Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

El objetivo general del siguiente experimento es producir nanosensores sensibles al pH y andamios autorreportantes que puedan monitorearse en tiempo real y en sitio, con el fin de ayudar a comprender las condiciones que influyen en el crecimiento celular. Esto se logra primero preparando nanosensores biocompatibles sensibles al analito, capaces de monitorear el pH mediante señales de fluorescencia. En una segunda etapa, los nanosensores sensibles al pH se incorporan en andamios poliméricos electrohilados, formando un entorno tridimensional sobre el cual se pueden cultivar y monitorear células.

A continuación, las células mamíferas se siembran sobre los andamios electrohilados y también se introducen nanosensores en su entorno intracelular para monitorear el pH intracelular. Durante el experimento se obtienen resultados que demuestran la capacidad de los nanosensores intracelulares y de los andamios autorreportables para monitorear el pH dentro de entornos de tejido ingenierilizados, basándose en las relaciones de fluorescencia adquiridas mediante microscopía confocal. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como el uso de sondas electrónicas de pH, es que las mediciones pueden realizarse in situ y en tiempo real sin necesidad de interrumpir el crecimiento celular.

Para comenzar, prepare los fluoróforos disolviendo 1,5 miligramos de fam SE en un mililitro de dimetilformamida conocida como DMF en un matraz de fondo redondo. También disuelva 1,5 miligramos de Tamara SE en un mililitro de DMF en un segundo matraz. A continuación, agregue 1,5 mililitros de tres amino propil trietoxisilano a cada matraz y agite continuamente en la oscuridad bajo una atmósfera de nitrógeno seco a 21 grados Celsius durante 24 horas.

A continuación, agregue 250 microlitros de ambas soluciones de colorante a una mezcla que contiene seis mililitros de etanol y cuatro mililitros de hidróxido de amonio contenidos en un matraz redondo. Agite esta nueva mezcla a 21 grados Celsius tras una hora. Añada lentamente 0,5 mililitros de ortosilicato de tetraetilo a la mezcla y continúe agitando durante otras dos horas.

Durante este tiempo, espere que la mezcla se vuelva turbia, luego recoja los nanosensores mediante evaporación rotatoria y almacénelos en un vial de vidrio a cuatro grados Celsius para su uso futuro. A continuación, agregue los nanosensores secos de pH a una concentración de cinco miligramos por mililitro en tampones fosfato de Sorenson, con un rango de pH de 5,5 a pH 7,5 en incrementos de 0,5 unidades de pH. Resuspenda los nanosensores agitando las muestras en vórtex durante tres minutos y luego sométalos a sonicación durante cinco minutos o hasta que la solución se vuelva turbia.

Recolecte datos de calibración midiendo las muestras a una longitud de onda de excitación de 488 nanómetros para FAM y 568 nanómetros para Tamara. Para Tamara, recolecte las emisiones entre 500 y 530 nanómetros para FAM y entre 558 y 580 nanómetros para Tamara, y calcule la relación de los máximos de emisión producidos a cada valor de pH. Luego, prepare la muestra para imágenes de SEM colocando una muestra de nanosensores sobre un portaobjetos para microscopio electrónico recubierto con carbono y recubriendo los partículas con oro mediante pulverización catódica durante cinco minutos bajo una atmósfera de argón.

Una vez recubiertos, coloque las muestras en el microscopio electrónico y ajuste la distancia de trabajo, el voltaje y la ampliación para minimizar la carga de electrones y obtener las mejores imágenes en una campana extractora. Prepare una solución al 20% de PLGA en diclorometano con 1% de formiato de perineo. Cargue la solución en una jeringa de 10 mililitros con una aguja romo de 18 calibres y colóquela firmemente en una bomba de jeringa.

Esta solución se utilizará para fabricar andamios de control de PLGA. Coloque la punta de la aguja a 20 centímetros de distancia de una placa colectora de aluminio de 20 por 15 centímetros, y conecte el electrodo de una fuente de alimentación de alto voltaje a la punta de la jeringa, conectando a tierra el cable en la placa colectora de aluminio. A continuación, encienda la fuente de alimentación y ajuste el voltaje a 12 kilovoltios. Luego, encienda la bomba de jeringa y suministre la solución utilizando un caudal constante de 3,5 mililitros por hora durante dos horas.

Esto producirá una profundidad del andamiaje de aproximadamente 60 micrómetros. Una vez finalizado, apague el equipo y deje el andamiaje en la campana extractora durante 24 horas para permitir que el residuo del disolvente se evapore. Para preparar andamiajes incorporados con nanosensores sensibles al pH, prepare la solución de PLGA como antes, pero esta vez agregue también cinco miligramos por mililitro de los nanosensores.

Luego, electrospine el material sensible al pH utilizando los mismos parámetros que antes. A continuación, calibre la sensibilidad al pH del andamio colocando pequeñas muestras del andamio seco con nanosensores incorporados en placas de cultivo de 35 milímetros e inmersas en dos mililitros de tampones fosfato de Sorensen con pH entre 5,5 y 7,5 en incrementos de 0,5 en un microscopio confocal. Utilice un láser de argón de 488 nanómetros para excitar FAM y un láser de criptón de 568 nanómetros para excitar Tamara dentro de los nanosensores.

Observe la emisión entre 500 y 530 nanómetros para FAM y entre 558 y 580 nanómetros para Tamara, y luego calcule la relación de los máximos de emisión producidos a cada valor de pH. Primero, esterilice las superficies de los andamios con una fuente de luz UV a una distancia de ocho centímetros durante 15 minutos por cada lado. Luego, transfiera estérilmente los andamios a una placa de cultivo de 12 pocillos y coloque un anillo de acero con un diámetro interno de un centímetro y un diámetro externo de dos centímetros sobre el andamio.

