Name: Intracelular de grabación, Sensorial Asignación de campos, y el cultivo de neuronas identificadas en el Leech, Hirudo medicinalis /i (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-04T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Aprende a realizar grabaciones intracelulares y mapear campos sensoriales en ganglios de Hirudo medicinalis. Este método permite estudiar neuronas individuales y sus conexiones en un modelo de neurociencia accesible.

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1. Preparación de electrodos y solución salina <ol><li> Preparar solución salina fisiológica y los electrodos antes de que se diseccionó el animal. La solución de la sanguijuela en dos colores consta de lo siguiente: NaCl 115,3 mM, 1,8 mM de CaCl2, 4,0 mM de KCl, 10 mM Tris / ácido maleico o HEPES. Ajustar el pH a 7,4. </li><li> Preparar un alambre de Ag-Cl por inmersión de un alambre de plata limpiado en una pequeña cantidad de lejía durante 20 min o hasta que el alambre tiene un acabado liso de color gris oscuro. Lavar el hilo con agua destilada antes de usar. A continuación, coloque el cable en un soporte micropipeta que se conecta al amplificador. </li><li> Preparar un electrodo de vidrio afilado de vidrio de borosilicato con un extractor pipeta. La resistencia del electrodo debe ser del orden de 20 MΩ. </li><li> Rellene la pipeta con solución de acetato de potasio 3 M y insertas en el soporte micropipeta. </li><li> Para un electrodo extracelular preparar una pipeta de vidrio afilado como se describe más arriba, romper la punta hacia atrás porfrotando otra pipeta afilada cerca del borde afilado. Luego disparar pulir la punta para que no se rompa las conectivas. Electrodos extracelulares de plástico también trabajarán siempre y cuando exista un buen contacto entre el electrodo y el nervio. </li><li> Introducir el electrodo extracelular de grabación en un soporte micropipeta (con alambre de Ag-Cl) que está equipado con un tubo de goma y una jeringa para la aspiración. Utilice la jeringa para extraer la solución salina en el electrodo al menos al nivel de la alambre de plata. </li><li> Configurar el hardware (amplificador y aislador de estímulo) y los parámetros de grabación de software siguiendo el manual de la unidad de grabación de la señal específica. Ver Leksrisawat et al. 22 para ver los detalles sobre los equipos utilizados en los experimentos descritos a continuación. </li></ol> 2. Ventral Ganglio Disección <ol><li> Diseccionar la sanguijuela en un gran plato de silicona elastómero forrado con solución de Ringer sanguijuela. Si el animal se estira longitudinalmente seserá más fácil para quitar el cordón nervioso ventral (Figura 1A). </li><li> Con # 10 o # 11 bisturí tamaño, hacer una incisión longitudinal con cortes muy superficiales en la línea media ventral. Sobre el medio de 2/3rd del corte ventral se muestra en la Figura 1B. Trate de no cortar a través de la media negro (el seno sanguíneo ventral) hasta que el animal está completamente abierta y el seno de sangre se extendía sin doblarlo. El seno maxilar sangre corre a lo largo del animal a lo largo de la línea media ventral. La VNC está contenido dentro de este vaso sanguíneo. </li><li> Después de la piel se ha reducido la longitud completa del animal utilizar las tijeras de iris finas a Nick el seno de la sangre (Figura 2). Deslice una hoja de la tijera iris finas debajo de los senos y aumentar ligeramente la hoja para separarla del tejido nervioso. Cortar el seno de la longitud de la VNC evitando al mismo tiempo las raíces de los nervios, los nervios segmentarios, o las conectivas entre ganglios. </li><li> A continuación, retire parte del cordón nervioso ventral porcortar las raíces distales al lugar donde el vaso sanguíneo se une a las raíces. Repita este proceso para cada ganglio lo largo de la longitud del cordón nervioso ventral. </li><li> Transferencia de un segmento de uno o dos ganglios a un plato de Petri pequeña. Los ganglios o el único ganglio tiene que ser clavado tensa con cierta holgura. </li><li> Pin de los conectivos y las raíces para la vaina glial ganglio se estira un poco para evitar que los cuerpos celulares de las neuronas de moverse cuando empalar a través de la vaina de la glía y en la neurona de interés. Los pasadores deben ser colocados a través del seno negro para las raíces y en el medio de los dos conectores para minimizar el daño de los axones (Figura 3). </li><li> Coloque la placa de Petri con la preparación en el microscopio y fijarlo con cera en el fondo del plato para evitar el movimiento. </li><li> Enfocar con cuidado el haz de luz con un espejo y un condensador de luz para ver las neuronas como en la figura 4A (que se muestra esquemáticamente en la Figura 4B </stRong&gt;). Fíjese en las dos grandes Retzius células en el centro del ganglio. </li><li> Para hacer una grabación intracelular del Rz, T, P y N neuronas, coloque cuidadosamente la punta del electrodo sobre la célula de interés y baje con cuidado la punta hasta un hoyuelo se ve en la vaina glial. </li><li> Toque en el portaelectrodo o manipulador (con mucho cuidado) de modo que la punta del electrodo &quot;pops&quot; en