Name: Transección del nervio tibial - Un modelo normalizado para la atrofia del músculo esquelético denervación inducida en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-03T19:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Aprende el modelo de transección del nervio tibial para estudiar la atrofia muscular esquelética inducida por denervación en ratones. Este método validado ofrece baja morbilidad y resultados reproducibles para investigar la fisiología muscular y las enfermedades neuromusculares.

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Este trabajo fue apoyado por becas de la Asociación de Investigación Neuromuscular CIHR (JNM - 90959, para Jaeb).

Antes de utilizar este modelo, los investigadores deben haber recibido la aprobación para el protocolo quirúrgico del uso de los animales de su institución órgano de gobierno. El modelo es aprobado por la Junta de Ética de la Investigación, Hamilton Health Sciences Corporation, la Universidad McMaster (AUP # 10/04/24) y se lleva a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones formuladas por el Consejo Canadiense de los Animales. 1. Ratón Preparación <ol><li> Pesar el ratón. Inducir la anestesia con isoflurano al 5% o 2% de halotano. El circuito utilizado debe garantizar compactación adecuada de la anestesia para proteger el cirujano. Después de 2-3 minutos la respiración del animal se ralentizará. Asegúrese de que el reflejo de parpadeo está ausente y pellizcar los espacios interdigitales de la pata para confirmar la anestesia quirúrgica (es decir, no hay respuesta por el ratón). Aplicar lubricante oftálmica al ojo, para evitar el secado de la córnea durante la cirugía. </li><li> Shave la cara lateral del muslo y la nalga del ciáticoapuntarse a la rodilla y desinfectar con proviodine. Afeitar mantendrá el sitio de la incisión libre de pelo para asegurar una adecuada visualización del campo quirúrgico y para minimizar la interferencia con la disección del nervio y la transección. La escotadura ciática, que es superior y posterior en el fémur, se puede identificar mediante la palpación. </li></ol> 2. Procedimiento Operativo <ol><li> Reducir por inhalación isoflurano al 2% (halotano 1%) y colocar el ratón sobre un lado (el lado destinado a la cirugía hacia arriba), con un microscopio operativo o disección. Alternativamente, la cirugía se puede realizar con lupas quirúrgicas desde ampliación 3.5X es satisfactoria para un adulto (20-25 g) del ratón. </li><li> Ponte los guantes estériles. Identificar la escotadura ciática por palpación. El uso de un escalpelo, incisión de la piel de la cara lateral del muslo de la escotadura ciática a la rodilla (aproximadamente 1 cm). </li><li> Suavemente separa la piel. Identificar el músculo bíceps femoral, que es el músculo superficial plana de la cara lateral del musloinmediatamente debajo de la piel. Con unas tijeras finas, dividir el músculo bíceps femoral a lo largo de las fibras musculares y mantenga abierto con un retractor de primavera para exponer el nervio ciático y sus ramas. </li><li> Identificar el nervio ciático inmediatamente la profundidad del músculo bíceps femoral. Puede ser identificado por su color blanco brillante característico y es de aproximadamente 0,8 mm de diámetro. Se extiende desde la escotadura ciática a la rodilla, se ramifican en los nervios tibiales, peroneo y sural a nivel de la fosa poplítea. </li><li> Separar suavemente el tibial de las ramas del nervio peroneo y sural con fórceps ultrafinas y primavera tijeras microdissecting. El nervio tibial es la rama más grande y suele ser central. Es importante no aplastar el nervio mientras que separa las ramas. Sosteniendo el nervio sólo en la capa adventicial exterior con las pinzas ultrafinas, y mantener la holgura del nervio (no enseñados), evitará aplastamiento del nervio y la lesión por tracción. </li><li> Para obtener información completa y duradera denervatien, cortar el nervio tibial con microdissecting tijeras como distalmente como sea posible, evitando cuidadosamente los vasos poplíteos. Alternativamente, para la denervación temporal con reinervación completa esperada en 2-4 semanas, el nervio tibial puede simplemente ser aplastado con fórceps ultrafinas de 15 segundos en lugar de seccionado. (Nervios periféricos vuelven a crecer después de la lesión y se reinervar músculo deseado.) </li><li> Si se requiere la denervación completa, suturar el extremo del nervio tibial cortado transversalmente a la superficie anterior del músculo bíceps femoral con