Name: La inducción farmacológica de la melanina epidérmica y Protección contra las quemaduras solares en un modelo de ratón humanizado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: Aprende a inducir melanina epidérmica con forskolina en ratones para protección contra daño UV. Este método farmacológico demuestra aumento de pigmentación y resistencia a quemaduras solares mediante ensayo MED.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores desean agradecer a Malinda Spry para la asistencia técnica. También reconocemos las fuentes de financiación actuales y pasados: el Instituto Nacional del Cáncer (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), el Fondo de Investigación Wendy Will Caso del Cáncer, la Fundación de Cáncer de Markey, Red del Milagro de los Niños y la Jennifer y David Melanoma Research Foundation Dickens.

1. Preparación de forskolina para la administración tópica de un extracto de la raíz cruda de la planta Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii) <ol><li> Los protocolos para experimentos murinos siguen las pautas de conducta ética en el cuidado y uso de animales y fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales institucional y Uso de la Universidad de Kentucky (Protocolo # 00768M2004). El extracto de raíz se compone en peso 40% / volumen en una base dermatológica estándar de etanol al 70%, 30% de glicol de propileno. </li><li> Pesar 200 g de extracto de raíz de forskolina crudo y transferirla a un vaso de precipitados. Para hacer 500 ml de un 40% (w / v) de solución, volver a suspender 200 g de extracto de raíz de forskolina crudo mediante la adición de la mayoría, pero no todo el volumen del vehículo (etanol 70%, 30% de glicol de propileno) y llevar la solución a aproximadamente 450 ml. </li><li> Se agita durante una hora a temperatura ambiente. La solución será algo viscoso y puede requerir agitación manual para &quot;levantar&quot; el extracto en solución antes dela barra de agitación es capaz de tomar el relevo. </li><li> Después de una hora de agitación, se vierte la mezcla en un cilindro graduado y llevar el volumen a 500 ml utilizando vehículo que ha sido utilizado para &quot;enjuagar&quot; el vaso de precipitados que se usó para agitar la suspensión (para maximizar la recuperación de forskolina del vaso de precipitados) . </li><li> Transferir la suspensión a 50 ml de tubos de centrífuga de polipropileno. Se centrifuga (1.500 xg, la temperatura ambiente, 15 min), utilizando una centrífuga de mesa. En este punto, el material insoluble será bastante compactado, permitiendo que el sobrenadante sea fácilmente por vertido. </li><li> Filtrar la solución a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,22 micras para eliminar cualquier material insoluble residual a partir del extracto. Nosotros utilizamos un sistema de botella de la parte superior diseñada para el cultivo celular, junto con el uso de pre-filtros que vienen con la unidad para evitar la obstrucción prematura de la membrana a partir de componentes insolubles del extracto de la raíz. Al hacer grandes volúmenes de extracto, aproximadamente 100 ml de filtrado a la vez, el cambio de la apuesta pre-filtroween cada volumen añadido. </li><li> Cuando se almacena a temperatura ambiente, el extracto mantiene la actividad biológica hasta para un máximo de un año. </li></ol> 2. Preparación de C57Bl / 6 K14-Scf Ratones para Tratamientos tópicos <ol><li> Retire la piel dorsal de los animales por cizallamiento eléctrica. Brevemente anestesiar a los animales con isoflurano inhalado para facilitar la esquila de la piel dorsal con cizallas eléctricas equipadas con un cabezal de preparación quirúrgica de 0,25 mm (Fisher Scientific). Preferentemente utilice sólo un tipo de anestesia (por ejemplo, la ketamina / xilazina) para minimizar el riesgo de una sobredosis de anestesia. La cámara de inhalación saturada lleva riesgos laborales cuando se utiliza fuera una campana de extracción y entrega cantidades desconocidas de anestesia a los animales. Lo ideal sería que un vaporizador de precisión se debe utilizar. </li><li> Para quitar el rastrojo de pelo residual, tratar a los animales con un depilatorio químico. Administrar anestesia al animal con una inyección ip de ketamina 40 mg / kg de xilazina y 4 mg / kg </li&gt; <li> Una vez que los animales son anestesiados adecuadamente (a juzgar por la pizca dedo del pie), aplique una cantidad del tamaño de la yema del dedo de la crema depilatoria a la piel dorsal cortado usando un dedo enguantado. Frote la crema sobre la piel durante 30 a 60 segundos o hasta que los pelos se pueden ver claramente en la crema, ya que se mueve alrededor. Deje la crema en sólo por la cantidad mínima de tiempo que se requiere para la depilación como la exposición prolongada conduce a quemaduras químicas en la piel, la ruptura de la epidermis y la muerte por la pérdida de la integridad de la epidermis. </li><li> Limpie la piel dorsal con gasas empapadas de agua varias veces hasta que toda la crema se ha eliminado. Animales secos utilizando toallas de papel suave, y permitir que se recuperen en un lugar aislado en caliente (por ejemplo, jaulas limpias colocan en una almohadilla de calentamiento). Depilar los animales de uno en uno y vigilar de cerca durante todo el procedimiento. </li></ol> 3. La administración tópica de forskolina o de control del vehículo <ol><li> Los animales deben ser tratados uno a la vez. Brevemente anestesiar con inhalard isoflurano colocando el ratón encima de un nylon filtro permeable al aire en formularios provistos bajo el cual se ha colocado una toalla de papel isoflurano-saturada en un frasco de vidrio con tapa transparente isoflurano-saturada en una campana de humos. Exponer el ratón para isoflurano durante un tiempo suficiente como para suprimir los movimientos musculares voluntarios pero para preservar la respiración espontánea (típicamente 10-20 seg). Saliendo del animal en el isoflurano demasiado tiempo dará lugar a la supresión respiratoria y muerte. Es mejor errar en el lado de &quot;ir la luz&quot; y tener que volver a exponer el ratón brevemente para más isoflurano en lugar de a la sobre-exponer al animal a la muerte de