la célula de interés. </li><li> Inyectar pulsos cortos (30-40 mseg) de corriente positiva (1-10 nA) en la célula para evocar potenciales de acción. </li></ol> 3. El cultivo de las neuronas de la ventral Preparación Ganglio <ol><li> Pin el lado ventral ganglios en un plato limpio que contiene L-15 con suero de ternera fetal (FCS) (Figura 3). Fijar las raíces para que los ganglios se estiran ligeramente como se hizo anteriormente para registros intracelulares. Con las tijeras finas, mella la cápsula glial en un extremo, deslizar una hoja de las tijeras debajo de la cápsula, luego se corta a través de la cápsula de la glíacomo se muestra en la Figura 5A. </li><li> Añadir 100 l alícuota de colagenasa / dispasa al plato y colocar en un agitador durante 15 min. Examine las células moviendo los medios de cultivo alrededor de los cuerpos de las células expuestas. Volver a las células para el agitador durante otros 15 minutos o más hasta que las células salen con succión mínima. </li><li> Utilizar una pipeta unida a una jeringa para extraer suavemente las células del ganglio. Fuego pulir la punta de la pipeta de manera que es ligeramente mayor que el diámetro del cuerpo celular. Para las células Rz en una sanguijuela adulto, el diámetro debe ser de aproximadamente 50 micras. </li><li> Preparar una variedad de pipetas con diferentes diámetros sin un filamento ya que esto disminuye las posibilidades de que las células se pegan en el interior de la pipeta. Guarde las pipetas en un frasco que contiene 80% de etanol (EtOH) con una bola de algodón en la parte inferior para proteger las puntas se astille. Recuerde lavar el EtOH fuera de la pipeta con el medio antes de aspirar las células. </li><li> Después del tratamiento enzimático, lave elmedio con L-15 (con FCS) 2x que contiene la enzima. Identificar las células de interés y extraer suavemente en la pipeta tirando de la jeringa (Figura 6A). Descargue las células aspiradas en otro plato que contiene L-15 (con FCS). </li><li> Hasta ahora, todos los procedimientos fueron no estéril. Realice los siguientes pasos en una campana estéril. Ponga 3-4 gotas grandes de L-15 estéril (con FCS) en diferentes ubicaciones dentro de una placa de Petri estéril. </li><li> Pipetear las células en una de las gotas antes mencionados-, que sopla a su alrededor en la caída de lavarlos. Repita este en serie en 3 o 4 gotas de medio. </li><li> Colocar las células en una placa de Petri limpia llena con L-15 (con FCS). </li><li> Se incuban las células durante 1-24 horas a temperatura ambiente. Posteriormente las células limpias se pueden sembrar. Al dejar las células durante unas horas o toda la noche la matriz extracelular se desprende fácilmente. Placa de las células inmediatamente para generar procesos más largos. </li><li> Utilice sustrato estéril para cubrir una micropocillos di<html> sh y deje que se seque por completo (durante la noche) antes de cultivar experimentos. </li><li> Después de que el plato se ha recubierto, lavar el plato suavemente con agua estéril y después con una pequeña cantidad de medio L-15. Recuerde que debe utilizar la solución de L-15 sin el FCS añadido para permitir que las células se adhieran al plato. El medio se puede cambiar suavemente a L-15 con FCS después de que las células se han adherido al sustrato. Si las células se van a utilizar unas pocas horas después de la siembra, a continuación, cambiar el medio a L-15 con FCS no es necesario. </li><li> Colocar las células junto a la otra en el momento de la siembra para inducir la rápida sinaptogénesis (Figura 6B). Después de 24 horas medida la actividad fisiológica en los emparejamientos de las neuronas. </li><li> Utilice intracelulares técnicas electrofisiológicas para grabar RP o las respuestas sinápticas en pares cultivadas de células (1 estimular las neuronas a través de un electrodo y de registro intracelular respuestas de la célula se combina el uso de un segundo electrodo intracelular). </li></ol>título &quot;&gt; 4. Ganglio cuerpo Preparación pared <ol><li> Pin el lado dorsal de sanguijuela en un plato de elastómero forrado como se describió anteriormente. </li><li> Pin de la piel a un lado con las raíces en el otro lado del ganglio cortada (Figura 7A, ampliada en la Figura 7B) o hacer una ventana en la cara ventral de la sanguijuela más de un ganglio (Figura 7C) con todas las raíces para el cuerpo pared intacta. </li><li> Después de obtener un registro intracelular estable en una de las células sensoriales (T, P, N) utilizar una varilla de vidrio pequeño que ha sido pulida al fuego hasta que toque ligeramente la piel en el mismo segmento. Si la neurona que se está grabando a partir de una célula es N, entonces se necesita más presión para ser aplicado a la piel. En la mayoría de los casos, la celda N sólo responderá si la piel se pellizca con pinzas. Por esta razón, estas células deben ser juzgados última como se podría dañar la piel o desplazar la recodificación intracelular perturbando la preparación de tal manera. </li><li> Uno debe sercapaz de esbozar rápidamente en la piel y ganglio con detalles suficiente que un mapa de donde uno tocado se puede utilizar para determinar el campo