La separación de los tipos de células de espermatogénesis Usando STA-PUT Sedimentación Velocity

El objetivo general de este procedimiento es separar los diferentes tipos de células que se encuentran en los testículos. Primero, recolecta una población mixta de células del ratón. Los testículos cargan las células y el gradiente BSA en el aparato de colocación.

Ahora permita que las células se sedimenten a través del gradiente BSA. A continuación, recoge las fracciones y combínalas en función de la composición de las células. En última instancia, la sedimentación a velocidad con el soporte se utiliza para separar diferentes tipos de células de los testículos en función de las diferencias de tamaño y densidad.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los hechos, es que se pueden aislar grandes cantidades de diferentes tipos de células con una pureza bastante alta utilizando cristalería simple y gravedad. Asegure los cilindros de dos litros y la cámara de carga de la celda a la plataforma superior y conéctelo todo con dos pequeñas piezas de tubo con abrazaderas para tubos. Cierre todos los tubos y selle la boquilla en el cilindro de dos litros más a la derecha.

Coloque una barra agitadora pequeña en la cámara de carga de la celda y una barra agitadora más grande en el cilindro de dos litros más a la izquierda. Luego coloque la cámara de sedimentación de dos litros en la plataforma. Coloque el deflector metálico directamente encima de la abertura en la parte inferior de la cámara de sedimentación para evitar el vórtice del líquido y la interrupción del gradiente celular durante la recolección de fracciones.

Ahora coloque la tapa en la cámara de sedimentación. Aplique una cantidad muy pequeña de grasa de vacío a la junta de vidrio esmerilado de la llave de paso de tres vías. A continuación, sujete la llave de paso al fondo de la cámara de sedimentación, conectando las juntas de vidrio esmerilado de la llave de parada y la cámara de sedimentación.

A continuación, conecte la cámara de carga de la celda a la salida derecha de la llave de paso con tubo. Cierre la llave de paso, luego conecte el tubo de fraccionamiento de celdas a la salida izquierda de la llave de parada y sujete el tubo pequeño en la parte inferior. Vierta la solución de BSA al 2% en el cilindro izquierdo de dos litros.

Vierta la solución de 4%BSA en el cilindro derecho de dos litros. Asegúrese de que no haya burbujas grandes en el tubo que conecta estos cilindros. Vierta el tampón Krebs en la cámara de carga de la celda y llene la tubería que conecta esta cámara con la cámara de sedimentación.

Compruebe que no haya burbujas grandes que puedan alterar el degradado. Si es necesario, apriete o mueva el tubo suavemente para eliminar las burbujas. Confirme que todos los crebs estén en el tubo y no en la cámara de la celda.

Permita que una pequeña cantidad de tampón Krebs fluya hacia la cámara de sedimentación. A continuación, drene casi todo el tampón en el tubo de fraccionamiento de la célula. Para llenar el tubo y eliminar las burbujas grandes, coloque el colector de fracciones directamente debajo de la cámara de sedimentación.

Verifique que todos los tubos de fracción estén en su lugar y cúbralos con una envoltura de plástico para evitar la contaminación. Desencapsule los testículos en una placa separada que contenga ocho mililitros de Krebs. Haga una incisión en la membrana delgada que rodea los túbulos seminíferos con un par de pinzas.

Sostenga la membrana ahora con otro par de pinzas. Empuja los túbulos hacia afuera y lejos de la membrana. Transfiera cuatro mililitros de Krebs que contienen los túbulos a cada tubo cónico que contiene 25 mililitros de solución de colagenasa.

Agite a 33 grados centígrados durante 10 minutos hasta que los túbulos desarrollen una apariencia similar a la de un espagueti. A continuación, deje que los túbulos se asienten durante cinco minutos hasta el fondo del tubo. Vierta el sobrenadante y lave dos veces con 25 mililitros de Krebs a temperatura ambiente, permitiendo que los túbulos se asienten en el fondo del tubo cada vez.

Deje aproximadamente cinco mililitros de Krebs en cada tubo. Después de incubar los túbulos con tripsina. Utilice una pipeta de diámetro ancho para agitar la solución que contiene los túbulos.

Pipeteándolos hacia adentro y hacia afuera aproximadamente 10 veces. La solución debería comenzar a parecerse más a una suspensión de una sola célula. Ahora filtre cada suspensión de celda individual de 30 mililitros a través de un colador de celdas de malla de 100 micras.

Después de combinar las suspensiones de celdas, cuente el número total de celdas. Asegúrese de que la llave de paso esté colocada para dirigir el flujo desde la cámara celular hacia la cámara de sedimentación. Coloque ambas placas de la barra de agitación en una posición baja.

A continuación, vierta la suspensión celular en la cámara celular. Abra la llave de paso para que las células fluyan lentamente hacia la cámara de sedimentación a una velocidad de 10 mililitros por minuto. A continuación, cierre la llave de paso para lavar las células fuera de la cámara de la celda.

Vierta cinco mililitros de solución de BSA al 0,5% y drene en la cámara de sedimentación a una velocidad de 10 mililitros por minuto. Cierre la llave de paso y repita el lavado BSA cuatro veces más. Ahora abra las abrazaderas entre la cámara de la celda y los dos cilindros de dos litros para drenar inmediatamente el líquido en la cámara de sedimentación a una velocidad de 40 mililitros por minuto, ajuste el caudal para que tome aproximadamente 20 a 30 minutos cargar el gradiente BSA en la cámara de sedimentación.

Supervise si hay una capa delgada e inalterada de células que se encuentran sobre el gradiente BSA. Una vez que la mayor parte del BSA esté cargado, cierre la llave de paso y gírela a la posición que permita que el líquido drene de la cámara de sedimentación al tubo de fraccionamiento. Ahora apague las placas de agitación y deje que las células se sedimenten durante una hora y 45 minutos.

Una vez completada la sedimentación, conecte el tubo de fracción al colector de fracciones. Ajuste el caudal con la llave de paso para que se recojan 10 mililitros por tubo de recolección cada 45 segundos. Una vez que se recolectan todas las fracciones, analice microscópicamente las fracciones para diferentes poblaciones de células.

Se pueden distinguir diferentes tipos de células en función del tamaño de la célula y la morfología nuclear para determinar la pureza de cada fracción. Transfiera 10 microlitros de células teñidas con DPI a un portaobjetos. Coloque un cubreobjetos y analice con un microscopio de fluorescencia.

Tira de las fracciones que son similares en tamaño y morfología nuclear para crear poblaciones de células. Una preparación típica de aproximadamente 22 testículos. Con este procedimiento de quietud se obtienen aproximadamente de 10 a la octava celda.

Las fracciones de tipo celular metagénico perverso se pueden analizar rápidamente utilizando una combinación de microscopía óptica y fluorescente. Las células móticas, espermatogonias y diploides somáticas son las células más grandes que se encuentran en los testículos y contendrán núcleos grandes que se tiñen de manera relativamente homogénea con dpi. Las espermátidas redondas son células más pequeñas con núcleos redondos más pequeños, generalmente con un centro cromosómico de tinción brillante. Las espermátidas alargadas son células pequeñas que tienen núcleos en forma de hoz.

Una vez que se combinan las fracciones celulares, la pureza se puede determinar aún más mediante el análisis de sangre occidental de los lisados celulares. Los marcadores comunes de las células mióticas son las proteínas Synap Neal Complex one. Los marcadores comunes de la condensación de las espermátidas son las proteínas de transición o la protamina.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en siete horas si se realiza correctamente después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la espermatogénesis exploraran los procesos celulares en diferentes tipos de células de los testículos.