drogas y el riesgo. </li><li> Retire el animal de la cámara de isoflurano y colocar en un bloc banco absorbente limpio. </li><li> Utilizando una micropipeta 1000 l equipado con una punta desechable de polipropileno, elaborar 400 l de extracto crudo forskolina 40% (animales de control de vehículos recibirán etanol al 70%, el 30% de propilenglicol solo). </li><li> Transferir el extracto sobre lalomo del animal por goteo que sobre la piel y, a continuación, usando el lado de la punta de pipeta, manchar el extracto sobre la piel dorsal hasta que toda la piel ha sido cubierto. No hay necesidad de secar la piel después de la aplicación. </li><li> Devuelva el ratón a su jaula, y observar con cuidado hasta que se recupere de la anestesia. </li><li> Con el fin de que los efectos de cAMP no pigmentos no deben confundir a experimentos de sensibilidad UV, deje todos los tratamientos tópicos 2 días antes de la exposición UV (pigmento de efecto dura varios días más allá del último tratamiento tópico). </li></ol> 4. Piel de medición del color por Reflective Colorimetría <ol><li> Brevemente anestesiar al ratón con isoflurano inhalado (véase más arriba). </li><li> Calibrar un colorímetro Minolta colocando la cabeza portátil en la superficie blanca estandarizada proporcionada con el colorímetro. </li><li> Coloque el cabezal de medición portátil de la descarga colorímetro con la piel dorsal del animal asegurando que la apertur ronda 1 cm2e está completamente presionado sobre la piel. Tome al menos tres mediciones separadas en diferentes áreas de la piel dorsal. </li><li> Calcula media L * Partitura ± SD por animal y por grupo de tratamiento. Colorimetría reflectante se puede hacer en cualquier punto en el experimento. </li></ol> 5. Determinación de la sensibilidad UV mediante el cálculo de &quot;Mínimo eritematosa Dose&quot; (MED) <ol><li> Utilice los animales que han sido pre-tratadas con vehículo o forskolina como se describió anteriormente. Anestesie animales con inyección intraperitoneal de una mezcla estándar de ketamina y xilazina (véase más arriba). </li><li> Prepare un trozo de cinta-UV oclusiva para las pruebas de MED. Para generar agujeros en la cinta, utilice una perforadora de alta resistencia con un recorte circular de 1 cm 2 (Figuras 2A y B). Tener orificios de un tamaño definido y la disposición simétrica de la cinta facilita el reconocimiento de los cambios en la piel después de la irradiación. Sobre cada agujero en la cinta, aplique una pequeña pero fácilmente desmontable pieza<html> de cinta que se puede quitar en momentos definidos durante la exposición UV para permitir la administración de diferentes dosis de UV. </li><li> Una vez que el animal está sedado adecuadamente, coloque la cinta en la superficie dorsal. Lubricante de ojos siempre se debe utilizar bajo anestesia. </li><li> Encienda la fuente de UV consiste en dos Westinghouse F15T8UV-B lámparas con una potencia máxima de 313 nm y un rango de 280-370 nm. Deje que la lámpara se equilibre a una salida de UV constante, medida por un fotómetro UV con un sensor de UVB (generalmente toma unos pocos minutos para las lámparas para calentar). </li><li> Sobre la base de la tasa de transmisión de luz UV tal como se mide por el fotómetro UV, calcular el tiempo de exposición UV para cada dosis deseada. Por ejemplo, las medidas de producción de UVB de nuestra lámpara de 2,4 mW / cm 2. Por lo tanto, para administrar 5 kJ / m 2, tendría que ser expuesto a 208 seg (que es 3 min y 28 seg) de la radiación UVB, tal como se calcula por debajo de la piel: upload/50670/50670eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li> Coloca los animales sedados (cada uno con cinta oclusiva en su lugar) ventral superficie hacia abajo para asegurar una visibilidad aún UV. Para administrar las dosis escogidas de la radiación UV, eliminar secuencialmente las pequeñas cintas oclusivos que cubren los agujeros para exponer 1 cm 2 zonas de la piel a las dosis correctas de la radiación. Por lo tanto, usando el ejemplo anterior, si 40 kJ / m 2 es la dosis más grande en el experimento, entonces el animal estaría bajo la lámpara durante 27 min y 47 seg total y la piel en la condición de 40 kJ / m 2 no tendría ningún cinta que recubre todo el tiempo. Sin embargo, la cinta que recubre la condición 5 kJ / m 2 sería eliminado cuando hay 208 seg restante en la exposición. Momento de la eliminación de la cinta se debe hacer de manera que cada condición termina simultáneamente. </li><li> Después de la exposición UV, despegue la cinta adhesiva de la piel dorsal con cuidado, con cuidado de no rasgar la piel con movimientos bruscos o excesivamente contundentes. Coloque los animales en un lugar cálido tranquilo para permitirrecuperación de la anestesia. </li><li> Monitorear ratones durante 24-48 h para buscar áreas discretas de eritema (enrojecimiento) o edema (hinchazón) que corresponde a los sitios anatómicos expuestos a la dosis específica de radiación UV. Documentar los hallazgos cutáneos fotográficamente. </li><li> Valor MED corresponde a la dosis mínima de rayos UV que causa la inflamación tal como se define por eritema y / o edema de todo el círculo de la piel expuesta. Tenga en cuenta que la pigmentación de la piel puede impugnar la determinación del MED, sin embargo, eritema y edema todavía pueden generalmente ser evaluados con precisión, gracias en parte a la forma definida de las aberturas en la cinta durante la exposición UV. </li></ol> 6. Análisis estadístico Analizar los datos entre las cohortes de ratones mediante ANOVA de una vía con post test de Bonferroni (Graph Pad PRISM). Valores de p &lt;0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Usando un modelo animal de la humana de piel clara, nos encontramos con que la aplicación tópica de un extracto de la raíz cruda forskolina ricos oscurece robustamente la epidermis estimulando la producción de melanina en la piel. Melanización epidérmico es dependiente de la expresión de factor de células madre en la epidermis basal, como ocurre en la piel humana pero no en la piel sin modificar genéticamente-ratón. La piel dorsal de los ratones genéticamente-no modificada carece de un número suficiente de melanocitos i...