receptivo de una neurona particular. Después de la grabación de la mayor cantidad de células T y P como sea posible en ambos lados de un ganglio tratar las N células. </li><li> Con el fin de examinar si las neuronas sensoriales tienen procesos que viajan a través de los conectores de manera rostral o caudal y luego de sus raíces en el segmento adyacente a la piel, las conectivas entre ganglios se pueden cortar y los campos receptivos reexaminados en lo que respecta a la propagación de la detección. Básicamente se está examinando si se ha producido ninguna pérdida en el campo receptivo. </li></ol> 5. La inyección de Colorantes Fluorescentes <ol><li> Preparar un ganglio sanguijuela como se describió anteriormente. </li><li> Llenar un microelectrodo con una solución de amarillo Lucifer-CH (3,0%) y cloruro de litio (300 mM). </li><li> Madero con una de las células sensoriales o células Rz en el lado ventral del ganglio como se describeanteriormente. </li><li> Inyectar colorante en la célula por el paso de corriente negativa (3 nA) a través del electrodo durante 15 min. Establezca la duración de pulso de 100 ms y la frecuencia de 2 Hz. </li><li> Visualice las neuronas tinte lleno excitando el tinte con una lámpara de mercurio y un filtro para FITC / GFP. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El propósito de esta serie de experimentos fue de 1) para enseñar y exponer los principios fundamentales de registros intracelulares de las neuronas identificables y 2) reconocer las formas características de las señales eléctricas que pueden surgir de estos tipos neuronales particulares utilizando sanguijuelas adultas. Hay una rica historia de las investigaciones utilizando la sanguijuela para las investigaciones neurofisiológicas y la investigación está en curso para hacer frente a las cuestiones de los circuitos neuronales y la regulación génica durante el desarrollo, así como durante la reparación y regeneración 10 sináptica. La neuromodulación, en particular a través de vías de aminas biógenas, también ha sido una línea de investigación con éxito en la sanguijuela. Mediante la adición de dopamina y otros agentes farmacológicos en el sistema nervioso a través de la solución salina, se ha demostrado que la dopamina modula redes neuronales implicados en la toma de decisiones 23 y los patrones de motor para el rastreo comportamiento 24,25. Este enfoque experimental es un simple (y barata) manera de incorporar la modulación en el laboratorio de enseñanza, y el ajuste de la composición iónica de la solución salina es una manera efectiva de enseñar a las ecuaciones Nernst y Goldman-Hodgkin-Katz. Para tener éxito con las preparaciones ganglionares que es importante contar con el ganglio tenso antes de tratar de meter un soma con un electrodo intracelular. De lo contrario, el soma se moverá al ejercer presión sobre el paquete glial. Además, cuando desheathing el ganglio para la eliminación de las neuronas para el cultivo, evitar la región de interés al cortar a través del ganglio somas de modo no están dañados, ya que se eliminan. Además, la incubación excesiva en las enzimas puede resultar en las neuronas ser demasiado frágiles para ser eliminado. Se requiere un poco de ensayo y error para lograr un momento ideal de incubación, ya que cada lote de enzimas es ligeramente diferente en sus acciones. Más investigación para optimizar los medios de cultivo podría mejorar esta técnica. VariOUS factores, tales como la presencia de insulina, azúcares, o factores de crecimiento podrían ser examinados por más tiempo el mantenimiento de cultivos. Para determinar si las células mantienen su capacidad de sintetizar transmisores, tales como la síntesis de serotonina en las células Rz, tinción de rojo neutro se puede aplicar a etiquetar procesos serotoninérgicos. Invasión También microglial al tejido lesionado y la regeneración se puede cuantificar por manchas nucleares días después de una lesión. Aunque esta preparación tiene muchos beneficios para ofrecer en el examen de la regeneración y reparación, así como los circuitos neuronales, la identificación farmacológica y molecular de los diversos subtipos de receptores en las sinapsis no se han caracterizado completamente. Una biblioteca de etiquetas de secuencia expresada está disponible 26, y el genoma sanguijuela medicinal está siendo ensamblado actualmente 27, pero la principal limitación en la sanguijuela en comparación con algunas preparaciones modelo es la capacidad de modificar el genoma de los genes selectivos en tipos de células específicos. En embriones tsu limitación se ha abordado mediante la inyección de ADN o ARN de doble cadena para regular la expresión del gen 28. La técnica de pistola génica se ha utilizado recientemente para expresar conexina invertebrados (innexin) las proteínas en las neuronas de sanguijuela. Expresión de un innexin de Hirudo verbana (Hve-inx6) es suficiente para la formación de uniones intercelulares ectópicos en la sanguijuela medicinal 29. La sanguijuela-o medicinal H. verbena por así decirlo 30 es seguro para avanzar en nuestra comprensión de la fisiología y la evolución de las sinapsis eléctricas en los próximos años.

