Impresión Moldes inversa termosensible para la Creación de modelado hidrogeles de dos componentes para el 3D de cultivo celular

El objetivo general de este procedimiento es imprimir un molde inverso para crear hidrogeles de dos componentes con patrones para el cultivo celular en 3D. Esto se logra imprimiendo primero un molde inverso a partir de un polímero termorreversible, que es un líquido a cuatro grados centígrados, pero un gel blando a temperatura ambiente. Este molde inverso puede ser eludido más tarde.

El segundo paso es llenar el molde inverso con un biopolímero de su elección. Aquí usamos aros. El biopolímero se puede reticular mediante reticulación enzimática, UV o de temperatura.

A continuación, se alude al molde inverso sumergiendo el molde en agua fría. Después de este paso, el molde AROS resultante está listo para su posterior procesamiento. El paso final es llenar los vacíos con un segundo biopolímero, que podría contener células y se puede reticular por medio de enzimas, luz ultravioleta o temperatura.

En última instancia, hemos establecido un método reproducible para crear andamios de cultivo de células D organizados espacialmente. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando un colega sugirió que podíamos aprovechar las propiedades termosensibles de Oxr utilizándolo como molde de sacrificio. La demostración del procedimiento estará a cargo de Misha Muah, un estudiante graduado de mi laboratorio.

Para comenzar, agregue 60 mililitros de solución helada de PBS en una botella de vidrio y revuelva vigorosamente con un revolvimiento magnético. Luego pese 24,5 gramos de Paul ER y agréguelo en pequeñas cantidades al PBS frío. Espere hasta que el Paul Oxr se haya disuelto parcialmente en el PBS antes de agregar más.

Continúe revolviendo la solución hasta que todo Paul Oxr se haya disuelto. A continuación, agregue PBS helado adicional hasta alcanzar un volumen final de 100 mililitros, produciendo una concentración final de 24.5% de peso por volumen. Luego revuelve la mezcla hasta que esté bien mezclada.

Deja de remover la solución y déjala reposar a cuatro grados centígrados durante la noche hasta que las burbujas y la espuma de la solución hayan desaparecido. Las burbujas que quedan atrapadas dentro del gel se transfieren al cartucho de la impresora y provocarán defectos en los moldes de sacrificio impresos. Estéril Filtre la solución directamente en el cartucho de impresión utilizando un filtro de preenfriamiento para eliminar cualquier partícula no deseada que pueda obstruir la aguja.

Guarde el cartucho a cuatro grados centígrados hasta 30 minutos antes del experimento. Prepare la válvula solenoide y la aguja para imprimir colocándolas en tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mililitros llenos de agua ultrapura y sindicando durante 30 minutos. A continuación, enjuague las válvulas limpias con etanol y séquelas con una pistola de nitrógeno.

A continuación, instale la válvula solenoide limpia y la aguja en la impresora. Además, instale un cartucho de impresión limpio vacío para probar el sistema. Aplique una presión de tres bares al sistema y sople los líquidos residuales de la válvula y la aguja instaladas con aire comprimido.

Para diámetros de aguja pequeños. Instale un filtro a la salida del aire comprimido para evitar la entrada de pequeñas partículas que podrían obstruir la aguja. A continuación, apague la presión.

Cuando la presión haya caído a cero, instale el cartucho precargado con el poly oxr. El cartucho debe sacarse del refrigerador aproximadamente 30 minutos antes de montar el cartucho para que el poly oxr líquido aún pueda alcanzar la temperatura ambiente y gelificar antes de imprimir. Compruebe si el poly oxr está gelatinoso volteando el cartucho.

A continuación, aplique tres bares de presión al sistema y dispense Paul Emer hasta que llegue a la punta de la aguja y se extruya en una hebra continua. Utilizando el software bio CAD, dibuje una sola línea de aproximadamente la misma longitud que la estructura que desea imprimir en el menú de configuración del software de la impresora. Ajuste la válvula solenoide a una frecuencia alta de 50 hercios en la sección de parámetros y ajuste manualmente el ajuste de alta presión a tres bares.

A continuación, coloque un microscopio de vidrio, deslícelo en la impresora y asegúrelo en su lugar encendiendo la aspiradora. A continuación, imprima una capa de una sola línea con una velocidad de etapa de 300 milímetros por minuto. Obtenga el ancho de línea deseado reduciendo la presión a mano y los ajustes de frecuencia en el software para cada nueva línea, asegúrese de que la línea permanezca continua.

