Microglia cultivo del Sistema Nervioso Central Neonatal y Adultos

El objetivo general de este procedimiento es aislar las células microgliales primarias de la corteza neonatal del ratón o de la médula espinal de un ratón adulto. Esto se logra extirpando primero el cerebro de un cachorro de ratón de día cero o dos postnatales o de una médula espinal adulta. A continuación, se extraen las cortezas del tejido neonatal o se digiere el tejido de la médula espinal.

A continuación, las células de tejido cortical y espinal se cultivan hasta su uso experimental. En última instancia, las células microgliales neonatales y adultas recolectadas se pueden analizar mediante microscopía inmunofluorescente. La principal ventaja de nuestro protocolo de cultivo de microglía neonatal sobre los métodos existentes, como la agitación de células microgliales para placas corticales mixtas, es que las células vuelven fácilmente a un estado de reposo y pueden proporcionar una imagen más precisa del comportamiento de las células microgliales in vivo.

La principal ventaja del cultivo en microglía de la médula espinal adulta es que las células se pueden citar en el contexto de patologías que afectan principalmente al sistema nervioso central adulto antes de la disección. Placas de cultivo de tejidos Preco de 10 centímetros con cinco microgramos por mililitro de poli de licina o PDL diluidas en agua de autoclave Después de tres horas a 37 grados centígrados, aspirar la PDL y lavar las placas una vez con agua de autoclave justo antes de comenzar la disección de la microglía neonatal. Seque las placas bajo la luz ultravioleta en una campana de cultivo de tejidos durante 20 minutos.

A continuación, utilice una toallita Kim, empapada en etanol al 70% para desinfectar las cabezas de los cachorros anestesiados después del día cero y dos después de quitar las cabezas con unas tijeras. Coloque cuatro cabezas por plato en placas de Petri de 10 centímetros que contengan una solución salina tamponada de madejas heladas. Con pinzas curvas, ancle las cabezas a través de las cuencas de los ojos y luego use micropinzas rectas para quitar cuidadosamente la piel que cubre el cráneo.

Luego, comenzando cerca del cerebelo, retire los huesos craneales, teniendo cuidado de no perforar o dañar las cortezas. Use una espátula pequeña para extraer los cerebros, acumulando los órganos en una placa de Petri fresca que contenga HBSS helado. Ahora comenzando en el lado ventral del cerebro.

Sostenga el cerebelo con las micropinzas para anclar el tejido y luego haga dos pequeñas incisiones a cada lado del mesencéfalo sin cortar todo el tejido. Extrae suavemente el mesencéfalo y el cerebelo en una sola pieza de las cortezas, que deben formar una forma cóncava. A continuación, separe las cortezas aisladas y oriente una sola corteza con el lado medial hacia arriba para una mayor disección.

Tanto en el protocolo neonatal como en el adulto, uno de los pasos más complejos es la extirpación adecuada de las meninges. También es difícil extirpar el hipocampo. En el protocolo neonatal, utilizamos una solución salina tamponada de madejas heladas para endurecer los tejidos y también utilizamos un procedimiento de disección lento y metódico para minimizar la trituración.

Retire el hipocampo en forma de media luna ubicado frente al bulbo olfatorio, que aparece como un pequeño nódulo en el extremo puntiagudo de la corteza. A continuación, voltea la corteza para ver el lado dorsal. A continuación, utilizando el bulbo olfativo como punto de partida, retira todas las meninges y el propio bulbo olfativo de la corteza.

A continuación, introduzca las cortezas disecadas en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 14 mililitros de HBSS helado en hielo. A continuación, aspire el HBSS de la Cordis y utilice una punta de pipeta P 1000 para triangular las cortezas unas cuantas veces. Agregue cuatro mililitros de tripsina EDTA a los tejidos y luego incube los tejidos a 37 grados centígrados.

Después de 15 minutos, detenga la reacción enzimática con cuatro mililitros de medio microglial completo y luego centrifugue las suspensiones celulares durante cinco minutos a 1000 veces G y temperatura ambiente. Después de un segundo lavado con cuatro mililitros de medio completo resus, suspenda el pellet celular en 10 mililitros de medio microglial completo y luego filtre la suspensión celular a través de un filtro celular de malla de 40 micras. Finalmente, coloque las células a una densidad de ocho cortezas por 10 mililitros de medio microglial en una de las placas de cultivo de tejidos de 10 centímetros recubiertas de PD L e incube las células a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Después de 10 días de cultivo celular, separe la microglía agregando 400 microlitros de lidocaína de 60 milimolares en HBSS a la placa de cultivo de tejidos e incube la placa a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. A continuación, recoja las células resuspendidas. Enjuague la placa una vez con HBSS y recoja el lavado para recuperar cualquier resto de microglía.