La preparación de sanguijuela es útil para la investigación de la función de identificación (sensoriales, motoras y inter-neuronas dentro del sistema nervioso central de los animales (SNC). La propiedad útil de las neuronas de sanguijuela es que la forma de sus potenciales de acción y propiedades biofísicas son característicos de un dado tipo de célula (es decir, P, N, T, Rz). neuronas Por otra parte se pueden quitar del animal y se cultivaron en un medio adecuado en el que las células mantienen sus características eléctricas durante tanto tiempo como 45 días 1,2. Una clara ventaja del ganglio sanguijuela para el aprendizaje de cómo hacer grabaciones electrofisiológicas es que las células son característicamente y fiable dispuestos en el ganglio en un patrón que permite la identificación de distintos tipos de células de ganglio a ganglio y de animal a animal. La ubicación única y la morfología de las neuronas en los ganglios sanguijuela tomó nota de Retzius ya en 1891 3. Conocimiento de the identidad y la función de una neurona es ventajoso para la investigación de los circuitos neuronales y para la fabricación de experimentos con un tipo de célula dado. Debido a la relativamente grande cuerpos celulares de las neuronas dentro de un ganglio que son visibles con un microscopio de disección, y la somata pueden ser empalados selectivamente con microelectrodos para registrar sus propiedades eléctricas. Colorantes y grandes moléculas se pueden inyectar en células individuales y las propiedades del canal estudiados por patch clamp. Corrientes iónicas que dan lugar a las diversas formas de los potenciales de acción característicos en diferentes neuronas se han identificado 4-7. De las investigaciones en el patrón de inervación y la ramificación de las neuronas individuales dentro del sistema nervioso central, las conexiones sinápticas se han reproducido en la cultura con las neuronas identificadas 2,8. Los estudios en los ganglios sanguijuela han proporcionado información sobre el desarrollo de los circuitos funcionales que se puede medir con la electrofisiología, así como con al poe el comportamiento animal estudios. La sanguijuela CNS también ha servido como una valiosa preparación para la investigación de los mecanismos involucrados en la reparación y regeneración neuronal en todo el animal y en la cultura 4-6,9-12. En los cerebros de mamíferos, es una tarea de enormes proporciones para explicar el comportamiento en términos de las propiedades y las conexiones de las neuronas identificadas individuales. En principio se puede esperar que el estudio de sistemas menos complejos, como la sanguijuela podría ayudar a definir los mecanismos básicos que se utilizan en los animales superiores. Las conexiones que se utilizan que subyacen a un patrón de natación 13,14 y ritmicidad del corazón 15 han sido bien caracterizados en la baluma. La capacidad de algunas neuronas de sanguijuela para formar tanto la comunicación eléctrica y química es intrigante. Algunas conexiones son bidireccionales, mientras que otras son unidireccionales químicamente pero bidireccional eléctricamente 7. La comprensión de las conexiones sinápticas en el animal, así como la recreación de la misma type de las conexiones en una placa de cultivo son herramientas poderosas para la investigación de la sinaptogénesis 16-18, así como los perfiles farmacológicos de sinapsis 19. Las técnicas de registro y estimulación intracelular aquí descritos proporcionan una base para los ensayos farmacológicos y la investigación en neuroetología y desarrollo. Además, el cable de segmentaria nervioso ventral puede ser diseccionado con un parche de piel inervada. Con la capacidad de mantener un parche de piel y las neuronas vivas, campos receptores sensoriales se puede probar mediante el registro de las señales eléctricas desde el cuerpo celular (es decir, soma) de las neuronas sensoriales dentro respectiva ganglio abdominal en el SNC. De esta manera se puede evaluar la sensibilidad de las terminaciones sensoriales mediante la aplicación de diversos grados de fuerza en la piel y asignar campos receptivos: ligero toque, presión y nociva (dolorosa) estímulos 20,21. Una ventaja de esta preparación ganglio-piel sanguijuela es que uno CAn dibujar anatómicamente el mapa de campo receptivo y rastrear los procesos neuronales de las neuronas identificadas vez se están grabando las respuestas eléctricas. Los tres experimentos sanguijuela se describen a continuación pueden ser completados en múltiples ocasiones con un solo ejemplar, que hace de este un módulo de enseñanza rentable para los laboratorios académicos.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>182 silicone kit</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tris/ácido málico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lejía&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Para clorar el alambre de plata</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Para ajustar el pH</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>Para ajustar el pH</td></tr><tr><td>Colagenasa/Dispasa</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>269-638</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 con L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>041-01415H</td><td></td></tr><tr><td>Suero de ternera fetal</td><td>Ready Systems Ag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>04-001</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa-Monohidrato</td><td>Merck</td><td>8342</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de gentamicina&amp;nbsp;</td><td>cualquier proveedor</td><td></td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Gibco</td><td>043-0503H</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>3375</td><td>Ácido libre, cristalino</td></tr><tr><td>Concanavalina A Tipo IV</td><td>Sigma</td><td>C 2010</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina Hidrobromuro</td><td>Sigma</td><td>P 7890</td><td>PM 15-30.000</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Placa de micropocillos, 60 x 10 &amp;mu;l</td><td>Falcon</td><td>3034</td><td>Fondo plano, 10 por bolsa</td></tr><tr><td>Herramientas de disección</td><td>World Precision Instruments</td><td>surtido</td><td></td></tr><tr><td>Electrodo intracelular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jaula de Faraday</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alfileres para insectos</td><td>Fine Science Tools, Inc</td><td>26001-60</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico (100X)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de fibra óptica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espejo pequeño ajustable</td><td></td><td></td><td>Para dirigir el haz de luz hacia la preparación.