Name: Transináptico Seguimiento de Metas periféricos con Pseudorrabia Virus Seguido de la toxina del cólera y Biotinylated dextrano Aminas doble etiquetado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: Aprenda a rastrear circuitos neuronales premotores mediante trazado transináptico con virus pseudorrabia y técnicas de trazado clásico en ratones. Este método permite identificar redes neuronales distribuidas y confirmar conexiones específicas entre neuronas en el cerebro.

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Agradecemos al Dr. Toshio Terashima de la Universidad de Kobe, Japón, para la enseñanza de la técnica de la cirugía laríngea, y el Dr. Lynn Enquist de la Universidad de Princeton para el suministro de PRV-Bartha. La investigación fue apoyada por Pioneer Award NIH DP1 OD000448 a Erich D. Jarvis y un premio NSF Graduate Research Fellowship a Gustavo Arriaga. Las cifras del anterior trabajo debidamente acreditado se utilizan bajo la PLoS ONE acceso abierto licencias Creative Commons (CC-BY), de conformidad con las políticas editoriales de la revista.

NOTA: Todos los procedimientos con animales han sido revisados ​​y aprobados por el Comité Institucional Animal Care &amp; Use la Universidad de Duke. 1. Almacenamiento Pseudorrabia Virus <ol><li> Obtenemos virus vivo (PRV152) desde el laboratorio del Dr. Lynn Enquist en la Universidad de Princeton en un título de 1 x 10 9 pfu / m. El protocolo para generar el virus ha sido publicada 2. </li><li> Alícuota el virus en 20 l por tubo dentro de un gabinete de bioseguridad BSL-2 y se almacena a -80 ° C bajo condiciones de bioseguridad apropiadas. </li><li> Descongelar una alícuota del PRV inmediatamente antes de la inyección. </li></ol> 2. Preparación quirúrgica para inyección en el músculo <ol><li> Inducir la anestesia general mediante inyección intramuscular de ketamina-xilazina (100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina) y mantener un plano anestésico apropiado utilizando isofluorano. </li><li> Proteja las córneas con una pomada oftálmica. </li><li> Preparar tél sitio quirúrgico de acuerdo con una técnica aséptica por el recorte de pelo y la desinfección de la zona quirúrgica con alternancia de matorrales de Betadine y alcohol al 70% (mínimo de 3 ciclos). Asegúrese de utilizar paños estériles para cubrir las áreas quirúrgicas. Asegúrese de que se adhieran a las técnicas estériles durante todo el procedimiento. </li><li> Hacer una incisión en la piel y revelar el músculo de su interés. Por ejemplo, para acceder al músculo de laringe cricotiroidea es necesario quitar primero la porción suprayacente del músculo esternohioideo. </li><li> Selle cualquier músculos seccionados con Vetbond adhesivo tisular. </li></ol> 3. La inyección de PRV en el músculo <ol><li> Cargar el sistema de 10 l microjeringa nanofil con solución PRV recién descongelado, adjunte una aguja de acero inoxidable 34 G, y cuidadosamente montarlo en el dispositivo estereotáxico. </li><li> Lentamente despejar el espacio muerto y verificar que la solución sale de la punta microjeringa. Deseche el fluido como residuos bioharzard. </li><li> El uso de un microP estereotáxicodispositivo ositioning coloque cuidadosamente la punta microjeringa en el músculo de interés y llenar lentamente el músculo hasta hinchazón leve es visible. La velocidad de inyección variará dependiendo del tamaño del músculo y el volumen a inyectar. Por ejemplo, cinco inyecciones de 200 nl (1 l total) a una velocidad de 4 nl / seg deben hacerse 1 min aparte en el mismo sitio para llenar el músculo cricotiroideo. Mover la jeringa a la siguiente músculo de interés (la cricoaritenoideo lateral en este caso) y repetir el procedimiento de inyección. Sólo perforar cada músculo una vez. </li><li> Retraer la microjeringa después de cinco minutos. </li><li> Selle la rotura en la fascia usando Vetbond adhesivo tisular. </li><li> Después de todas las inyecciones se han completado, cierre la herida utilizando Vetbond adhesivo tisular. Dependiendo de sus directrices locales institional uso de animales, suturas o grapas de la herida puede ser