A continuación, agregue 0,5 molares de EDTA a la suspensión celular hasta una concentración final de cinco milimolares y luego centrifuga el resus de las células. Suspender el paladar en un mililitro de DMEM con 1%FBS y determinar el número de células viables por exclusión de azul triano. A continuación, cultive las células a la densidad experimental deseada.

Por ejemplo, para el análisis por microscopía inmunofluorescente placa las células a 2,5 veces 10 a la cuarta célula por 18 milímetros de cubreobjetos para la recolección de tejido de microglía adulta. Comience usando etanol al 70% para limpiar la columna vertebral de un ratón adulto sacrificado. Luego use un par de tijeras para cortar la piel por encima de la médula espinal y proceda a cortar el cordón desde la región T uno hasta T 12.

Corte el músculo restante de los lados de la médula espinal y luego sostenga suavemente la médula espinal con las yemas de los dedos de una mano. Use micro tijeras para cortar lentamente las vértebras sin perforar el cordón. Luego, use un par de micropinzas para extraer lentamente la médula espinal, sumerja la médula en una placa de Petri que contenga HBSS helada y luego retire todas las meninges visibles bajo el microscopio.

Ahora corte la médula espinal en segmentos transversales, de no más de dos milímetros de grosor para facilitar una digestión eficiente, y luego transfiera los fragmentos a un tubo cónico de 15 mililitros que contiene un mililitro de HBSS enfriado con hielo en hielo. Para digerir los fragmentos de tejido de la médula espinal, comience por aspirar el HBS del tejido de la médula espinal, teniendo cuidado de no alterar el tejido. A continuación, incubar el tejido en un mililitro de tripsina a 37 grados centígrados.

Después de 30 minutos, retire la tripsina y agregue tres mililitros de medio de microglía primaria que contenga suero para detener la digestión enzimática. Después de pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces para desalojar el tejido, filtre la suspensión celular a través de un colador celular de 40 micras. A continuación, mezcle una alícuota de la suspensión celular con un volumen igual de DPI y cuente las células bajo un microscopio fluorescente para determinar el número total de células viables.

Finalmente, coloque las células de tejido de la médula espinal disociadas en placas recubiertas de PD L a la densidad experimental adecuada. Realice un cambio completo de medios cuatro horas después del recubrimiento para eliminar el exceso de residuos de celdas. En este primer conjunto de imágenes, se muestran las células microgliales en reposo y activadas 24 horas después de la siembra de la microglía, la exposición de la morfología ramificada u oxidada al lipopolisacárido bacteriano del reactivo de cebado da lugar a cambios en la morfología de la microglía a una forma más ameboide a medida que las células se activan.

El globo ocular tiñe un marcador específico para los macrófagos y la proteína de la superficie celular microglial y que aparece en verde, facilita la visualización de las células. La imagen de campo claro muestra las poblaciones celulares generales y el DPI en azul resalta los núcleos e indica la pureza del cultivo. En esta imagen representativa de células aisladas de la médula espinal de un ratón adulto, se obtuvieron aproximadamente siete veces 10 a la quinta célula viable.

Los ajustes del microscopio de campo claro y fluorescencia se combinaron para visualizar las células DAPI positivas, así como la rejilla del hemocitómetro para obtener un recuento celular preciso. Microglía completamente adherida a las placas de cultivo recubiertas de PD L después de aproximadamente dos días. En cultivo aquí, se muestran en la imagen de campo claro microglía aislada de la médula espinal de ratones Mac green, que expresan GFP bajo el control de la microglía y el promotor de macrófagos CSF one R.

La microglía como lo indican las flechas azules y los astrocitos como lo indican las flechas rojas, se pueden observar una vez dominados. Esta técnica se puede completar en aproximadamente una hora siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos como la aculturación, la microglía con otros tipos de células para estudiar el efecto que tiene la microglía en otras células.

Después de este procedimiento, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la delicada disección necesaria para cultivar células neocorticales y adultas de la médula espinal, y emplear estas células en aplicaciones posteriores.