que sea necesario. Refresque los medios cada dos o tres días, siembra las células en los andamios, como se describe en la sección anterior, y permita que crezcan ininterrumpidamente durante 72 horas.

A continuación, enjuague las células con PBS y añada 500 microlitros de medios libres de suero en el exterior del anillo y 300 microlitros en el interior del anillo. Incubar la placa durante una hora a 37 grados centígrados durante la incubación. Prepare la solución A añadiendo cinco miligramos de los nanosensores con 50 microlitros de fornicación óptima y breve.

A continuación, mezcle la solución B añadiendo cinco microlitros de lipectomía 2000 a 45 microlitros de Optum, y deje que la mezcla se incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, agregue la solución A a la mezcla de solución B y luego incube a temperatura ambiente durante 20 minutos para formar la solución C, que es el complejo de liposomas nanosensores. Retire la placa de la incubadora y agregue 100 microlitros de la solución compleja al interior del anillo de acero.

A continuación, vuelva a colocar la placa en la incubadora e incube las células con los complejos de reactivos de lipectomía durante tres horas después de la incubación. Aspire el medio y lave las celdas dos veces con PBS calentado antes de sumergir el andamio asentado de la celda en tampones de diferentes phs para monitorear la respuesta de los nanosensores. Ahora, dentro de las células, obtenga imágenes de las células utilizando microscopía confocal de fluorescencia para rastrear la ubicación de los nanosensores dentro de las células de mamíferos.

En primer lugar, prepare y entregue solo fam que contenga nanosensores a las células asentadas en andamios de PLGA. A continuación, añada dos microlitros de 50 nano molares lyo tracker red a 300 microlitros de medio e incube durante una hora a 37 grados centígrados después del período de incubación. Retire el medio y lave las celdas dos veces con PBS.

A continuación, añada dos microlitros de PBS u otros medios libres de rojo fenol para cubrir las células durante la obtención de imágenes confocal. A continuación, agregue cinco micromolares de la tinción nuclear, drac cinco al PBS e incube con las células durante tres minutos a 37 grados centígrados. Después de tres minutos, retire la placa de la incubadora y colóquela en la etapa confocal para obtener imágenes de la imagen, los orgánulos ácidos y el núcleo de los nanosensores utilizando varias longitudes de onda de excitación y emisión como se describe en el protocolo de texto adjunto mientras se utiliza el escaneo secuencial para evitar la recopilación de longitudes de onda de excitación, la distribución de tamaño de los nanosensores sensibles al pH preparados se caracterizó utilizando SEM, donde se midió la población de nanosensores fotografiados y se encontró que tienen dimensiones nanométricas en el rango de 240 a 470 nanómetros.

A la izquierda se muestra una imagen de fibras PLGA hiladas electros, y a la derecha se muestran fibras PLGA hiladas electros con nanosensores. Las micrografías SEM de las fibras proporcionan evidencia de la asociación de nanosensores en la superficie de las fibras. Sin embargo, también pueden incorporarse dentro de las fibras del andamio.

Una vez que los electros giran, los nanosensores conservan su capacidad de permanecer óptica y químicamente activos y se muestran aquí asociados con las fibras del andamio. A la izquierda se muestra el tinte de familia en verde, y a la derecha se muestra el tinte Tamara en rojo. La relación de intensidad fluorescente produce una curva de calibración como se muestra aquí.

Los nanosensores evaluados solos y cuando se incorporaron a andamios PLGA electros hilados se reflejaron entre sí, lo que demuestra que los nanosensores conservan su actividad óptica después de la incorporación a los andamios. Los nanosensores incorporados también responden bien de forma reversible a los cambios en los valores de pH, ya que el tampón se alternó entre un pH de 5,5 y 7,5. La proporción de fam Tamra respondió de manera predecible cada vez que se mostró.

Aquí hay imágenes confocales de fibroblastos que tenían nanosensores administrados intracelularmente a través de un reactivo de transfección. La colocalización punteada de los tintes fam y Tamara sugiere que los tintes permanecieron atrapados en la matriz del nanosensor. La administración intracelular de los nanosensores se puede confirmar midiendo la proporción de células colocadas en varios tampones.

Como se puede ver aquí, la relación aumenta cuando se miden los nanosensores basados en andamios, pero se mantiene estable cuando se miden los sensores dentro de las células. Tras el desarrollo de esta técnica, los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos pueden investigar in situ y en tiempo real. Cambios microambientales en el pH intracelular dentro de construcciones celulares en 3D sin perturbar el experimento en curso.