nylon 10-0 y volver a aproximar el bíceps femoral con Vicryl 5-0 para evitar aberrante de re-inervación de los gastrocnemio y músculos sóleo. </li><li> Cierre la piel con una sutura de Vicryl 5-0 correr. </li></ol> 3. Cuidado operativo del poste <ol><li> Apague la anestesia inhalatoria, pero mantener el flujo de oxígeno. Administrar buprinorphine (o sustituto) analgésico por vía subcutánea. </li><li> Transferir el ratón a una jaula limpia sinropa de cama, mientras que despierta de la anestesia. Mantener en una manta de calentamiento dentro de la jaula y bajo observación directa hasta deambular. </li><li> Transferencia y la casa en la jaula inferior suave (no cable) con amplia ropa de cama blanda. </li><li> Inspeccionar la extremidad operativa diaria para la condición de la herida quirúrgica y el pie para el desarrollo de las úlceras por decúbito talón o las pruebas de la masticación. Los problemas menores pueden ser tratados con antibióticos o antisépticos tópicos como proviodine. Indicadores de punto final que requieren la eutanasia de animales son la pérdida de peso, la evidencia de autocuidado deficiente (piel rizada) y postura encorvada. Además, los animales con mayor apertura de la herida o úlceras que no se curan en 1-2 semanas con antibióticos tópicos o parece tener dolor deberán ser sacrificados. </li></ol> 4. Gastrocnemius Denervado y cosecha del músculo sóleo <ol><li> En el punto de tiempo después de la operación deseada, pesar el ratón y el sacrificio con sobredosis de CO 2. </li><li> Shave el aspecto medial de tanto laoperativa y las piernas de control contralateral y limpio con alcohol. Coloque el ratón en un microscopio operativo o disección, o alternativamente usar lupas quirúrgicas para la ampliación de visualización. </li><li> En la extremidad operativa, una incisión en la piel pierna medial con un bisturí desde el tobillo hasta la rodilla y circunferencialmente alrededor del tobillo. Tire suavemente la piel con pinzas fuera del músculo y proximalmente hacia el muslo. Esto expone a todos los músculos de la pierna. Identificar el músculo gastrocnemio, que es el músculo de la pantorrilla que se extiende desde la rodilla hasta el tobillo en la cara posterior de la pierna y se encuentra inmediatamente debajo de la piel. Identificar la inserción distal del músculo bíceps femoral, proximal al músculo gastrocnemio en la cara medial de la rodilla. En su inserción distal del bíceps femoral aparece delgada y transparente y se superpone a la porción más proximal del gastrocnemio. Con unas tijeras y disección extremo romo, separar suavemente la inserción distal del bíceps femoral del gasmúsculo gastrocnemio. </li><li> En su inserción distal en el calcáneo, el músculo gastrocnemio se estrecha en el tendón de Aquiles. Identificar el tendón de Aquiles, que aparece blanco y musculoso. Sostenga el tendón de Aquiles con unas pinzas, teniendo cuidado de no agarrar ni triture los músculos gemelos, y dividir el tendón de Aquiles de la inserción del calcáneo con unas tijeras. </li><li> Sin soltar el tendón, levante suavemente el músculo gemelo (rojo claro) fuera el sóleo profundas (más rojo), a partir de la inserción distal a su origen en la rodilla (el sóleo se pueden cosechar por separado). </li><li> Diseccionar el gastrocnemio de la pierna dividiendo el origen de los gastrocnemio de los chondyles fémur medial y lateral con unas tijeras. Tracción muy suave en el músculo facilita este proceso. Tenga cuidado de no aplastar el músculo. </li><li> Los sóleo ahora serán claramente visibles, inmediatamente debajo del sitio de los gastrocnemio. Levante el sóleo de su inserción en el tendón de Aquiles de su oigin en la pantorrilla posterior. Si el sóleo se eleva inadvertidamente con el gastrocnemio, suavemente separarlo de la muestra cosechada. El gastrocnemio (rojo claro) y sóleo (rojo oscuro) siguen siendo fácilmente identificables en la muestra recolectada, debido a sus diferencias de color. </li><li> Pesar los músculos por separado en una balanza de precisión. </li><li> Dividir los músculos verticalmente, un medio para la congelación en nitrógeno líquido a presión (para su posterior proteínas y / o extracción de ARN), y un medio para la histología (es decir, evaluación morfométrica, inmunohistología) que se fijan ya sea en 10% de formalina, o la fijación congelados en isopentano enfriado con nitrógeno líquido , si lo deseas. </li><li> Repita desde el paso 4.3 en el control, no operado, de lado a cosechar gemelo de control y los músculos sóleo. </li></ol>