La incidencia de melanoma, la forma más mortal de cáncer de piel, se ha incrementado dramáticamente en las últimas décadas en Estados Unidos, sobre todo entre las personas de piel clara. Evidencia molecular y epidemiológico fuerte implica la radiación UV como un importante factor ambiental causante 2-5. Aumento de la exposición UV en forma de exposición al sol y el uso de camas de bronceado es probable que sea responsable de gran parte de los aumentos en la incidencia de melanoma 6-7. Riesgo del melanoma parece especialmente vinculado con las quemaduras de sol 8, sobre todo los primeros años de vida 9-10. Riesgo de quemaduras de sol no sólo está ligada a la dosis y la intensidad de los rayos UV, sino también por factores hereditarios que influyen en la respuesta cutánea a la radiación UV. Pigmentación de la piel es uno de los determinantes más importantes de la sensibilidad UV, el riesgo de quemaduras solares y el riesgo de cáncer. El melanoma se presenta aproximadamente veinte veces más frecuente en personas de piel clara en comparación con la individualización de piel oscurals 11-13. La melanina, un pigmento producido por los melanocitos en la epidermis, es el principal determinante de la tez de la piel. La melanina se presenta en dos variedades principales: (1) eumelanina, un pigmento de color marrón oscuro / negro eficaz en la absorción de la energía de la radiación UV, y (2) feomelanina, un color rojizo / pigmento rubia menos eficaz en la prevención de la penetración de los fotones UV en la piel. Color de la piel, sensibilidad UV y el riesgo de melanoma están determinados en gran medida por el contenido de eumelanina epidérmica 14-15. El más eumelanina en la epidermis, los menos fotones UV puede penetrar en la piel. Debido a los bajos niveles de la eumelanina innatas, las personas de piel clara son mucho más propensos a los efectos agudos y crónicos de la radiación UV 16-18. Pigmentación de la piel, el riesgo de melanoma y la capacidad de &quot;tan&quot; después de la exposición UV todo se correlacionan con la capacidad de señalización de la melanocortina 1 del receptor (Mc1r), un G s acoplado y siete transmembrana sreceptor urface en melanocitos 19-22. Cuando Mc1r se une a su ligando cognado de alta afinidad, la hormona estimulante de melanocitos α-(α-MSH), hay una activación de la adenilato ciclasa y la producción del segundo mensajero AMPc 23. La respuesta fisiológica normal de la piel después de la exposición UV incluye la producción epidérmica de α-MSH por los queratinocitos 24-29. Nosotros y otros la hipótesis de que los queratinocitos derivados de α-MSH se une a Mc1r en melanocitos epidérmicos, iniciando la producción aguas abajo del segundo mensajero AMPc a través de la activación de la adenilato ciclasa 30. niveles de cAMP controlan muchos aspectos de la diferenciación de los melanocitos, incluidas las vías de supervivencia, la reparación del ADN y la síntesis del pigmento. De señalización Mc1r y AMPc inducen claramente los niveles de enzimas y la producción de pigmento eumelanina. Cuando la señalización Mc1r está intacto y los niveles de cAMP melanocíticos son robustos, la eumelanina se produce y la piel se oscurece. Sin embargo, si la señalización Mc1r es defectuoso yniveles de cAMP citoplasmáticos siguen siendo bajos, la feomelanina se produce en lugar de 1. Síntesis de eumelanina se puede estimular farmacológicamente por los agentes que elevan los niveles de cAMP 1,14,31-35. Dado que la proteína Mc1r es un importante regulador de riesgo de melanoma en humanos 