</td></tr><tr><td>Electrodos de vidrio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7095B5X</td><td>Caja de 200, electrodos de succión</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>World Precision Instruments</td><td>MD4-M3-R</td><td>&amp;nbsp;Puede fijarse a la base o a una varilla metálica</td></tr><tr><td>Soporte elevado para preparaciones</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alambre de plata (10/1.000 pulgadas)</td><td>A-M Systems</td><td>782500</td><td></td></tr><tr><td>Computadora</td><td>cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificador diferencial AC/DC</td><td>A-M Systems</td><td>Modelo 3000</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 26T</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td>27T</td><td></td></tr><tr><td>Etapa de cabezal</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td>Viene con el amplificador AC/DC</td></tr><tr><td>LabChart7</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cables eléctricos</td><td>cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herramientas de vidrio&amp;nbsp;</td><td>elaboración propia</td><td></td><td>Para manipular nervios</td></tr><tr><td>Cables y conectores</td><td>cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas con pera&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7</td><td>Caja de 500</td></tr><tr><td>Vasos de precipitados</td><td>cualquier empresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cera o arcilla de modelar</td><td>cualquier empresa o tiendas locales</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estimulador</td><td>Grass Instruments</td><td>SD9 o S88</td><td></td></tr><tr><td>Punta plástica para electrodo de succión</td><td>ferretería local (marca Watt&amp;rsquo;s)</td><td>&amp;frac14; pulgadas de diámetro exterior x 0,170 pulgadas de diámetro interior</td><td>Cortar en trozos pequeños. Estirar sobre una llama y recortar la punta al tamaño adecuado.</td></tr></tbody></table>

intracelular de grabación, sensorial asignación de campos, y el cultivo de neuronas identificadas en el leech, hirudo medicinalis</i

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

La sanguijuela de agua dulce, Hirudo medicinalis, es un organismo modelo versátil que se ha utilizado para tratar las cuestiones científicas en el campo de la neurofisiología, neuroetología y la biología del desarrollo. El objetivo de este informe es la consolidación de las técnicas experimentales del sistema de sanguijuela en un solo artículo que será de utilidad para los fisiólogos, con experiencia en otras preparaciones del sistema nervioso, o para estudiantes de biología, con poca o ninguna experiencia en electrofisiología. Demostramos cómo diseccionar la sanguijuela para el registro de manera intracelular de los circuitos neuronales identificadas en el ganglio. Siguiente mostramos cómo las células individuales de función conocida se pueden quitar del ganglio a ser cultivadas en una placa de Petri, y cómo grabar desde esas neuronas en cultivo. A continuación mostramos cómo preparar un parche de piel inervada que se utilizará para el mapeo de campos sensoriales o motoras. Estas preparaciones sanguijuela siguen siendo ampliamente utilizados para hacer frente a las propiedades eléctricas básicas de Networ neuralks, el comportamiento, la sinaptogénesis, y el desarrollo. Son también un módulo de capacitación apropiados para la neurociencia o la fisiología laboratorios docentes.

Grabaciones intracelulares de las neuronas sensoriales en el ganglio de la sanguijuela se caracterizan por sus distintas trazas de tensión-tiempo que se muestran en la Figura 4C. El potencial de membrana de células en reposo en las células ganglionares de la sanguijuela sanos es de -45 a -60 mV. Si los potenciales son más pequeñas (menos negativo) se debe cambiar el electrodo de vidrio, o si el potencial es aún baja, pasar a otro segmento del cordón nervioso. Potenciales de acción espontáneos con escasa amplitud pueden indicar que el electrodo está en una neurona motora. Si esto sucede en la pared ganglio-cuerpo una inyección de corriente se puede utilizar para determinar si la neurona inerva cualquiera de los músculos todavía adheridos a la piel. La neurona motora erector de anillo (AE) está en el lado ventral del ganglio (Figura 4B) y provocará que los anillos (crestas o segmentos) a subir por la activación del músculo erector de anillo. El suministro de intensidad en las células sensoriales debe evocar potencial de accións con las formas de onda característicos mostrados en la Figura 4C. Si las formas de onda tienen un aspecto diferente que podría ser debido a un puente no balanceado o compensación de capacitancia offset. Se debe consultar el manual que acompaña a la unidad de adquisición de la señal para obtener detalles sobre cómo equilibrar el puente dentro de una celda. Observe los artefactos de estímulo al principio y al final de los impulsos de corriente en la Figura 4C. Así es como los artefactos se ven cuando el puente está balanceado. Los cultivos primarios de neuronas de ganglio de la sanguijuela forman sinapsis eléctricas y químicas en el plato. Inicialmente las propiedades eléctricas de las células cultivadas no son exactamente los mismos que son in vivo. Sin embargo después de unos días los impulsos son casi indistinguibles de los registrados en el ganglio. Esto se demuestra en la Figura 6C con un par de células Rz. Después de 7 horas en la cultura de la amplitud de los potenciales sinápticos fue 1-2 mV. Después de 56 horas en la cultura sypotenciales Naptic eran mayores de 10 mV (top huellas en la Figura 6C). La forma del potencial de acción también cambia después de 56hr en la cultura. En las condiciones descritas estas células son viables durante varios días. La comunicación intercelular se puede demostrar mediante la estimulación de las raíces nerviosas o conectivas y la grabación de las neuronas en el ganglio. La estimulación de estos nervios genera potenciales sinápticos robustos y potenciales de acción en las diferentes células ganglionares. Las huellas en la Figura 8B se registraron a partir de una célula de Retzius en un ganglio que había sido eliminado del animal y fijado en un plato. El trazo negro fue evocado por un estímulo subumbral aplicada con un electrodo extracelular al conectivo. El aumento de la tensión de estímulo causado a la célula para disparar un potencial de acción (línea roja). Colorantes o peroxidasa de rábano picante fluorescente puede ser inyectado en estas células para estudiar su morfología. Amarillo Lucifer se inyectó en un Rzneurona haciendo pasar una corriente a través del electrodo negativo. Una alternativa es inyectar el medio de contraste mediante bocanadas de aire a presión. Figura 9A muestra el tinte poco después de que comenzó la inyección. Treinta minutos más tarde, el tinte ya se había difundido en las raíces de los nervios (Figura 9B). El tipo de colorante depende de la aplicación, por ejemplo, pequeños tintes de peso molecular que pueden pasar a través de uniones se utilizan para identificar las sinapsis eléctricas. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. . Sanguijuela disección ventral (A) El animal se fija detenidamente lado ventral hacia arriba en una fuente de elastómero-alineada llena con solución salina sanguijuela (B) Se realiza una incisión poco profunda que atraviesa el anterior:. Eje posterior se hace justo lateral a la línea media para evitar daños en el nervio espinal. El seno de sangre negro (que contains el cordón nervioso ventral) puede ser visto fácilmente. Nota el ganglio expuesto que es blanco en comparación con la vaina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Disección del seno negro. El vaso sanguíneo (flecha) debe cortarse con cuidado en un lado para exponer el cordón nervioso ventral (flecha doble). Deja segmentos de los vasos sanguíneos intactos alrededor de las raíces segmentarias para su uso como un mango para manipular el cordón nervioso ventral cuando se transfieren entre disección y platos de grabación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig2highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 3"fo: content-width = &quot;3in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50631/50631fig3.jpg&quot; width = &quot;400px&quot; /&gt; Figura 3. Sección aislada de la cordón nervioso ventral. Fijación de la cordón nervioso ventral por los fragmentos de los vasos sanguíneos restantes en las raíces segmentarias y en los extremos de las conectivas segmentarias expone los ganglios para registros electrofisiológicos. Un tenso estiramiento de los ganglios permite ver los cuerpos de las células identificables y permitirá una penetración más fácil de la vaina glial con un electrodo de vidrio agudo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. Anatomía celular del ganglio sanguijuela. (A) Lo ideal sería que las células de Retzius (R) y otros órganos de células grandes (P-prensaUre, T-touch, N-nociceptivo, erector AE-anillo) será claramente visible si el microscopio y el condensador de luz están configurados correctamente. (B) Representación esquemática de las células en el ganglio. Pequeñas diferencias en la ubicación de los somas se producirán en cada ganglio debido a cómo se estira el ganglio y fijó tensa. Potenciales (C) Acción grabadas desde el soma de estas neuronas tienen formas de onda característicos. Estos picos fueron evocados mediante la inyección de corriente positiva en la célula (pulso cuadrado superponer las trazas en tiempo de tensión). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig5.jpg" width="600px" /> Figura 5. Desheathing el ganglio para eliminar cuerpos celulares individuales. (A) La vaina glialse debe cortar cuidadosamente a través del ganglio para evitar dañar las células de interés. La línea roja indica un corte para evitar golpear el soma de las neuronas Rz. Abrir la vaina da las enzimas digestivas acceder a la matriz de tejido conectivo. (B) los cuerpos celulares sanas abultamiento del ganglio después de la vaina glial se ha abierto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig5highres.jpg" target="_blank">Haz click aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig6.jpg" width="600px" /> Figura 6. El cultivo de neuronas del ganglio de sanguijuela. Las células (A) se aspiran desde el ganglio utilizando una micropipeta y se transfieren a un plato que contiene medios de cultivo. (B) colocar múltiples células cerca uno de otro aumentará la tasa de sinaptogénesis entre las neuronas identificables. Aquí el estudiantemps de dos neuronas han formado una sinapsis. (C) Las neuronas en la cultura de exposiciones ligeramente diferentes propiedades eléctricas. Los principales vestigios muestran potenciales sinápticos evocadas por la estimulación de la célula adyacente 7 horas y 56 horas después se sembraron las células. Las huellas inferiores fueron evocados mediante la inyección de corriente directamente en una de las celdas Rz. Tenga en cuenta el aumento de la amplitud del potencial sináptico y cambiar en el potencial de acción de forma de onda después de 56 horas en cultivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig6highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="La figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig7.jpg" width="600px" /> Figura 7. La preparación de la pared ganglio-cuerpo sanguijuela para campos receptivos de mapeo. (A) Un enfoque es eliminar toda una sección de la pared del cuerpo a lo largo con 1-3 ganglios. Aquí las raíces de un lado han been corte y el ganglio ha sido fijado a los lados. (B) Un Fijado hacia fuera ganglio a mayor aumento. (C) Otro enfoque es crear una pequeña ventana en la pared del cuerpo y el registro de los ganglios intacta, mientras que la asignación de un campo receptivo . (DG) Cada una de las neuronas sensoriales exhibe una respuesta característica a un estímulo mecánico. (D) Un toque de luz evoca la actividad en las células T, pero no en P o N células. (E) La respuesta de las células T se apaga en respuesta a la fuerte estímulos, dando lugar a la activación de la célula P. A medida que el estímulo se hace más fuerte las N células se activa (FG). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig7highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig8.jpg" width="600px" /> FigurE 8. actividad evocada en el ganglio de la sanguijuela. estimulación extracelular de las conectivas se puede utilizar para conducir la transmisión sináptica en el cordón nervioso. (A) Esto se hace uniendo un electrodo de succión a uno de los conectores y la aplicación de un pequeño voltaje. El electrodo de vidrio afilado (flecha) se puede ver empalar a una celda de Retzius en el ganglio. (B) trazas de tensión-tiempo que muestran el artefacto de estímulo seguido de un potencial sináptico (negro) y un potencial de acción (rojo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig8highres.jpg" target="_blank">Haz click aquí para ver más grande imagen</a> . <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig9.jpg" width="600px" /> Figura 9. Inyectar líquido de contraste en las neuronas de sanguijuela. (A) de color amarillo Lucifer se puede inyectar en el soma pasando corriente through el microelectrodo grabación. Una lámpara de mercurio y el filtro para FITC se pueden utilizar para visualizar la fluorescencia. (B) Dye ha difundido en el Rz axones alrededor de 30 minutos después de la inyección. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig9highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> .