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</ol>

No hay conflictos de interés se declaran.

El modelo de transección del nervio tibial de la atrofia del músculo esquelético denervación inducida es un modelo comúnmente empleado y bien validado en ratas. Hemos adaptado este modelo para su uso en los ratones, lo que permite al investigador para tomar ventaja de la existencia de ratones modificados genéticamente y estudiar el proceso de la atrofia muscular in vivo en ausencia de proteínas cruciales para la regulación de la masa muscular 7,8. Los músculos gemelos y sóleo, tanto desnervar en este...

Denervación del músculo esquelético, debido a una lesión traumática de nervios periféricos, la enfermedad o la intervención farmacológica, resulta en la pérdida inmediata de la función contráctil muscular voluntario. Muscle concomitantemente comienza a atrofiarse y esta atrofia es reversible si reinervación oportuna y de buena calidad produce 1,2. En la ausencia de reinervación, atrofia miofibrilar progresa, y cambios biológicos irreversibles en el músculo se produce con la fibrosis muscular y muerte miofibras. Aquí se demuestra el modelo de transección del nervio tibial, un modelo de la denervación inducida por la atrofia muscular y la fibrosis en los ratones. Este modelo permite a los científicos estudiar los mecanismos biológicos fisiológicos, celulares y moleculares que subyacen a la atrofia muscular in vivo en los músculos gastrocnemio y sóleo. Aunque se han utilizado históricamente predominante en ratas, más reciente aplicación de este modelo a nocaut y las líneas de ratones transgénicos en concreto, permite a los investigadores para evaluar el papel de la, las proteínas (s) de interés en la inducción, el desarrollo y el mantenimiento, o, alternativamente, la resolución de, la atrofia muscular y la fibrosis in vivo. El nervio tibial es un nervio periférico del motor-sensorial mixta en la extremidad posterior de roedores, y es una de las tres ramas terminales del nervio ciático. Transección del nervio tibial desnerva el gastrocnemio, sóleo y plantar (músculos y los tres músculos flexores profundos y pequeños de los pies, incluyendo tibial posterior, flexor largo de los dedos y flexor largo del dedo gordo hallicus), y es un modelo bien estandarizado y validado en ratas 3,4 . Los músculos gastrocnemio y sóleo pueden ser fácilmente diseccionados en puntos de tiempo de serie Publicación de transección del nervio tibial, fijaron y procesaron para la evaluación de la histología muscular y morfometría de la fibra muscular, o el flash congelado para la extracción de ARN y de proteínas musculares para el propósito de estudiar, por ejemplo, las redes de señalización celular que regulan la atrofia muscular. El gamuscular strocnemius es un tipo de fibra muscular mixta (de tipo I y de tipo II, aunque predominantemente de tipo II) y el músculo sóleo se compone de una gran proporción de fibras de tipo I, proporcionando de este modo contracción muscular a la vez rápido y lento para la evaluación de 5,6. El modelo de transección del nervio tibial es adecuado para estudiar el proceso de denervación inducida por la atrofia muscular, tanto a corto plazo (días) 7 y largo plazo (semanas a meses) 4,8. En contraste con el modelo de transección del nervio ciático (un segundo modelo de la denervación inducida por la atrofia muscular comúnmente utilizado en roedores), la transección del nervio tibial induce una menor morbilidad en el animal, por lo que es un modelo más atractivo. Transección del nervio ciático desnerva todos los músculos de la pierna (debajo de la rodilla) y el pie, mermando la capacidad del animal para caminar 2, mientras que la transección del nervio tibial deja las ramas del nervio peroneo y sural del nervio ciático intacto, conservando asísus músculos en cuestión y territorios sensoriales. El ratón es incapaz de flexión plantar o invertir el pie, pero es capaz de deambular fácilmente y el peso lleva igualmente en ambas extremidades traseras, disminuyendo así significativamente la morbilidad del modelo. Estudios de análisis de la marcha que evalúan los patrones de caminar se han realizado en ratas después de lesiones del nervio tibial y ciático y demostrar que la huella y la carga de peso se conserva mejor con una lesión tibial 9,10. Además, en el modelo de transección del nervio tibial, el nervio peroneo puede ser movilizado en un punto de tiempo más tarde y se transfiere como una fuente de reinervación retardada, si el diseño del estudio requiere 3. En contraste, la reinervación retardada en el modelo de transección del nervio ciático hace necesario el uso de un injerto de nervio al déficit nervio ciático, muy significativamente el aumento de la dificultad técnica del modelo y la limitación de su uso para cirujanos expertos. Mientras que el modelo de transección del nervio tibial requires familiaridad del operador con la técnica quirúrgica estéril en cirugía animal, tanto el nervio tibial y los músculos de la pantorrilla que inerva son fácilmente accesibles e identificables para la manipulación, de manera que las personas que no son cirujanos, o una amplia experiencia con la cirugía animal, pueden dominar fácilmente este modelo .