Si la línea dibujada está interrumpida, se ha alcanzado el límite inferior. Una vez que se logra una línea continua con el ancho deseado, determine la velocidad óptima de la etapa y el grosor de la capa verificando si hay defectos en las construcciones impresas. Para ajustar el grosor de la capa, es posible que también sea necesario reajustar ligeramente la presión y la frecuencia.

Para probar el ajuste del grosor de la capa, imprime varias capas una encima de la otra y observa que la aguja está en la posición correcta por encima de la capa anterior. Ajusta el grosor de la capa para que cada capa se imprima directamente encima de la anterior. Para optimizar la velocidad de la etapa, comience disminuyendo la velocidad de la etapa de 300 milímetros por minuto de forma escalonada para que las capas extruidas comiencen y terminen en las mismas posiciones que las anteriores.

Si el escenario se mueve demasiado rápido, aparecerá un patrón ondulado en la parte superior de la capa. Para imprimir estructuras de pilares, dibuje un solo punto en lugar de una línea en el software CAD. A continuación, ajuste la presión y la frecuencia para regular el grosor de la capa y el diámetro del pilar y el tiempo de paso del cabezal de impresión para maximizar la velocidad de impresión.

Una vez optimizados, guarde los parámetros para su uso posterior. En primer lugar, imprime la estructura interna, como este conjunto de pilares, en un portaobjetos de microscopio de vidrio y déjalo secar. El secado nocturno reduce el tamaño y el grosor de las estructuras y proporciona una mejor adherencia entre la estructura y el sustrato.

Al día siguiente, dibuja una estructura que consista en un muro exterior que rodee las estructuras que pretendes haber eludido y rellenado. La pared de polímero debe imprimirse al menos a 3,5 milímetros de distancia de las estructuras internas debido a las dimensiones de la aguja. A continuación, prepare una mezcla de 1%aros en agua desionizada calentándola en el microondas una vez que esté completamente disuelta.

Enfríe la solución agrícola entre 35 y 45 grados centígrados. A continuación, llene el molde de sacrificio con la solución agrícola utilizando una pipeta. Esto debe hacerse lentamente para evitar la destrucción de la estructura dentro de la pared.

Una vez lleno, coloca el molde a cuatro grados centígrados para solidificar el gel. Después de unos 10 minutos, retire el gel de la nevera y colóquelo en un baño de hielo durante 10 minutos para eluir la estructura del polímero. A continuación, retire la estructura con cuidado y elimine el agua residual secándola con un pañuelo de papel.

Presione la estructura con cuidado sobre un nuevo portaobjetos de microscopio de vidrio para crear un buen sellado que evite la fuga del tercer hidrogel. A continuación, prepare una solución al 1% de metacrilato de alginato en cloruro de sodio 0,15 molar. Vortex la solución para disolver el metacrilato de alginato.

A continuación, añada un 2,5%volumen al volumen. Alexa, 4 88 fibrinógeno conjugado y 0,05%peso por volumen. Litio fenil 2 4 6 trimetilbenzoilo fosfato para obtener un tercer hidrogel que se puede visualizar fácilmente mediante fluorescencia.

Coloque esta solución en una jeringa de 0,3 mililitros equipada con una aguja de calibre 30. A continuación, utilice la jeringa para rellenar los huecos dejados por el polímero eluido. Asegúrese de llenar completamente cada columna expulsando el polímero a medida que se extrae la aguja de cada columna.

Finalmente, fotopolimerice el polímero inyectado con una lámpara UV de alta intensidad durante cinco minutos y luego obtenga imágenes de la construcción utilizando un microscopio de epifluorescencia o confocal. Aquí se muestra una reconstrucción en 3D de Zack de una construcción similar a la que se acaba de fabricar, el alginato marcado con fluorescencia que se usa para el relleno. Las formas de los pilares aparecen como columnas verdes y la parte exterior de la construcción es transparente.

Las técnicas que se muestran en este video son ampliamente adaptables a muchos arreglos 3D diferentes, como los círculos concéntricos que se muestran aquí. La resolución depende del diámetro de la aguja. La aguja de 150 micras de diámetro utilizada para este diseño puede producir hebras de entre 120 y 200 micras de diámetro.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de los pasos involucrados en la impresión de oxr. Hemos demostrado el uso de oxr como molde de sacrificio para crear hidrogeles de patrón, pero el oxr también se puede estabilizar contra los rayos UV si se utiliza una versión del polímero relacionada con la fabricación.