Un protocolo para la inducción genética y visualización de tumores benignos y invasoras en cefálica Complejos de Drosophila melanogaster
11 de septiembre de 2013
Cooperación entre un oncogén activado como RAS V12 y las mutaciones en los genes de polaridad celular como garabateado, resultar en el crecimiento tumoral en Drosophila donde las células tumorales también muestran comportamientos invasivos. Aquí se presenta un protocolo sencillo para la inducción y la observación de los tumores benignos y invasivos.
El objetivo general de este procedimiento es inducir tumores benignos e invasivos en drosophila, y luego visualizarlos mediante la disección del complejo cefálico larval. Esto comienza con la creación de una cepa intermedia entre las cepas deseadas y el aislamiento de la progenie larvaria, portadora de tumores invasivos o benignos. El siguiente paso es diseccionar las larvas seleccionadas.
Para exponer el complejo cefálico cortándolos primero dos tercios del camino, asegurándolos y luego dándoles la vuelta. A continuación, se limpian los tejidos grasos, corporales e intestinales, y luego también se rompen los nervios que aún están unidos al cordón nervioso ventral y a la epidermis larvaria. El paso final es obtener una imagen del complejo cefálico o fijarlo para aplicaciones posteriores.
En última instancia, los resultados pueden mostrar tumores invasivos o benignos marcados con GFP mediante el uso de microscopía de fluorescencia. Este método puede ayudar a responder algunas de las preguntas clave en la biología del cáncer. Por ejemplo, es posible que desee comprender qué genes podrían inhibir la progresión de los tumores en un organismo intacto.
Una vez que se hayan obtenido las reservas genéticas requeridas, prepare un cultivo iniciador de la cepa de prueba. Prepare también un cultivo iniciador para el material analizado. Cruce 10 hembras vírgenes de la cepa de prueba con 10 machos de la cepa probada.
Deje que las moscas se apareen y pongan huevos durante 24 a 48 horas a 25 grados centígrados, y luego transfiéralos a un vial nuevo para producir más progenie. Monitoree los viales cruzados en busca de huevos y larvas de primer estadio. Coloca una nueva cruz.
Si los viales recolectados muestran una mala deposición de óvulos. Si los viales recolectados comienzan a secarse, agregue solo tres o cuatro gotas de agua destilada en autoclave para mantener el cultivo húmedo. Continúe monitoreando los viales hasta que deambule.
Las larvas del tercer estadio están presentes. A continuación, proceda a monitorizarlos bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia. Utilizando el mismo procedimiento, recoja moscas portadoras de tumores invasivos utilizando las existencias enumeradas para el día de cultivo cinco o seis, las larvas errantes del tercer estadio estarán disponibles en los cultivos de tumores benignos.
Sin embargo, no estarán disponibles hasta el día 10 de los cultivos tumorales invasivos. Para recolectar las larvas del tercer estadio, humedezca un pincel fino con agua destilada y raspe la pared del vial. Coloque las larvas en un portaobjetos de depresión con uno XPBS frío y luego use un pincel húmedo.
Raspe cualquier material alimenticio de su epidermis. Durante unos minutos de inmovilización, coloque la larva en el plato a menos 20 grados centígrados durante 30 minutos. Para un tiempo de inmovilización más prolongado, coloque las larvas en un vial de cultivo con solo siesta de mosca en una varita.
Tape el vial de cultivo y déjelo reposar durante 40 minutos. A continuación, transfiera las larvas inmovilizadas a un portaobjetos de vidrio. Agregue una gota de aceite de carburador de halo ligero y cubra las larvas con un cubreobjetos.
Ahora, observe las larvas bajo un microscopio estereoscópico fluorescente. Para la expresión de GFP, seleccione las larvas fluorescentes verdes y proceda a la disección. Las larvas portadoras de tumores benignos emitirán fluorescencia verde en la región anterior donde está presente el complejo cefálico.
Los tumores invasivos también emiten fluorescencia verde en la región anterior de las larvas en el complejo cefálico. Si es posible, asegúrese de documentar fotográficamente los tumores fluorescentes. Por lo tanto, la epidermis translúcida de la larva dificulta la observación del grado de migración de los tumores, por lo que debemos diseccionar los tumores.
Comience con el uso de fórceps para transferir una larva fresca con cualquiera de los tumores. Escriba a un pocillo de un plato de disección que contiene un mililitro de XPBS frío. Sujete las larvas con un par de pinzas a aproximadamente dos tercios de la distancia del extremo anterior.
Con otro par de pinzas, separe inteligentemente el tercio posterior de las larvas y deséchelo. Luego soltó los dos tercios anteriores. A medida que se libera la presión dentro de las larvas, su contenido exudará fuera de la cavidad corporal.
Con unas pinzas, retire los tejidos que han supurado de la cavidad corporal. A continuación, sostenga el gancho de la boca de la larva y empújelo hacia la epidermis de la larva. Con el otro par de pinzas, invierta completamente las larvas.
Ahora, con las pinzas, con suavidad y cuidado, retire la grasa, las glándulas salivales, el intestino, el complejo del disco del ala y los tubos traqueales. El complejo cefálico ahora puede ser visible unido al gancho bucal. Los hemisferios cerebrales y el VNC todavía están conectados a la epidermis larvaria a través de nervios que emanan del VNC.
Con pinzas, rompa suavemente estas conexiones. A continuación, retire el exceso de grasa, cuerpo u otros tejidos, para que el complejo cefálico se haga claramente visible. Se adhiere a la epidermis larvaria en los ganchos bucales.