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reactivos y Materiales</td></tr><tr><td>10-0 Sutura de nylon</td><td>Ethicon</td><td>2850G</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Sutura de Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J553G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Spring tijeras de microdisección</td><td>Herramientas quirúrgicas finas</td><td>15021-15</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas ultrafinas</td><td>Cirugía fina Herramientas</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Micro portaagujas sin bloqueo (atornillador)</td><td>Herramientas quirúrgicas finas</td><td>12076-12</td><td></td></tr><tr><td>Retractor de resorte</td><td>Herramientas quirúrgicas finas</td><td>17000-02</td><td></td></tr></tbody></table>

transección del nervio tibial - un modelo normalizado para la atrofia del músculo esquelético denervación inducida en ratones

Tibial Nerve Transection - A Standardized Model for Denervation-induced Skeletal Muscle Atrophy in Mice

El modelo de transección del nervio tibial es un bien tolerado, validado, y reproducible modelo de atrofia del músculo esquelético inducida por desnervación en roedores. Aunque originalmente desarrollado y utilizado ampliamente en la rata, debido a su tamaño más grande, el nervio tibial en ratones es lo suficientemente grande que pueda ser manipulado fácilmente, ya sea con aplastamiento o transección, dejando las ramas del nervio peroneal y sural del nervio ciático intacta y preservando así sus músculos en cuestión. Por lo tanto, este modelo ofrece las ventajas de la inducción de una menor morbilidad y impedimento de la deambulación que el modelo de transección del nervio ciático y también permite a los investigadores estudiar los mecanismos biológicos fisiológicos, celulares y moleculares que regulan el proceso de la atrofia muscular en ratones diseñados genéticamente. El nervio tibial suministra el gastrocnemio, sóleo y plantar los músculos, por lo que su corte transversal permite el estudio de los músculos esqueléticos desnervado compuesto por fibras de contracción rápida de tipo II y / o de tipo I de contracción lentafibras. Aquí se demuestra el modelo de transección del nervio tibial en el C57Black6 ratón. Evaluamos la atrofia del músculo gastrocnemio, como representante de un músculo, en 1, 2, y 4 semanas después de la denervación mediante la medición de los pesos musculares y del tipo de área de la sección transversal de la fibra específica en parafina secciones histológicas immunostained para la miosina rápida contracción.

<html> Transección del nervio tibial desnerva el gastrocnemio, sóleo y plantar los músculos de la pantorrilla. Aquí se evalúa el desarrollo de la atrofia en los músculos gemelos, como un músculo representativo. Músculo gastrocnemio fue cosechada de 2-3 meses de edad C57Black 6 ratones (Jackson Laboratories) denervado para 1, 2, o 4 semanas. Pesos musculares disminuyen progresivamente (Figura 1), al igual que el área de sección transversal de las fibras de tipo II musculares de contracción rápida ...