36-46, estamos interesados ​​en los mecanismos por los cuales Mc1r protege melanocitos contra la carcinogénesis inducida por UV. Como base para nuestros estudios, hemos generado un modelo murino Mc1r variante transgénica en una pura C57BL / 6 antecedentes genéticos 1. En este modelo, factor de células madre (SCF) se expresa constitutivamente en la epidermis basal y epidérmicas melanocitos interfollicular se retienen en la piel durante toda la vida 47, en contraste con los ratones no transgénicos en los que los melanocitos se localizan en la dermis en los folículos pilosos. Con el transgén K14-Scf incorporada, la epidermis se vuelve pigmenta con la característica de pigmentos de melanina en particular del pigmentocepa del animal 1. ratones K14-Scf en el fondo genético C57BL / 6 con el tipo salvaje señalización Mc1r tiene la piel de color negro azabache que se caracteriza por niveles muy altos de pigmento eumelanina. No es sorprendente que estos animales son altamente resistente a rayos UV. En contraste, genéticamente compatibles K14-Scf C57BL / 6 animales que albergan un mutante inactivo Mc1r casi no tienen eumelanina en la epidermis. En cambio, estos animales &quot;extensión&quot; (Mc1r e / e) tienen una tez de piel blanca causada por el depósito de pigmento feomelanina (Figura 1A) y son mucho más sensibles a la radiación UV-48-49. Compuestos farmacológicos con propiedades químicas que permiten la penetración en la piel han demostrado inducir potentemente eumelanina en la extensión (Mc1r E / E) modelo animal K14 SCF por la manipulación directa de los niveles de cAMP en los melanocitos epidérmicos en la piel. La regulación positiva de melanina en este modelo ha sido reported por la activación de la adenilato ciclasa 1, así como la inhibición de la fosfodiesterasa 4 35. En este artículo, se demuestra la preparación y aplicación tópica de forskolina en extensión (Mc1r e / e) animales K14-Scf qué modelo de lo humano-UV sensible de piel clara. Se demuestra que la aplicación dos veces al día del medicamento promueve melanización acelerado, este oscurecimiento de la piel es debido a la deposición epidérmica de pigmento de melanina y que la melanina epidérmica inducida protege contra las quemaduras solares inducidas por UV a través de la medición de la &quot;dosis mínima eritematosa&quot; (MED) 48.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Coleus Forskoli extract 20%</td><td>Buckton Scott USA Inc.</td><td>n/a</td><td>Princeton, NJ</td></tr><tr><td>Isothesia, Isoflurano , USP</td><td>Butler Schein</td><td>NCD 11695-6776-1</td><td>Dublin, OH, EE. UU</td></tr>. Inyección de <tr><td>xilacina</td><td>anasada</td><td>LA04612</td><td>Shenandoah, Iowa, EE. UU</td></tr>. <tr><td>Ketamina HCl, USP</td><td>Putney</td><td>NDC 26637-411-01</td><td>St. Joseph, MO, EE. UU</td></tr><tr>.<td>Etanol</td><td>Decon Labs.</td><td>2705</td><td></td></tr><tr><td>Propilenglicol</td><td>Adesco</td><td>05751L</td><td>Solon, OH, USA</td></tr><tr><td>Crema depilatoria, Nair</td><td>Church Dwight</td><td>JF-11 4381322</td><td>Priceton, NJ</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Germicida Hg Lamp UV-B</td><td>Westinghouse</td><td>F15T8UV-B</td><td></td></tr><tr><td>Fotómetro radiómetro</td><td>International light</td><td>1LT400A</td><td>Peabody, MA,USA</td></tr><tr><td>Chromameter</td><td>Konica Minolta</td><td>CR-400</td><td>Ramsey, NJ, USA</td></tr><tr><td>Procesador de datos para Chromameter CR-400</td><td>Konica Monilta</td><td>DR-400</td><td>Ramsey, NJ, USA</td></tr></tbody></table>