A continuación, agregue PBS con 5% pen strep al interior y exterior del anillo de acero e incube las muestras durante la noche. Al día siguiente, retire el PBS con 5% pen strep y lave los andamios con PBS.

Luego, agregue 500 microlitros de medio de cultivo celular al interior y al exterior del anillo de acero y caliente previamente la placa en un incubador. A continuación, coseche las células de interés y prepare una suspensión celular de un millón de células por mililitro. Cuando las células estén listas, retire el medio del pocillo y agregue un mililitro de medio fresco al exterior del anillo de acero.

Luego, agregue 300 microlitros de la suspensión celular en el interior del anillo de acero y mueva suavemente la placa para distribuir uniformemente las células. Coloque la placa en un incubador a 37 grados Celsius con 5%CO2, e incube las células durante el tiempo que sea necesario. Renovando el medio cada dos o tres días, siembre las células sobre los andamios como se describió en la sección anterior, y permita que crezcan sin interrupciones durante 72 horas.

Luego, lave las células con PBS y agregue 500 microlitros de medio sin suero en el exterior del anillo y 300 microlitros en el interior del anillo. Incube la placa durante una hora a 37 grados Celsius durante la incubación. Prepare la solución A agregando cinco miligramos de los nanosensores con 50 microlitros de medio óptimo y frote brevemente.

Luego, mezcle la solución B añadiendo cinco microlitros de lipectomía 2000 a 45 microlitros de Optum, y deje que la mezcla incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, añada la solución A a la mezcla de la solución B y luego incube a temperatura ambiente durante 20 minutos para formar la solución C, que es el complejo de liposomas nanosensor. Retire la placa del incubador y añada 100 microlitros de la solución compleja al interior del anillo de acero.

Luego, coloque la placa de nuevo en el incubador e incube las células con los complejos de reactivo lipectomía durante tres horas tras la incubación. Aspire el medio y lave las células dos veces con PBS precalentado antes de sumergir el andamio celular en tampones de diferentes pHs para monitorear la respuesta de los nanosensores. Ahora, dentro de las células, obtenga imágenes mediante microscopía confocal de fluorescencia para rastrear la ubicación de los nanosensores dentro de células mamíferas.

Primero, prepare y agregue únicamente fam que contenga nanosensores a las células ubicadas sobre andamios de PLGA. Luego, añada dos microlitros de marcador rojo lyo de 50 nanomolar a 300 microlitros de medio y incube durante una hora a 37 grados Celsius. Tras el período de incubación, retire el medio y lave las células dos veces con PBS.

Luego, agregue dos microlitros de PBS u otro medio libre de rojo de fenol para cubrir las células durante la imagen confocal. A continuación, agregue cinco micromoles del colorante nuclear, drac cinco, al PBS e incube con las células durante tres minutos a 37 grados Celsius. Después de tres minutos, retire la placa del incubador y colóquela en la platina confocal para obtener imágenes del nanosensor, los orgánulos ácidos y el núcleo utilizando diversas longitudes de onda de excitación y emisión, como se describe en el protocolo de texto adjunto, empleando un escaneo secuencial para evitar la recopilación de longitudes de onda de excitación. La distribución de tamaños de los nanosensores sensibles al pH preparados se caracterizó mediante MEB, donde se midió la población de nanosensores observados y se encontró que tenían dimensiones en el rango de 240 a 470 nanómetros.

En la izquierda se muestra una imagen de fibras de PLGA electrohiladas, y en la derecha hay fibras de PLGA electrohiladas con nanosensores. Las micrografías de SEM de las fibras proporcionan evidencia de la asociación de nanosensores en la superficie de las fibras. Sin embargo, también pueden incorporarse dentro de las fibras del andamiaje.

Una vez electrohilados, los nanosensores conservan su capacidad de permanecer ópticamente y químicamente activos y se muestran aquí asociados con las fibras del andamiaje. A la izquierda está el colorante fam mostrado en verde, y a la derecha está el colorante Tamara mostrado en rojo. La relación de intensidad fluorescente produce una curva de calibración como se muestra aquí.

Los nanosensores evaluados por separado y cuando se incorporaron en andamios de PLGA electrohilados se reflejaron mutuamente, demostrando que los nanosensores conservan su actividad óptica tras la incorporación en los andamios. Los nanosensores incorporados también respondieron de manera reversible y adecuada a los cambios en los valores de pH cuando el tampón alternó entre un pH de 5.5 y 7.5. La relación fam Tamra respondió de forma predecible cada vez que se mostró.

A continuación se muestran imágenes confocales de fibroblastos a los que se les introdujeron nanosensores intracelularmente mediante un reactivo de transfección. La colocalización puntual de los colorantes fam y Tamara sugiere que los colorantes permanecieron atrapados en la matriz del nanosensor. La introducción intracelular de los nanosensores puede confirmarse midiendo la relación fam-Tamara en células colocadas en diversos tampones.

Como puede observarse aquí, la proporción aumenta al medir los nanosensores basados en andamiaje, pero permanece constante al medir los sensores dentro de las células. Tras el desarrollo de esta técnica, los investigadores en el campo de la ingeniería de tejidos podrán investigar el microambiente intracelular de pH en tiempo real y en sitio, dentro de construccos celulares tridimensionales, sin interrumpir el experimento en curso.