Transección del nervio tibial - Un modelo normalizado para la atrofia del músculo esquelético denervación inducida en ratones

El objetivo general de este video es demostrar el modelo de transección del nervio tibial de la atrofia del músculo esquelético en ratones. Esto se logra aislando el nervio ciático y sus tres ramas, los nervios tibial, silar y peroneo. Una vez aislado, se secciona el nervio tibial.

Después de la denervación, se sella la herida y se vigila de cerca el estado del animal. Finalmente, se obtienen muestras que muestran una disminución progresiva de la masa muscular tras la denervación. El modelo de transección del nervio tibial de la atrofia del músculo esquelético inducida por denervación es un modelo comúnmente empleado en ratas bien validado, y tiene mucha menos morbilidad que la asociada con la transección del nervio ciático.

Hemos adaptado este modelo para su uso en ratones, que demostraremos aquí. Esto permite al investigador aprovechar la existencia de ratones modificados genéticamente y estudiar el proceso de atrofia muscular en ausencia de proteínas que son cruciales para la regulación de la masa muscular esquelética al tiempo que inducen una morbilidad mínima en el animal. Primero, registre el peso del ratón después de confirmar la anestesia adecuada mediante un pellizco en el dedo del pie, identifique la muesca ciática a la palpación y afeite la parte lateral del muslo y el glúteo desde allí hasta la rodilla.

A continuación, limpie el área con aplicaciones repetidas de alcohol y proyodo. Coloque el ratón de lado debajo de un microscopio en funcionamiento o disección mientras usa guantes estériles. Identificar la escotadura ciática por palpación.

Incisión en la piel de la parte lateral del muslo desde la escotadura ciática hasta la rodilla. Extiende suavemente la piel para abrirla. Identifique el músculo bíceps femoral, que es el músculo superficial plano del muslo lateral inmediatamente debajo de la piel con unas tijeras finas.

Divida el músculo bíceps femoral a lo largo de las fibras musculares e inserte un retractor de resorte. Para exponer el nervio ciático y sus ramas, identifique el nervio ciático inmediatamente debajo del músculo bíceps femoral. Se puede identificar por su característico color blanco brillante y tiene aproximadamente 0,8 milímetros de diámetro.

Va desde la escotadura ciática hasta la rodilla, ramificándose en los nervios tibial, peroneo y sal a nivel de la fosa poplítea. Separe suavemente las ramas tibial de los nervios peroneo y sal con pinzas ultrafinas y tijeras de microdisección de resorte. El nervio tibial es la rama más grande y suele ser central.

El manejo suave del nervio ciático y sus ramas es esencial para el éxito de este procedimiento. Tenga cuidado de que las ramas de los nervios sal y perineal no se dañen ni se estiren. En caso de que estas ramas se dañen o se estiren, esto también delatará a sus objetivos.

Sujetar el nervio justo en la capa advential externa con las pinzas ultrafinas y mantener el nervio flojo evitará el aplastamiento del nervio y la lesión por tracción para la denervación temporal Con la reación completa esperada en dos a cuatro semanas, triture el nervio tibial con pinzas ultrafinas durante 15 segundos para una denervación completa y duradera. Corta el nervio tibial con las tijeras de disección micros lo más distalmente posible. Evitar cuidadosamente los vasos poplíteos si se requiere una denervación completa.

Suturar el extremo del nervio tibial seccionado a la superficie anterior del músculo bíceps femoral con nylon 10 T y reaproximar el bíceps femoral con 5 T Vicryl para evitar la reación aberrante de los músculos gastros y sóleo. Una vez completada la denervación, cierre la piel con una sutura Vicryl de cinco pulgadas. Cuando esté listo, apague el anestésico inhalado, pero mantenga el flujo de oxígeno.