la inducción farmacológica de la melanina epidérmica y protección contra las quemaduras solares en un modelo de ratón humanizado

Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

La equidad de la piel, sensibilidad UV y riesgo de cáncer de piel en todo correlaciona con la función fisiológica del receptor de melanocortina 1, una proteína de señalización T s acoplado encuentra en la superficie de los melanocitos. Mc1r estimula la adenilciclasa y la producción de cAMP que, a su vez, hasta regula la producción melanocíticos de melanina en la piel. Con el fin de estudiar los mecanismos por los que la señalización Mc1r protege la piel frente a la lesión UV, este estudio se basa en un modelo de ratón con &quot;piel humanizado&quot;, basada en la expresión epidérmica de factor de células madre (SCF). Ratones transgénicos K14-Scf conservan melanocitos en la epidermis y por lo tanto tienen la capacidad de depositar la melanina en la epidermis. En este modelo animal, de tipo salvaje resultados del estado Mc1r en la deposición sólida de pigmento eumelanina negro y un fenotipo con protección UV. En cambio, los animales K14-SCF defectuosa señalización Mc1r capacidad presentan una pigmentación rojo / rubio, muy poca eumelanina en la piel yun fenotipo sensible a UV. Razonando que la deposición de eumelanina que se podría mejorar por agentes tópicos que imitan la señalización Mc1r, encontramos que la aplicación directa de extracto de forscolina para la piel de ratones de piel clara Mc1r defectuosa como resultado robusto inducción eumelanina y la protección UV 1. A continuación se describe el método para la preparación y la aplicación de un extracto de la raíz natural que contiene forskolina a K14-Scf ratones de piel clara, y presentarán un método para medir la sensibilidad UV mediante la determinación de la dosis eritematosa mínima (MED). El uso de este modelo animal, es posible estudiar la forma en la inducción de AMPc epidérmica y melanización de la piel afectan a las respuestas fisiológicas a la exposición UV.

C57BL / 6 ratones fueron generados sobre fondos eumelanotic, pheomelanotic o amelanóticos que incorporan el transgén K14 SCF tal como se describe (Figura 1A). Cohortes de extensión de piel clara (Mc1r E / E, + / + Tyr) los ratones se trataron tópicamente con dosis dos veces al día de vehículo (etanol 70%, 30% de glicol de propileno) o 40% de extracto de raíz de Coleus forskohlii crudo (80 micras por dosis) durante 5 días (Figura 2 B). Efectos de los tratamie...

Melanina epidérmica es inducida por la aplicación tópica de forskolina en un modelo murino de lo humano-UV sensible de piel clara. La manipulación terapéutica de los niveles de AMPc en la piel y el oscurecimiento de la epidermis a proteger firmemente contra la inflamación mediado por UV (quemadura solar) según lo medido por la dosis eritematosa mínima (MED) de ensayo.

La inducción farmacológica de la melanina epidérmica y Protección contra las quemaduras solares en un modelo de ratón humanizado