El modelo de transección del nervio tibial es un bien tolerado, validado, y reproducible modelo de atrofia del músculo esquelético. El modelo de protocolo quirúrgico se describe y se demuestra en C57Black6 ratones.

Transección del nervio tibial - Un modelo normalizado para la atrofia del músculo esquelético denervación inducida en ratones

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. ...

El objetivo general de este video es demostrar el modelo de transección del nervio tibial para el estudio de la atrofia muscular esquelética en ratones. Esto se logra aislando el nervio ciático y sus tres ramas: los nervios tibial, safeno y peroneo. Una vez aislado, se realiza la transección del nervio tibial.Después de la denervación, la herida se sella y se monitorea cuidadosamente la condición del animal. Finalmente, se obtienen muestras que muestran una disminución progresiva de la masa muscular tras la denervación. El modelo de transección del nervio tibial para inducir atrofia muscular esquelética es un modelo comúnmente utilizado y bien validado en ratas, y presenta una morbilidad mucho menor que la asociada con la transección del nervio ciático.Hemos adaptado este modelo para su uso en ratones, lo cual demostraremos aquí. Esto permite al investigador aprovechar la existencia de ratones genéticamente modificados y estudiar el proceso de atrofia muscular en ausencia de proteínas cruciales para la regulación de la masa muscular esquelética, induciendo al mismo tiempo una morbilidad mínima en el animal. Primero, registre el peso del ratón tras confirmar una anestesia adecuada mediante el pellizco del dedo del pie, identifique la escotadura ciática por palpación y afeite el muslo lateral y la nalga desde ese punto hasta la rodilla.A continuación, limpie el área con aplicaciones repetidas de alcohol y povidona yodada. Coloque el ratón de lado bajo un microscopio quirúrgico o de disección mientras usa guantes estériles. Identifique la escotadura ciática mediante palpación.Haga una incisión en la piel del muslo lateral desde la escotadura ciática hasta la rodilla. Separe suavemente la piel abierta. Identifique el músculo bíceps femoral, que es el músculo plano y superficial del muslo lateral inmediatamente debajo de la piel, utilizando tijeras finas.Divida el músculo bíceps femoral a lo largo de las fibras musculares e inserte un retractor de resorte. Para exponer el nervio ciático y sus ramas, identifique el nervio ciático inmediatamente debajo del músculo bíceps femoral. Puede reconocerse por su característico color blanco brillante y tiene aproximadamente 0,8 milímetros de diámetro.Recorre desde la escotadura ciática hasta la rodilla, ramificándose en los nervios tibial, peroneo y safeno a nivel de la fosa poplítea. Separe suavemente el nervio tibial de las ramas nerviosas peronea y safena con pinzas ultrafinas y tijeras microdisectoras de resorte. El nervio tibial es la rama más grande y generalmente se encuentra en posición central.El manejo cuidadoso del nervio ciático y sus ramas es esencial para el éxito de este procedimiento. Tenga cuidado de que las ramas nerviosas del nervio pudendo (nervio dorsal del pene en machos o nervio clitoriano en hembras) y del nervio perineal no sufran daños ni estiramientos. Si estas ramas se dañan o se estiran, se producirá la desinervación de sus tejidos diana también.Sujetar el nervio únicamente por la capa adventicia externa con la pinza ultrafina y mantener el nervio flojo evitará la compresión y lesión por tracción para una desinervación temporal. Con una reinervación completa esperada en dos a cuatro semanas, comprimir el nervio tibial con la pinza ultrafina durante 15 segundos para lograr una desinervación completa y permanente. Cortar el nervio tibial con las tijeras microquirúrgicas de disección lo más distalmente posible. Evitar cuidadosamente los vasos poplíteos si se requiere desinervación completa.Suture el extremo del nervio tibial seccionado a la superficie anterior del músculo bíceps femoral con nylon 10 T y vuelva a aproximar el bíceps femoral con Vicryl 5 T para prevenir la reinervación aberrante de los músculos gastrocnemio y sóleo. Una vez completada la desinervación, cierre la piel con un punto continuo de Vicryl 5-0. Cuando esté listo, apague el anestésico inhalado, pero mantenga el flujo de oxígeno.Después de administrar un analgésico