utilizado. </li><li> Supervisar el animal hasta decúbito esternal y proporcionar analgesia, la comida, el agua y los cuidados requeridos por ynuestras pautas de uso de los animales institucionales. </li><li> Después de que el tiempo de supervivencia determinada experimentalmente (en este caso, 90 hr para etiquetar 2 nd orden neuronas corticales), sacrifica el animal por sobredosis de pentobarbital y perfundir transcardially con 0,9% de solución salina seguido por 4% de formaldehído 0,1 M en PBS. </li><li> Retire y posterior a solucionar el cerebro en formaldehído al 4% durante 24 horas. </li><li> Cryoprotect el cerebro en tampón fosfato que contiene 30% de sacarosa durante al menos 48 h. </li></ol> 4. Detección inmunoquímica de eGFP <ol><li> Cortar secciones a 40 micras en un micrótomo de deslizamiento y guardar secciones flotantes en 0,1 M PBS. Secciones más delgadas, por ejemplo 30 m, se pueden usar cuando la tinción de secciones montadas. </li><li> Saciar secciones durante 30 minutos en 0,3% de H 2 O 2 en PBS protegidas de la luz. </li><li> Bloquear antígenos no específicos en las secciones durante 30 min en PBS que contenía 0,3% de Tween 20 con suero de cabra normal desde el Kit VECTASTAIN Elite (VE kit). </li><li&gt; Incubar bloqueado secciones de 3,5 horas en conejo anti-eGFP (1: 1000) a TA. </li><li> Lavar las secciones tres veces en PBS durante 5 min, luego incubarlos durante 1 h en cabra anti-conejo anticuerpo secundario del kit VE a TA. </li><li> Preparar la solución de ABC de la VE kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Lavar las secciones tres veces en PBS durante 5 min, luego reaccionar durante 1 hora en una solución de ABC de la VE kit a TA. </li><li> Lavar las secciones tres veces en tampón de fosfato durante 10 min, y desarrollar durante 8 min en tampón de fosfato, pH 7,4, que contiene 0,05% DAB (3, 3&#39;-diaminobencidina) y 0,015% de H 2 O 2. </li><li> Mount secciones sobre portaobjetos SuperFrost Plus y deshidratar a través de una serie graduada de alcohol (70%, 95%, 100% y 100% durante 5 minutos cada uno). </li><li> Desactive las secciones a través de dos lavados de xileno (5 min cada uno) y el cubreobjetos los portaobjetos con medio de montaje Permount. </li><li> Imagen de las secciones montadas en un microscopio. El producto de reacción DAB inside las células deben aparecer marrón. Las imágenes digitalizadas pueden ser de color invertido para poner de relieve los procesos finos. </li></ol> 5. Preparación quirúrgica para inyección de trazadores en regiones del cerebro descubiertas por PRV Tracing <ol><li> Inducir la anestesia general mediante inyección intramuscular de ketamina-xilazina (100 mg / kg de ketamina; 10 mg / kg de xilazina) y mantener un plano anestésico apropiado utilizando isofluorano. </li><li> Proteja las córneas con una pomada oftálmica. </li><li> Fijar la cabeza en un marco estereotáxico apropiado. </li><li> Preparar el sitio quirúrgico de acuerdo con una técnica aséptica por el recorte de pelo y desinfectar el sitio con alternancia de matorrales de Betadine y alcohol al 70% (mínimo de 3 ciclos). </li><li> Haga una incisión del cuero cabelludo y retraer la piel sobre la región del cerebro de interés. </li><li> Realizar una pequeña craneotomía en las coordenadas estereotáxicas apropiados. Por ejemplo, las coordenadas de la corteza motor conectado laryngeally identificado por el rastreo en un PRVn ratón adulto son 1,2 mm lateral y de 0,2 mm rostral a Bregma. </li></ol> 6. La inyección de dextrano biotinilados aminas en el cerebro <ol><li> Preparar 7,5% Aminas dextrano biotina (BDA) por disolución de 25 mg de BDA (10.000 MW) en 333 l de solución salina estéril. </li><li> Cargue el sistema de micropipeta Nanoject II con suficiente solución BDA para las inyecciones previstas. </li><li> Lentamente despejar el espacio muerto y verificar que la solución está saliendo de la punta de la micropipeta. </li><li> El uso de un dispositivo de microposicionamiento estereotáxica bajar con cuidado la punta de la micropipeta en la región del cerebro de interés y lentamente inyecte BDA. Ajustar la velocidad de inyección en función del