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

El objetivo general del siguiente experimento es medir la sensibilidad a la UV mediante la determinación de la dosis mínima de eritema en ratones de piel clara previamente tratados con cuatro pieles. Esto se logra primero preparando la piel dorsal de los ratones que serán irradiados mediante afeitado y ablación. A continuación, se aplican tratamientos tópicos de forskolina en la piel dorsal.Luego, los ratones se exponen a diferentes dosis de irradiación UV para determinar los efectos del melón mediado por cuatro sustancias sobre la inflamación inducida por UV. Se obtienen resultados que muestran que la aplicación tópica de forlina aumenta de manera robusta la pigmentación de la piel y que los animales con melanina farmacológicamente potenciada son resistentes a la UV, según se determina mediante la MED. Estos son estudios de prueba de concepto que demuestran que es posible inducir farmacológicamente un bronceado en un individuo incapaz de broncearse debido a un defecto en un gen muy importante de los melanocitos denominado receptor de melanocortina uno o MC1R. En las poblaciones humanas, la pérdida de función de MC1R se correlaciona con sensibilidad a la UV, tendencia a sufrir quemaduras solares e incapacidad para broncearse, y más adelante en la vida, hasta un riesgo cuatro veces mayor de melanoma.Seleccionamos cuatro esculina como fármaco para estos estudios porque es capaz de sortear una vía de señalización defectuosa del receptor de melanocortina e inducir a los melanocitos a creer que poseen una vía de señalización mc1R funcional, haciendo que produzcan gran cantidad de melanina, la cual se deposita en la piel y protege a los animales contra la radiación UV. Aunque sabemos que este método proporciona información sobre la piel que puede y sombría. También podría ser importante para la prevención del cáncer.Dado que sabemos que la radiación UV es el principal carcinógeno para la gran mayoría de los cánceres de piel y que mejorar la implementación de la protección cutánea previene lesiones por UV, uno de cuatro pasos consiste en realizar inyecciones intraperitoneales. Asegúrese de aspirar después de colocar la aguja y antes de inyectar el contenido para verificar que la aguja no haya penetrado un vaso sanguíneo, intestinos o la vejiga urinaria. Las inyecciones IP deben administrarse en el lado derecho para evitar la vejiga. Después de preparar el extracto de forlina y anestesiar brevemente al ratón con isoflurano.Por inhalación, según el protocolo descrito, administre anestesia adicional al animal mediante una inyección intraperitoneal de ketamina y xilacina. Realice una compresión en el dedo del pie para verificar la sedación. Utilice tijeras eléctricas equipadas con una cabeza quirúrgica preparatoria de 0,25 milímetros para afeitar el vello dorsal.Utilice una crema depilatoria para eliminar el vello residual. Luego, para evitar quemaduras o dañar la piel, use inmediatamente compresas de gasa humedecidas con agua para limpiar suavemente la piel dorsal hasta que se haya eliminado toda la crema. Utilice toallas de papel suaves para secar al animal antes de colocarlo en una jaula limpia sobre una almohadilla térmica para que se recupere.En general, los ratones deben anestesiarse brevemente para facilitar la administración tópica de forskolina o soluciones control mediante inhalación de isoflurano en una campana extractora. Comience con una toalla de papel saturada con isoflurano en un frasco de vidrio transparente con arena saturada de isoflurano. Después de colocar un filtro de nailon permeable al aire ajustado, anestesie al ratón colocándolo encima del filtro el tiempo suficiente para suprimir los movimientos musculares voluntarios, con el animal sedado sobre una almohadilla absorbente limpia en la bancada.Después de realizar una compresión del dedo del pie, transfiera 400 microlitros de extracto crudo de forolina a la espalda del animal goteándolo sobre la piel. Luego, utilice el lateral de la punta para extender el extracto sobre toda la superficie de la piel dorsal expuesta. Devuelva el ratón a su jaula y obsérvelo cuidadosamente hasta que se recupere de la anestesia para prevenir la despigmentación.Los efectos del AMP cíclico a partir de experimentos de sensibilidad UV confusos. Suspender todos los tratamientos tópicos dos días antes de la exposición a UV para realizar la colorimetría reflectiva. Después de anestesiar brevemente al ratón mediante inhalación de isoflurano.Calibre un colorímetro colocando la cabeza portátil sobre la superficie blanca normalizada que se proporciona con el dispositivo. Coloque la cabeza de medición portátil al ras con la piel dorsal del animal, asegurándose de que la abertura redonda de un centímetro cuadrado quede completamente presionada contra la piel. Realice al menos tres mediciones separadas en diferentes áreas de la piel dorsal.Calcule la puntuación media L, más o menos la desviación estándar por animal y por grupo de tratamiento. Para determinar la dosis eritematosa mínima o MED, cada animal se expondrá a una variedad de dosis de UV. Comience preparando un trozo de cinta oclusiva UV utilizando un perforador resistente con un recorte circular de un centímetro cuadrado para hacer agujeros en la cinta sobre cada orificio.En la cinta. Aplique un pequeño trozo de cinta fácilmente desprendible que pueda retirarse. Para la exposición a UV, coloque la cinta sobre la superficie dorsal del ratón anestesiado.Si los ojos del animal están abiertos, aplique lágrimas artificiales para prevenir lesiones por desecación y exposición a la radiación UV. Encienda la fuente de luz ultravioleta, compuesta por dos lámparas UVB con una emisión máxima de 313 nanómetros y un rango de 280 a 370 nanómetros. Permita que el cordero se equilibre a una emisión constante de UV antes de utilizar un fotómetro UV con un sensor UVB para verificar la emisión según la tasa de transmisión UV medida por el fotómetro UV; calcule el tiempo