Deje el complejo cefálico como está para su posterior procesamiento antes de la visualización. De lo contrario, para visualizar directamente el complejo cefálico, sepárelo de la epidermis y colóquelo en una gota de medio de montaje a base de glicerol, como un escudo vectorial. Utilizando el protocolo descrito, se indujeron tumores en el ojo.
Los tumores benignos permanecen localizados en el disco anin del ojo donde se inducen. Nótese que el tejido marcado con GFP no ha migrado a órganos contiguos como el cordón nervioso ventral en el complejo cefálico que contiene tumores invasivos desde hace 10 días, se observó un crecimiento excesivo de tejido tumoral por larvas. Además, como señala la flecha roja, los tumores invadieron órganos contiguos como el VNC y los ganchos bucales.
Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo inducir genéticamente tumores benignos e invasivos, y luego visualizarlos mediante la disección del complejo cefálico intra ano gastro.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para inducir y observar tumores benignos e invasivos en Drosophila, centrándose en la cooperación entre oncogenes activados y mutaciones en genes de polaridad celular. El procedimiento incluye la disección del complejo cefálico de larvas para visualizar las características del tumor.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Oncología
- Genética
- Biología del desarrollo
Antecedentes
- Los oncogenes activados, como RAS V12, contribuyen al crecimiento tumoral.
- Las mutaciones en genes de polaridad celular, tales como scribbled, desempeñan un papel en el comportamiento tumoral.
- Drosophila sirve como organismo modelo para estudiar la dinámica tumoral.
- Comprender la invasividad tumoral es crucial para la investigación del cáncer.
Objetivo del estudio
- Inducir tumores benignos e invasivos en Drosophila.
- Visualizar las características del tumor mediante la disección de larvas.
- Explorar las interacciones entre oncogenes y mutaciones de polaridad celular.
Métodos Utilizados
- Cruzar las cepas deseadas de Drosophila para aislar la progenie larval.
- Disecar las larvas para exponer el complejo cefálico.
- Eliminar los tejidos del cuerpo graso y del intestino de las larvas diseccionadas.
- Imágenes del complejo cefálico para su posterior análisis.
Resultados principales
- Inducción exitosa de tumores benignos e invasivos en Drosophila.
- Visualización de las características del tumor mediante disección de larvas.
- Conocimientos sobre el papel de los oncogenes y las mutaciones en la polaridad celular en el comportamiento tumoral.
- Implicaciones potenciales para la comprensión de la biología del cáncer.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método confiable para estudiar la dinámica tumoral en Drosophila.
- Los hallazgos contribuyen a la comprensión de la invasividad tumoral.
- Investigaciones futuras podrían explorar dianas terapéuticas basadas en estas interacciones.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite reducir el riesgo mecanicista de las vías de invasión tumoral mediante la modelización de la progresión de benigno a maligno en un sistema genéticamente manipulable. Facilita la validación de dianas mediante el interrogatorio funcional de las interacciones entre oncogenes y genes de polaridad. El enfoque proporciona una confianza predictiva para priorizar modificadores genéticos del comportamiento tumoral en las primeras etapas del descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas mediante la evaluación de la cooperación entre RasV12 activado y la pérdida de los genes scribble, discs large o lethal giant larvae.
- Valor operativo: Permite la desestimación biológica de las vías de invasión mediante la progresión tumoral cuantificable, desde un crecimiento localizado hasta una sobrecrecencia en tejidos contiguos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara complejos cefálicos con tumores validados para la selección fenotípica posterior de supresores o potenciadores genéticos.
- Valor operativo: Estandariza los procedimientos de disección y visualización para garantizar resultados cuantitativos reproducibles sobre la localización e invasión del tumor.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Se alinea con sistemas relevantes para enfermedades al modelar interacciones genéticas conservadas en la invasividad tumoral, aplicables a las vías del cáncer humano.
- Valor operativo: Facilita la alineación de biomarcadores traslacionales al permitir el análisis de la disociación del tejido tumoral marcado con GFP y los patrones de migración.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos iniciales, al proporcionar una plataforma escalable para la genómica funcional en biología tumoral.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de vías al visualizar la expansión tumoral en complejos cefálicos intactos para evaluar modificadores genéticos de la invasión.
- Tamizaje: Permite la preparación del ensayo mediante el aislamiento estandarizado de tejido tumoral marcado con GFP para la evaluación de compuestos o supresores genéticos.
- Análisis: Genera mediciones cuantitativas del crecimiento excesivo del tumor y de la invasión orgánica para comparar condiciones en diferentes contextos genéticos.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la continuidad preclínica mediante la modelización de etapas conservadas en la progresión tumoral relevantes para sistemas de mamíferos.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para la validación de dianas en múltiples proyectos dentro de las líneas de descubrimiento en oncología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en los modelos de invasión tumoral al vincular perturbaciones genéticas definidas con resultados fenotípicos observables.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante la estandarización de la disección de larvas y la preparación del complejo cefálico para el análisis por imagen.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar confianza fenotípica en etapas tempranas sobre candidatos a supresores tumorales u oncogenes.
- Impacto en la cartera: Informa la priorización ajustada al riesgo al distinguir fenotipos tumorales benignos de los invasivos en cribados funcionales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en genética de Drosophila, microscopía fluorescente y técnicas de disección microquirúrgica.
- Depende de microscopía estereoscópica de fluorescencia y sistemas de anestesia en frío para la inmovilización de larvas y el manejo de tejidos.
- Necesita la estandarización entre equipos en los protocolos de mantenimiento de cepas, temporización de cruces y estadios larvales.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el modelo a otros tipos de tumores o fondos genéticos distintos del disco ojo-antenal.
- Limitado por la necesidad de una estadificación precisa (día 5–6 para tumores benignos, día 10 para tumores invasivos) para asegurar ventanas comparables de progresión tumoral.