tamaño de la región a ser etiquetado. Por ejemplo, 12 inyecciones de 4,6 nl deben ser hechas en cuatro lugares diferentes de 0,2 mm de distancia (dirección rostro-caudal) para cubrir el córtex motor conectado laryngeally en ratones adultos. El volumen de inyección final debe ser ajustado de acuerdo con el tamaño de la región del cerebro de interés, Teniendo en cuenta que la etiqueta puede extenderse desde el núcleo de inyección por difusión a través tejido cerebral y a lo largo de los procesos de neuronas marcadas. </li><li> Selle la craneotomía con cemento dental, y cerrar la herida del cuero cabelludo utilizando Vetbond adhesivo tisular. </li><li> Supervisar el animal hasta decúbito esternal y proporcionar analgesia, la comida, el agua y los cuidados requeridos por sus directrices institucionales de uso animal. </li></ol> 7. La inyección de la toxina del cólera subunidad b en el músculo <ol><li> Preparar 1% cólera subunidad B de la toxina (CTB) disolviendo 1 mg de CTb en 100 l de solución salina estéril. </li><li> Seis días después de la inyección de BDA en el cerebro, realizar la preparación quirúrgica como se describió anteriormente para las inyecciones de PRV en el músculo. </li><li> Cargar el sistema de 10 l microjeringa nanofil con solución CTB, adjuntar una aguja de acero inoxidable 34 G, y cuidadosamente montarlo en el dispositivo estereotáxico. </li><li> Realizar las microinyecciones en el músculo (s) de interés como anteriormente desdescrito por PRV. </li><li> Supervisar el animal hasta decúbito esternal y proporcionar analgesia, la comida, el agua y los cuidados requeridos por sus directrices institucionales de uso animal. </li><li> Tres días después de la inyección CTB, sacrificar al animal por sobredosis de pentobarbital y perfundir transcardially con 0,9% de solución salina seguido por 4% de formaldehído 0,1 M en PBS. </li><li> Retire y posterior a solucionar el cerebro en formaldehído al 4% durante 24 horas. </li><li> Cryoprotect el cerebro en tampón fosfato que contiene 30% de sacarosa durante al menos 48 h. </li></ol> 8. Detección de BDA y CTb en las mismas secciones <ol><li> Cortar secciones a 40 micras en un micrótomo y guardar secciones flotantes en 0,1 M PBS. </li><li> Saciar secciones durante 30 minutos en 0,3% de H 2 O 2 en PBS protegidas de la luz. </li><li> Preparar la solución de ABC de la VE kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Lavar las secciones tres veces en PBS durante 5 min, luego reaccionar durante 1 hora en una solución de ABC a TA. </li&gt; <li> Lavar las secciones tres veces en tampón de fosfato durante 10 min, y desarrollar durante 8 min en tampón de fosfato, pH 7,4, que contiene 0,05% DAB (3, 3&#39;-diaminobencidina), 0,015% de H 2 O 2, y 0,05% de cloruro de níquel. El producto de reacción DAB dentro de las células debería aparecer negro. </li><li> Secciones de bloque de 30 min en PBS que contenía 0,3% de Tween 20 con suero de conejo normal desde el Kit VECTASTAIN Elite. </li><li> Incubar bloqueado secciones durante 2 horas en cabra anti-CTB (1: 10.000) a TA. </li><li> Lavar las secciones tres veces en PBS durante 5 min, luego incubarlos durante 1 h en conejo anti-cabra de anticuerpo secundario de la VE kit a TA. </li><li> Preparar la solución de ABC de la VE kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Lavar las secciones tres veces en PBS durante 5 min, luego reaccionar durante 30 min en una solución de ABC a TA. </li><li> Lavar las secciones tres veces en tampón de fosfato durante 10 min, y desarrollar para un máximo de 8 min en tampón de fosfato, pH 7,4, que contiene 0,05% DAB (3, 3&#39;diaminobenzidine) y 0,015% de H 2 O 2. El producto de reacción DAB dentro de las células debería aparecer marrón. </li><li> Mount secciones sobre portaobjetos SuperFrost Plus y deshidratar a través de una serie graduada de alcohol (70%, 95%, 100% y 100% durante 5 minutos cada uno). </li><li> Desactive las secciones a través de dos lavados de xileno (5 min cada uno) y el cubreobjetos los portaobjetos con medio de montaje Permount. </li><li> Imagen de las secciones montadas en un microscopio. </li></ol>