Este artículo describe tres preparaciones del sistema nervioso usando sanguijuelas: registro intracelular de las neuronas en los ganglios ventrales, el cultivo de neuronas de los ganglios ventrales, y grabe de un parche de piel inervada asignar campos sensoriales.

Intracelular de grabación, Sensorial Asignación de campos, y el cultivo de neuronas identificadas en el Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

El objetivo general de este procedimiento es aprender cómo preparar ganglios de sanguijuela para realizar grabaciones intracelulares a partir de neuronas individuales, cómo preparar un parche de piel para mapear un campo receptivo sensorial y cómo cultivar neuronas de sanguijuela. Esto se logra primero utilizando hielo para anestesiar a la sanguijuela y fijarla en posición dorsal hacia arriba. El siguiente paso consiste en diseccionar aproximadamente tres ganglios separados y extenderlos para la grabación. El paso final consiste en ensartar las neuronas individuales y registrar los potenciales de acción. En general, el comportamiento de la red neuronal puede caracterizarse mediante caracterizaciones fisiológicas de los diversos tipos celulares junto con experimentación. La principal ventaja de utilizar leches frente a otras preparaciones invertebradas simples como babosas S o crustáceos radica en que los ganglios poseen poco más de 400 neuronas fácilmente accesibles, y estas neuronas pueden mantenerse activas en cultivo durante varios días.La demostración visual de este método es fundamental, ya que la preparación de la piel y la extracción de neuronas individuales son difíciles de aprender. Es posible dañar fácilmente un ganglio que invade una porción de piel o dañar las neuronas durante su cultivo. Una pregunta que surge naturalmente al enterarse de que se va a ver una película y leer un texto sobre el sistema nervioso de la sanguijuela es: ¿por qué diablos trabajar en un cerebro de invertebrado cuando el cerebro humano es mucho más interesante?Y si usted fuera a trabajar con un invertebrado, ¿por qué elegiría la sanguijuela, un animal horrible, repugnante, que segrega sangre y moco de forma repentina? Bueno, existen varias razones válidas para ello. La primera es que la sanguijuela tiene un sistema nervioso extremadamente simple en comparación con el nuestro.Y en él se pueden estudiar células nerviosas individuales, observar cómo están conectadas y ver cómo esas conexiones dan lugar al comportamiento de un animal, de una manera que sería imposible hacerlo en un animal más complejo. Otra razón es que la sanguijuela, que fue introducida por primera vez en la neurociencia en 1960 por Stephen Koffler, ofrece oportunidades para estudiar problemas básicos que en realidad son relevantes para comprender el funcionamiento de nuestro propio cerebro. Y existen muchos ejemplos a los que podría referirme.Una es que la mayoría de las células en el cerebro, nuestros cerebros, no son células nerviosas, sino las llamadas células gliales, células satélite, que fueron estudiadas por primera vez en la sanguijuela, y luego, una vez que se comprendió cómo funcionaban allí, se pudo verificar si eran similares en nuestros propios cerebros, y lo son, lo cual también fue importante para muchas aplicaciones clínicas. Pero la razón principal para trabajar con este animal, como verá en la película, es que posee un sistema nervioso hermoso. El sistema nervioso consiste en una cadena de ganglios, grupos de células nerviosas, en número limitado.Puede observarse todas las células de las que se puede registrar individualmente. Se puede determinar cómo están conectadas, de manera similar a estudiar un mapa del metro de París. Y es esta belleza lo que hace que esta preparación sea tan fascinante para trabajar, junto con la capacidad de descubrir ciertos principios fundamentales antes de comenzar la disección.Asegúrese primero de configurar el software de grabación y el electrodo de registro. Prepárese para diseccionar una sanguijuela en un recipiente grande revestido de elastómero de silicona lleno con solución de Ringer utilizando alfileres. Extienda el animal con la cara ventral hacia arriba con un escalpelo número 10 o número 11.Realice una incisión longitudinal con cortes muy superficiales a lo largo de la línea media ventral. Trate de no cortar a través del seno sanguíneo ventral hasta que el animal esté completamente abierto y el seno sanguíneo esté estirado sin torsiones. Ahora el VNC está contenido dentro.Utilice tijeras finas de iris para hacer una pequeña incisión en el seno sanguíneo; deslice una hoja de las tijeras bajo el seno y levante ligeramente la hoja para separar el seno del tejido nervioso. A continuación, corte el seno a lo largo de la cuerda nerviosa ventral evitando las raíces nerviosas, los nervios segmentarios o los conectivos entre los ganglios. Luego, retire parte de la cuerda nerviosa ventral cortando las raíces distales al punto donde el vaso sanguíneo se une a las raíces.Ahora transfiera el ganglio a un recipiente limpio lleno de solución salina y sujételo mediante las raíces nerviosas y los conectivos. Utilice este preparado