de exposición a la radiación UV para cada dosis deseada.Por ejemplo, la salida UVB de sus lámparas mide 2.4 milivatios por centímetro cuadrado. Por lo tanto, para administrar cinco kilojulios por metro cuadrado, la piel necesitaría exponerse a 208 segundos de radiación UVB, como se calcula aquí. A continuación, coloque la superficie ventral de un animal sedado hacia abajo para asegurar una exposición uniforme a la UV y administrar la dosis elegida de radiación de forma secuencial.Retire los pequeños trozos de cinta que cubren los orificios en el momento adecuado. Por ejemplo, si la dosis más alta es de 40 kilojulios por metro cuadrado, el ratón permanecerá bajo la lámpara durante 27 minutos y 47 segundos, y el orificio para esta dosis se expondrá desde el principio. Sin embargo, para la condición de cinco kilojulios por metro cuadrado, se retirará la cinta tras 208 segundos de exposición.Tiempo restante tras la exposición a UV, retire cuidadosamente la cinta y coloque los animales en un lugar cálido y tranquilo para que se recuperen de la anestesia antes de devolverlos a sus jaulas. La dosis eritematosa mínima o valor MED corresponde a la dosis mínima de UV que provoca inflamación definida por eritema y/o edema en todo el círculo expuesto de piel. Observe al ratón durante 24 a 48 horas para detectar áreas discretas de eritema o edema en las zonas expuestas a UV.A veces, el vello residual dificulta la interpretación de la prueba de DME al enmascarar la eritema o edema cutáneo subyacente; humedecer la piel con etanol al 70 % facilita mucho su interpretación. Documente cualquier hallazgo cutáneo mediante fotografías y luego devuelva los ratones a la instalación de animales. En estos experimentos, los ratones C56 black six se generaron en fondos anódicos anódicos o anódicos que incorporaban el transgén del factor de células madre K14, lo que permite a los ratones conservar melanocitos en la epidermis y, como resultado, depositar melanina.En el epidermis mostrado aquí, cohortes de ratones con piel clara fueron tratadas tópicamente durante cinco días con dosis diarias de vehículo o un extracto crudo al 40 % de raíz de colus fors coly. Los efectos de los tratamientos tópicos sobre la pigmentación epidérmica se determinaron tanto mediante inspección visual como mediante imágenes de color reflectante. La aplicación del extracto de raíz se asoció con un oscurecimiento epidérmico robusto en el fondo transgénico K14 SCF, pero no en animales no transgénicos genéticamente emparejados, lo que sugiere que los melanocitos epidérmicos interfoliculares deben estar presentes para que se deposite la melanina inducida farmacológicamente.En la epidermis, aunque el extracto de raíz tiene un color intenso debido a la presencia de fitoquímicos vegetales además de la galina cuatro, el oscurecimiento de la piel no puede atribuirse únicamente a un efecto de tinción del fármaco. Dado que los animales no transgénicos no presentan oscurecimiento de la piel con el extracto de raíz, como se demuestra aquí al aplicarlo tópicamente dos veces al día, los efectos de la forskolina sobre la melanina se observaron en tan solo dos días. Aunque el oscurecimiento máximo fue evidente después de varios días más, como se muestra en esta figura mediante la tipografía mason y la tinción de melanina en secciones de piel dorsal.El grado de melanización depende de la dosis; los animales que fueron tratados con cuatro aplicaciones en la piel una vez al día durante 15 días o dos veces al día durante cinco días experimentaron cantidades similares de oscurecimiento de la piel. Además, no hubo efectos tóxicos evidentes tras la exposición a cuatro aplicaciones en la piel en ninguno de los grupos de tratamiento. Por lo tanto, concluimos que el tratamiento acelerado de cinco días promovió una melanización segura de la piel dorsal tan eficazmente como el tratamiento estándar de una vez al día.Esta figura demuestra que, según mediciones mediante pruebas de MED, la melanina epidérmica inducida por forline resultó en una protección UV profunda, mientras que el valor medio de MED para ratones K14 SCF con extensión tratados dos veces al día durante cinco días con el vehículo fue de 5,0 ± 0,0 kilojulios por metro cuadrado. El MED promedio para los grupos tratados con four galin tópico fue mayor de 30,0 ± 0,0 kilojulios por metro cuadrado. De hecho, una dosis de 30,0 kilojulios por metro cuadrado fue insuficiente para generar eritema. En este experimento, utilizando una dosificación estándar de force Glen, el MED promedio para los ratones K14 SCF con extensión tratados fue de 50,0 ± 7,1 kilojulios por metro cuadrado.Es importante destacar que las aplicaciones tópicas de Kline no afectaron la DME de los animales incapaces de producir melanina, ya sea debido a la ausencia de melanocitos epidérmicos mediados por K14-SCF, o a la deficiencia de tirosinasa. Dado que las aplicaciones tópicas de Kline se interrumpieron dos días antes de la exposición a UV y no se continuaron después de dicha exposición, concluimos que los efectos no pigmentarios de CAMP no tuvieron un papel en los resultados de la DME. Más bien, los datos sugieren que la melanina epidérmica fue el mecanismo mediante el cual forline indujo la protección contra UV en este modelo.Una vez dominada, esta técnica permite una evaluación sencilla y reproducible de la respuesta de la pigmentación cutánea y de la sensibilidad a la radiación ultravioleta. En el modelo animal, la aplicación del forland lleva solo minutos al día, y la mayor parte del tiempo experimental realmente se dedica a la radiación UV y a las pruebas de MED. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la piel recupera gradualmente su tono claro basal por medios farmacológicos.La inducción de melanina es muy similar a la respuesta de bronceado en el sentido de que la piel permanecerá oscura mientras reciba estimulación, pero luego ese bronceado irá desapareciendo de la piel durante las siguientes semanas tras retirar el estímulo.