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</ol>

No se declaran conflictos de intereses.

Hay una serie de cuestiones que deben tenerse en cuenta al planificar un experimento utilizando PRV152 4,21. Lo más importante, virus de la pseudorrabia es letal. Como se mencionó anteriormente, los grandes simios, incluidos los seres humanos no son susceptibles a la infección, pero la atención adecuada deben ejercerse para proteger a otros animales. Los ratones adultos normalmente sobreviven cinco a siete días después de la inoculación con la cepa atenuada PRV152. Por lo tanto, PRV152 no es apropiado para lo...

Trazado transináptico se ha convertido en una poderosa herramienta utilizada para analizar eferentes centrales que regulan los objetivos periféricos a través de los circuitos multi-sinápticas. Este enfoque se ha utilizado más ampliamente en el cerebro de roedores utilizando el virus de la pseudorrabia patógenos porcina (PRV), especialmente la cepa atenuada PRV-Bartha describió por primera vez en 1961 12. A continuación, presentamos un protocolo para la identificación de la representación cortical motora de los músculos específicos o grupos musculares utilizando una cepa del virus de la pseudorrabia recombinantes (PRV152) que expresa el aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) gen informador 2. El método descrito explota el comportamiento de los virus neurotróficos, que producen progenie infecciosa que las sinapsis transversales para infectar otras neuronas dentro de un circuito funcional 3,4,13. PRV152, que es isogénica con PRV-Bartha, solamente cruza la sinapsis retrógrada a través de la secuencia jerárquica de las conexiones sinápticas de distancia del sitio de la infección 3,5 &lt;/ sup&gt;. Al controlar con precisión el sitio periférico de la infección es posible limitar la entrada del virus en el cerebro a través de un subconjunto específico de las neuronas motoras. A medida que el virus infecta secuencialmente cadenas de neuronas conectadas, el patrón resultante de la señal de eGFP en todo el cerebro entonces resolver la red de neuronas que están conectados a las células infectadas inicialmente. Una ventaja adicional del uso de virus para el rastreo neural es la amplificación de la proteína indicadora (eGFP en este caso) dentro de las células infectadas. Esta amplificación de la señal proporciona un nivel de sensibilidad que permite la detección de proyecciones incluso dispersos. Por ejemplo, una proyección de escasa corteza motora Vibrisas a las neuronas motoras faciales que controlan los bigotes se encontró en ratas utilizando la proteína fluorescente verde de forma viral expresado 14; estudios previos no lograron encontrar esta proyección utilizando trazadores clásicos sin amplificación del gen reportero 11,15. Desafortunadamente, Muchos vectores virales de rastreo, como el usado en el estudio citado, no se cruzan las sinapsis, lo que limita su uso para el rastreo de circuitos multi-sinápticas. Al presentar distintas ventajas para la identificación de la red de las células que participan en un circuito del motor, la naturaleza distribuida de transináptico rastreo con PRV-152 hace que la interpretación de conexiones específicas dentro del circuito difícil. Por lo tanto, se presenta un método simple para la validación de las conexiones específicas dentro de los circuitos identificados con PRV-152 haciendo doble etiquetado utilizando aminas biotina dextrano (BDA) y la subunidad toxina del cólera b (CTB). El uso combinado de BDA y CTb es un enfoque bien establecido para el rastreo de conexiones entre conjuntos específicos de neuronas 6-8,11. Cuando se usan juntos, estos dos marcadores se pueden visualizar en la misma sección usando un DAB de dos colores (3, 3 &#39;-Diaminobencidina) Procedimiento 16. De alto peso molecular BDA (BDA10kDa) fue seleccionado para este protocolo, ya que yields etiquetado detallado de los procesos neuronales 6,7,9. Las ventajas adicionales de BDA10kDa incluyen los siguientes: se transporta preferentemente en la dirección anterógrada 6-8; puede ser entregado por iontoforesis o la inyección de presión 6-8; se puede visualizar con un simple HRP avidina-biotina (ABC) procedimiento 17; y puede ser fotografiado por la luz o microscopía electrónica 6,7,18. Detección inmunoquímica de CTb con peroxidasa y DAB fue elegido para el etiquetado retrógrado de las neuronas motoras, ya que es eficaz en revelar los procesos celulares incluyendo dendritas distales 10,19. Recientemente hemos utilizado este enfoque para identificar la vía motora vocal en ratones y revelar una conexión escasa de la corteza motora primaria de las neuronas motoras de la laringe, que fue asumido previamente a estar ausente 20.