para obtener grabaciones intracelulares de los cuerpos celulares de las neuronas sensoriales. Sujete los ganglios con el lado ventral hacia arriba en un recipiente limpio que contenga L 15.Con FCS fetal, las raíces deben estirarse ligeramente con tijeras finas. Haga una pequeña incisión en la cápsula glial en un extremo, deslice una hoja de la tijera debajo de la cápsula y atraviese la cápsula. A continuación, agregue 100 microlitros de colagenasas dys displays al recipiente y coloque el recipiente en un agitador durante 15 minutos; posteriormente, examine las células moviendo el medio de cultivo alrededor de los cuerpos celulares expuestos.Devuelva las células al agitador durante otros 15 minutos o más hasta que puedan extraerse del ganglio utilizando una succión mínima con una pipeta de punta pulida con llama y un diámetro interno de aproximadamente 50 micrones, ligeramente mayor que el diámetro del cuerpo celular. Para liberar la MEC de las células, agregue unas gotas de medio L 15 con FCS a las células e incúbelas durante algunas horas hasta 24 horas a temperatura ambiente. Cuando estén listas, siembre las células una al lado de la otra en una placa de pocillos recubierta con sustrato.Con medio L 15. No utilice FCS. Después de 24 horas, estarán listas para la electrofisiología y permanecerán viables durante varios días.Inicialmente, las propiedades eléctricas no son exactamente iguales a las de una preparación in vivo. Sin embargo, después de unos días, los impulsos son casi indistinguibles. Fije la sanguijuela con el lado dorsal hacia abajo en un recipiente revestido de elastómero como se describió previamente.A continuación, sujete la piel a un lado con las raíces en el otro lado del ganglio seccionado. Alternativamente, realice una ventana en la cara ventral de la sanguijuela sobre un ganglio, manteniendo intactas todas las raíces hacia la pared corporal. Tras obtener una grabación intracelular estable en una de las células sensoriales, utilice una pequeña varilla pulida con fuego para tocar ligeramente la piel en el mismo segmento con las células t y p.El tacto ligero sobre la piel generará una respuesta eléctrica. En el caso de las células terminales, se requerirá mayor presión por parte de la varilla, y en la mayoría de los casos, una célula terminal solo responderá si la piel se pellizca con pinzas. Por lo tanto, para minimizar posibles daños tisulares, registre primero de las células N para determinar si las neuronas examinadas tienen prolongaciones en ciertas ubicaciones.Se pueden cortar las conexiones entre ganglios y volver a examinar los campos receptivos en busca de cualquier pérdida. Las grabaciones intracelulares de neuronas sensoriales en el ganglio de la sanguijuela se caracterizan por sus trazos temporales distintivos. Su potencial de reposo está entre menos 45 y 60 milivoltios.Si se mide un valor más bajo, se debe utilizar una nueva sonda de vidrio o una nueva preparación. Los potenciales de acción espontáneos con una pequeña amplitud indican que la célula podría ser una neurona motora. En la preparación de la pared corporal del ganglio, se puede utilizar una inyección de corriente para determinar si la neurona inerva algún músculo aún adherido.Por ejemplo, la neurona motora del erector del anillo ubicada en el lado ventral del ganglio hará que el ojo anular se eleve. Si tras la inyección de corriente se observa una forma de onda no característica, podría deberse a un puente desequilibrado o a una compensación inadecuada de la capacitancia de desplazamiento. Cuando el puente está equilibrado, se observan artefactos de estímulo al principio y al final de los pulsos de corriente tras siete horas.En cultivo primario, se realizaron mediciones en un par de células de los retia. La amplitud de los potenciales sinápticos fue de aproximadamente uno a dos milivoltios. Después de 56 horas en cultivo, los potenciales sinápticos fueron superiores a 10 milivoltios.La forma del potencial de acción también cambió. En la misma preparación, se estimularon las raíces nerviosas o los conectivos. El trazo negro fue evocado por un estímulo subumbral aplicado con un electrodo extracelular al conectivo.El trazo rojo muestra cómo el aumento del voltaje del estímulo provocó que la célula generara un potencial de acción. Se realizó una inyección de amarillo de Lucifer en una célula retia pasando una corriente negativa a través del electrodo. Poco después de la inyección, el colorante permaneció localizado en el soma.Media hora después, el colorante ya se había difundido en las raíces nerviosas tras su desarrollo. Esta técnica ayuda a los investigadores en el campo de la neurobiología a explorar los mecanismos subyacentes detrás de las formas de los potenciales de acción y a investigar más a fondo la circuitería neuronal. Asimismo, promueve la comprensión de la regeneración y la reparación en neuronas identificables.Este vídeo demuestra una serie de técnicas experimentales. El uso del leach podría aplicarse a la sinaptogénesis, la neuromodulación o aspectos fundamentales de la neurofisiología.

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