individualmente, coloque al ratón en una jaula limpia y cálida sin viruta. Mantenga al ratón bajo observación directa hasta que pueda desplazarse. Una vez que se recupere completamente, transfiera al ratón a una jaula limpia con fondo sólido y abundante viruta suave.Inspeccione diariamente la extremidad intervenida y el pie en busca del desarrollo de úlceras por presión en el talón o evidencia de problemas menores por mordisqueo, que pueden manejarse con antibióticos o antisépticos tópicos, como odine. Los indicadores de punto final que requieren la eutanasia del animal son la pérdida de peso, evidencia de mal cuidado personal y postura encorvada. Además, los animales con dehiscencia de la herida o úlceras que no cicatrizan tras una a dos semanas de cuidados de la herida también deben ser sacrificados.Además, cualquier animal que presente dolor excesivo en el período postoperatorio debe ser sacrificado y se recogen los tejidos deseados para su análisis. Después de la eutanasia, afeite la cara medial de ambas patas, la operada y la control contralateral, y limpie con alcohol. Trabajando bajo un microscopio estereoscópico, realice una incisión en la piel de la pantorrilla medial con un bisturí, desde el tobillo hasta la rodilla, y circunferencialmente alrededor del tobillo en la extremidad operada. A continuación, retire suavemente la piel del músculo y tire hacia proximal, en dirección al muslo.Para exponer todos los músculos de la pierna, identifique el músculo gastrocnemio, que es el músculo de la pantorrilla que se extiende desde la rodilla hasta el tobillo en la cara posterior de la pierna. A continuación, localice la inserción distal del músculo bíceps femoral, proximal al músculo gastrocnemio en la cara medial de la rodilla. En su inserción distal, el bíceps femoral parece delgado y transparente y recubre la porción más proximal del gastrocnemio; utilice tijeras y disección con extremo romo.Separar suavemente la inserción distal del bíceps femoral del músculo gastrocnemio. Agregar su inserción distal en el calcáneo, donde el músculo gastrocnemio se estrecha para formar el tendón de Aquiles. Identificar el tendón de Aquiles, que aparece blanco y fibroso.Sujete el tendón de Aquiles con pinzas. Tenga cuidado de no sujetar ni aplastar el músculo gástrico y seccione el tendón de Aquiles desde su inserción en el calcáneo. Con las tijeras, sosteniendo aún el tendón, levante suavemente el músculo gastrocnemio de color rojo pálido desde la inserción distal hacia su origen en la rodilla, separándolo del sóleo de color rojo más intenso, ejerciendo una tracción muy suave.Para facilitar el proceso, seccione el gastrocnemio de la pata dividiendo el origen del gastrocnemio de los cóndilos femorales medial y lateral. Utilice tijeras. Tenga cuidado de no aplastar el músculo.El sóleo será ahora claramente visible inmediatamente debajo de la vista del gastrocnemio. Levante el sóleo desde su inserción en el tendón de Aquiles hasta su origen en la cara posterior de la pantorrilla. Una vez extraído, pese los músculos por separado en una balanza de precisión.A continuación, divida los músculos verticalmente: la mitad para congelación rápida en nitrógeno líquido y la otra mitad para histología. Por último, repita estos procedimientos en el lado control no evaluado para obtener los músculos gastrocnemio y sóleo de control. Los músculos gastrocnemios se obtuvieron de las extremidades traseras deservadas y de control contralaterales a la una, dos o cuatro semanas y se expresaron como una razón.La denervación indujo una pérdida progresiva de la masa muscular con el tiempo. El área transversal de las fibras miológicas se midió tras la inmunotinción, como se observa aquí. Las fibras de contracción rápida tipo dos se tiñen de marrón y las fibras de contracción lenta tipo uno, de blanco; el tipo dos rápido.Las fibras de contracción rápida mostraron una disminución progresiva en el área de la sección transversal en el músculo desinnervado. Después de ver este video, deberías ser capaz de realizar la sección del nervio tibial en ratones. Este modelo proporciona un modelo reproducible, robusto y bien validado de atrofia muscular esquelética inducida por desinnervación.

tibial-nerve-transection-standardized-model-for-denervation-induced

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

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