<table><tbody><tr><td>Nombre del reactivo/material</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Sistema de microinyección NanoFil</td><td>World Precision Instruments</td><td>IO-Kit</td><td>34 G</td></tr><tr><td>opción Marco estereotáxico</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modelo 900</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II Inyector de nanolitros automático</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo deslizante</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>VetBond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorano (Forano)</td><td>Baxter&nbsp;</td><td></td><td></td>1001936060</tr><tr><td>Betadine Swab Stick</td><td>Cardinal Health</td><td>2130-01</td><td>200 unidades</td></tr><tr><td>Permount Montaje Medio</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>portaobjetos Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Aminas de dextrano biotiniladas</td><td>Invitrogen</td><td>D-1956</td><td>10,000 MW</td></tr><tr><td>Virus de la pseudorrabia</td><td>Laboratorio del Dr. Lynn Enquist (Universidad de Princeton)</td><td>PRV152</td><td>Título >1 x 107</td></tr><tr><td>Subunidad de la toxina B contra el cólera (cabra)</td><td>Lista de Laboratorios Biológicos</td><td>703</td><td></td></tr><tr><td>Lista de subunidades de la toxina B del cólera</td><td>Laboratorios Biológicos</td><td>103B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-eGFP</td><td>Open Biosystems</td><td>ABS4528</td><td></td></tr><tr><td>3, 3'-diaminobenzidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>Tabletas de 10 mg</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 prueba</td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Diluido al 4%</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3410</td><td>30%</td></tr><tr><td>Ketamina HCl & Xilacina HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4138</td><td>80 mg/ml & 6 mg/ml</td></tr><tr><td>Cloruro de níquel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3619</td><td>1,0 M; pH 7,4</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>10x; pH 7,4</td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td>dosis</td></tr> <tr><td>de 50 mg/mlSacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xilenos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>Grado histológico</td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6101 (conejo); PK-6105 (cabra)</td><td></td></tr><tr><td>Pomada oftálmica Optixcare</td><td>Vet Depot</td><td>1017992</td><td></td></tr></tbody></table>

transináptico seguimiento de metas periféricos con pseudorrabia virus seguido de la toxina del cólera y biotinylated dextrano aminas doble etiquetado

Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Trazado transináptico se ha convertido en una poderosa herramienta utilizada para analizar eferentes centrales que regulan los objetivos periféricos a través de los circuitos multi-sinápticas. Este enfoque ha sido utilizado más extensivamente en el cerebro mediante la utilización del virus de la pseudorrabia porcina patógenos (PRV) 1. PRV no infecta a los grandes simios, incluidos los humanos, por lo que es más comúnmente utilizado en estudios de pequeños mamíferos, especialmente roedores. El PRV152 seudorrabia cepa expresa la proteína fluorescente (EGFP) gen indicador verde mejorado y sólo cruza la sinapsis funcionales retrógrada a través de la secuencia jerárquica de las conexiones sinápticas de distancia desde el sitio de la infección 2,3. Otras cepas PRV tienen propiedades microbiológicas distintos y pueden ser transportados en ambas direcciones (PRV-Becker y PRV-Kaplan) 4,5. Este protocolo se ocupará exclusivamente de PRV152. Al entregar el virus en un lugar periférico, tales como el músculo, es posible limitar la entrada del virus en tque el cerebro a través de un conjunto específico de neuronas. El patrón resultante de la señal de eGFP en todo el cerebro a continuación, resuelve las neuronas que están conectados a las células infectadas inicialmente. Como la naturaleza distribuida de rastreo transináptico con el virus de la pseudorrabia hace interpretar conexiones específicas dentro de una red identificada difícil, presentamos un método sensible y fiable empleando aminas biotina dextrano (BDA) y la toxina del cólera subunidad B (CTB) para confirmar las conexiones entre las células identificadas utilizando PRV152. Detección inmunoquímica de BDA y CTb con peroxidasa y DAB (3, 3&#39;-diaminobencidina) fue elegido porque son eficaces a revelar los procesos celulares incluyendo dendritas distales 6-11.