pharmacologic-induction-epidermal-melanin-protection-against-sunburn

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

En este video, las células de melanoma derivadas de humanos se implantan subcutáneamente en la región del flanco de un ratón inmunodeprimido. El modelo PDX permite la investigación preclínica de células de melanoma que recapitulan mejor la heterogeneidad tumoral y la agresividad del melanoma observadas en condiciones in vivo.

Modelado de xenoinjertos derivados de pacientes: una técnica para generar modelos de ratón de melanoma

Este video describe el procedimiento para inducir la carcinogénesis cutánea en dos etapas para estudiar el inicio del tumor mediante la aplicación tópica de productos químicos. En el primer paso, se aplica un mutágeno, DMBA, sobre la piel de un modelo de ratón que inicia la formación de tumores al causar mutaciones en las células madre, seguido de la aplicación de un estimulador del crecimiento, TPA, que acelera la formación de papiloma cutáneo.

Modelo de carcinogénesis cutánea en dos etapas inducida por químicos: un modelo experimental de ratón in vivo de cáncer de piel

Este video describe un método para medir la sensibilidad a los rayos UV en un modelo de ratón humanizado, un modelo de ratón que imita la piel humana. Determinamos la dosis eritematosa mínima (MED) de radiación UV que puede causar eritema o edema en la piel. El método puede ayudar a averiguar la eficacia de los fármacos utilizados para reducir la sensibilidad a los rayos UV.

Ensayo de dosis mínima eritematosa: un método para medir la sensibilidad a los rayos UV en modelos de ratón

Se describen tres métodos experimentales para la evaluación de la actividad de hipopigmentación de químicos in vitro: cuantificación del contenido 2) melanina y actividad tirosinasa 1) celular y 3) medición de la melanina por análisis de imagen y coloración celular melanina.

Cuantificación de hipopigmentación de la actividad In Vitro

El siguiente procedimiento describe un método para el control espacial y temporal del inicio del tumor melanocítico en la piel dorsal murina, utilizando un modelo de ratón modificado genéticamente. Este protocolo describe el inicio de melanoma cutáneo macroscópico y microscópico.

Control espacial y temporal de la iniciación del melanoma murino a partir de células madre de melanocitos mutantes

La carcinogénesis cutánea de dos etapas es inducida por dos productos químicos aplicados tópicamente. Un mutágeno 7,12-dimethylbenz[a]anthracene) causa mutaciones en las células epidérmicas y una aplicación continua del estimulador general del crecimiento 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate acelera la formación de papiloma de la piel.

Modelo de carcinogénesis de piel inducida por productos químicos utilizando Dimethylbenz[a]Anthracene y 12-O-Tetradecanoyl Phorbol-13-Acetate (DMBA-TPA)

El objetivo de este protocolo es inducir la producción transitoria in vivo de niveles no letales de especies reactivas de oxígeno (ROS) en la piel del ratón, promoviendo aún más las respuestas fisiológicas en el tejido.

Estimulación de nichos de células madre y regeneración de tejidos en piel de ratón mediante fotogeneración in situ dependiente de protoporfirina IX conmutable de especies reactivas de oxígeno

Aquí, describimos un sistema de reprogramación directa optimizado para melanocitos y un sistema de empaquetado de virus concentrado de alta eficiencia que garantiza una reprogramación directa sin problemas.

Reprogramación directa de fibroblastos de ratón en melanocitos

El protocolo describe un estudio de los efectos sistémicos y locales en la piel de la exposición a los rayos ultravioleta B en ratones.

Estudio de la exposición crónica de ratones a la radiación ultravioleta B 

El estudio demuestra el papel de la piel en la modulación de las respuestas inmunitarias en ratones a través de la inmunización epicutánea (EC). La inmunización de la AE con un antígeno proteico puede suprimir las respuestas inmunitarias en la hipersensibilidad de contacto o revertir la supresión inducida por la piel cuando se combina con patrones moleculares asociados a patógenos. La inmunización anticonceptiva anticonceptiva (AE) se muestra prometedora como un enfoque eficaz y sin agujas para...

Modelo murino de inmunomodulación inducida epicutáneamente

Un protocolo estandarizado para inducir la senescencia prematura en HNM utilizando tBHP, protocolos estandarizados para analizar marcadores clave de senescencia, incluyendo la detención del crecimiento, la actividad SA-β-galactosidasa y los factores SASP.

Un protocolo estandarizado para inducir la senescencia prematura inducida por estrés en melanocitos humanos primarios utilizando hidroperóxido de tert-butil

Aprende a inducir melanina epidérmica con forskolina en ratones para protección contra daño UV. Este método farmacológico demuestra aumento de pigmentación y resistencia a quemaduras solares mediante ensayo MED.

La inducción farmacológica de la melanina epidérmica y Protección contra las quemaduras solares en un modelo de ratón humanizado (Video) | JoVE Journal

La inducción farmacológica de la melanina epidérmica y Protección contra las quemaduras solares en un modelo de ratón humanizado

Explorar más videos