Después de administrar un analgésico individualmente, aloje al ratón en una jaula cálida y limpia sin ropa de cama. Mantenga el ratón bajo observación directa hasta que deambule. Cuando esté completamente recuperado, transfiera el ratón a una jaula inferior limpia y sólida con una cama suave y amplia.

Inspeccionar la extremidad operatoria y el pie diariamente para detectar el desarrollo de decúbito Las úlceras en el talón o la evidencia de problemas menores al masticar se pueden tratar con antibióticos tópicos o antisépticos, como el odine. Los indicadores finales que requieren la eutanasia del animal son la pérdida de peso, la evidencia de un autocuidado deficiente y una postura encorvada. Además, los animales con disrupción de heridas o úlceras que no se curan con una o dos semanas de cuidado de la herida también deben ser sacrificados.

Además, cualquier animal que tenga un dolor excesivo En el momento postoperatorio, se recogen los tejidos deseados para su análisis. Después de la eutanasia, afeitar la cara medial de las piernas de control operatorias y contralaterales y limpiar con alcohol trabajando bajo un microscopio de disección, incidir la piel de la pantorrilla medial con un bisturí desde el tobillo hasta la rodilla y circunferencialmente alrededor del tobillo en la extremidad operatoria. A continuación, tire suavemente de la piel del músculo y proximalmente hacia el muslo.

Para exponer todos los músculos de la pierna, identifique el músculo gastro, que es el músculo de la pantorrilla que va desde la rodilla hasta el tobillo en la cara posterior de la pierna. A continuación, localice la inserción distal del músculo bíceps femoral proximal al músculo gastro en la cara medial de la rodilla. En su inserción distal, el bíceps femoral aparece delgado y transparente y se superpone a la porción más proximal de la gastroenteritis mediante tijeras y disección de extremos romos.

Separe suavemente la inserción distal del bíceps femoral del músculo gastro. Agregue su inserción distal en el calcáneo, el músculo gastros se estrecha en el tendón de Aquiles. Identifica el tendón de Aquiles, que aparece blanco y nervudo.

Sujeta el tendón de Aquiles con pinzas. Teniendo cuidado de no sujetar o aplastar el músculo gástrico y dividir el tendón de Aquiles de la inserción del calcáneo. Con las tijeras que aún sujetan el tendón, levante suavemente el músculo gastro rojo pálido del sóleo rojo más profundo desde la inserción distal hacia su origen en la rodilla, utilizando una tracción muy suave.

Para facilitar el proceso, diseccione la gastroenteritis de la pierna dividiendo el origen de la gastroentera de los cóndilos medial y lateral del fémur. Con unas tijeras. Tenga cuidado de no aplastar el músculo.

El sóleo ahora será claramente visible inmediatamente debajo de la vista de los gastros. Levante el sous desde su inserción en el tendón de Aquiles hasta su origen en la pantorrilla posterior. Una vez retirados, pesa los músculos por separado en una báscula de precisión.

A continuación, divida los músculos verticalmente por la mitad para la congelación instantánea y el nitrógeno líquido y la mitad para la histología. Por último, repita estos procedimientos en el lado de control no clasificado para extraer los músculos gastro y sóleo de control. Los músculos gastrointestinales se extrajeron de las extremidades posteriores de control denervadas y contralaterales a la una, dos o cuatro semanas y se expresaron como una proporción.

La denervación induce una pérdida progresiva de masa muscular con el tiempo. El área de la sección transversal de las fibras miométricas se midió después de la inmunotinción, como se ve aquí. Las fibras de contracción rápida tipo dos se tiñen de marrón y las fibras de contracción lenta tipo uno, se tiñen de blanco tipo dos rápidamente.

Las fibras de contracción demostraron una disminución progresiva en el área de la sección transversal en el músculo denervado. Más de cuatro semanas Después de ver este video, debería poder realizar la transección del nervio tibial en ratones. Esto proporciona un modelo reproducible, robusto y bien validado de la atrofia del músculo esquelético inducida por denervación.