La tinción para eGFP debería comenzar a mostrar señales débiles en las neuronas motoras primarias, aproximadamente 72 horas después de la inyección de PRV152 en el músculo. La replicación y transporte transináptico del virus son titer- y dependiente del tiempo 4. Aproximadamente 90 horas después de la inyección, la tinción eGFP revelará potente señal en las células infectadas de orden 2 nd. Tiempos de supervivencia más largos revelarán 3º y células de orden superior, pero los tiempos de ...

El rastreo transsináptico se ha convertido en una poderosa herramienta para analizar las eferentes centrales que regulan objetivos periféricos a través de circuitos multisinápticos. Aquí presentamos un protocolo que explota el virus transsináptico de la pseudorrabia para identificar y localizar un circuito cerebral funcional, seguido de técnicas clásicas de rastreo de tracto para validar conexiones específicas en el circuito entre grupos de neuronas identificados.

Transináptico Seguimiento de Metas periféricos con Pseudorrabia Virus Seguido de la toxina del cólera y Biotinylated dextrano Aminas doble etiquetado

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

El objetivo general de este procedimiento es descubrir la red premotora central de células distribuidas que influyen en un objetivo periférico específico y luego confirmar las conexiones específicas entre esas células en el cerebro. Esto se logra primero infectando de forma retrógrada los circuitos premotores con un vector viral transsináptico que se administra periféricamente a través del músculo. El segundo paso del procedimiento consiste en visualizar las células infectadas mediante microscopía fluorescente de luz. El tercer paso consiste en confirmar conexiones específicas en el cerebro mediante la inyección de trazadores monosinápticos dirigidos a nodos previamente identificados en un circuito premotor. En última instancia, los resultados pueden mostrar cómo las células en una red premotora distribuida están conectadas entre sí mediante una combinación de rastreo viral transsináptico y técnicas neuroanatómicas tradicionales monosinápticas. La ventaja principal de esta técnica frente a métodos existentes como el rastreo neuroanatómico monosináptico tradicional es que los nodos de una red neuronal distribuida pueden identificarse y las conexiones específicas entre las células de esa red pueden resolverse en un ratón anestesiado.Prepare el sitio quirúrgico recortando el vello y desinfectando la piel con al menos tres frotaciones alternadas de Betadine y alcohol al 70 %. Ahora realice una incisión en la piel en la zona del cuello y exponga el músculo de interés. Por ejemplo, para acceder al músculo laríngeo cricotiroideo, es necesario primero retirar la porción superficial del músculo esternohioideo y sellar cualquier músculo seccionado con adhesivo tisular Vet Bond.A continuación, cargue el sistema de microjeringa nano fill de 10 microlitros con la solución de PR RV recién descongelada. Elimine lentamente el espacio muerto y verifique que la solución salga por la punta de la microjeringa. Deseche el líquido como residuo biopeligroso y monte cuidadosamente la microjeringa en el dispositivo estereotáxico.Utilizando el dispositivo de micro-posicionamiento, coloque cuidadosamente la punta de la aguja en el músculo de interés. A continuación, llene lentamente el músculo hasta que sea visible una ligera hinchazón. Ahora mueva la jeringa al siguiente músculo de interés, en este caso el cricoaritenoideo lateral, y repita el procedimiento.El procedimiento de inyección solo perfora cada músculo. La velocidad de inyección variará según el tamaño del músculo y el volumen que se deba inyectar. Por ejemplo, deben realizarse cinco inyecciones de 200 nanolitros a una velocidad de cuatro nanolitros por segundo, separadas por un minuto cada una, en el mismo sitio, para llenar el músculo cricotiroideo.Después de retirar la microjeringa, selle la ruptura en la fascia utilizando adhesivo tisular vet bond. Una vez finalizadas todas las inyecciones, cierre la herida con adhesivo tisular vet bond. Observe al animal hasta que presente recumbencia esternal.Luego administre analgesia, alimento, agua y cuidados según lo requiera el protocolo de su institución para animales. Las pautas para el procedimiento de análisis de la expresión de EGFP y de neuronas infectadas con PRV se describen en detalle en el protocolo escrito.El procesamiento del tejido es muy similar al que se describe más adelante en este video. Comience por anestesiar un ratón adulto protegiendo sus ojos y fijando la posición de su cabeza. Luego prepare el sitio quirúrgico según se indicó anteriormente con frotaciones alternadas de Betadine y alcohol al 70%.Ahora realice una incisión en el cuero cabelludo y retráctelo sobre el cerebro. Región de interés. Realice una pequeña craneotomía con el taladro en las coordenadas estereotáxicas adecuadas.Por ejemplo, las coordenadas para la corteza motora conectada a la laringe identificadas mediante rastreo con PRV en un ratón adulto son 1,2 milímetros laterales y 0,2 milímetros rostrales respecto al bgma. A continuación, prepare una solución al 7,5 % de aminas de dextrano biotiniladas en agua estéril. Luego cargue el sistema de micro pipetas NanoJet dos con suficiente solución de BDA para las inyecciones planeadas.Limpie lentamente el espacio muerto y verifique que la solución esté saliendo de la punta de la micropipeta. Utilizando el dispositivo de posicionamiento micrométrico, baje cuidadosamente la punta de la micropipeta hasta la región cerebral de interés e inyecte lentamente la solución de BDA. Ajuste la velocidad según el tamaño de la región que se desea marcar.Por ejemplo, se deben realizar 12 inyecciones de 4,6 nanolitros en cuatro ubicaciones diferentes, separadas entre sí por 0,2 milímetros, para abarcar la corteza motora conectada a la laringe en un ratón adulto.El volumen final de inyección debe ajustarse según el tamaño de la región de interés. Tenga en cuenta que la marca puede difundirse desde el núcleo de inyección a través del tejido cerebral y a lo largo de los procesos de las neuronas marcadas. Limpie y humedezca la craneotomía con solución salina estéril y cierre la herida del cuero cabelludo utilizando adhesivo tisular vet bond.Supervise al animal hasta que presente decúbito esternal. Luego, administre analgesia, alimento, agua y cuidados según lo requiera el protocolo de animales de su institución. Utilice las directrices establecidas.Seis días después, se puede inyectar la subunidad B de la toxina del cólera en el músculo del animal. Luego, al cabo de tres días, el animal debe sacrificarse para su análisis. Corte secciones de 40 micrones en un criostato y guarde las secciones flotantes en PBS 0,1 molar. Incube las secciones con peróxido de hidrógeno al 0,3 % en PBS durante 30 minutos con agitación y protegidas de la luz.Lave las secciones tres veces en PBS durante cinco minutos por lavado. Luego, incúbelas durante una hora en solución A b, C recién preparada a temperatura ambiente. A continuación, lave las secciones tres veces en tampón fosfato durante 10 minutos por lavado.Luego, desarrolle las secciones durante ocho minutos con agitación en tampón fosfato, pH 7,4, que contenga peróxido de hidrógeno DAB y cloruro de níquel. El producto de la reacción de DAB dentro de las células debe aparecer negro.A continuación, bloquee las secciones agitándolas durante 30 minutos en PBS que contenga 0,3 % de tween 20 y suero de conejo normal del kit Vector Stain Elite. A continuación, incube las secciones bloqueadas con anticuerpo de cabra anti-CTB, agitando durante dos horas a temperatura ambiente. Luego, lave las secciones otras tres veces en PBS durante cinco minutos por cada lavado.Aplique el anticuerpo secundario anticonejo del kit VE e incube los cortes bajo agitación durante una hora a temperatura ambiente. Lave los cortes tres veces con PBS durante cinco minutos por lavado y luego réalos durante 30 minutos en solución A, b, C recién preparada a temperatura ambiente. Lave los cortes tres veces con tampón fosfato durante 10 minutos e incube los cortes durante ocho minutos.En la solución de revelado, el producto de la reacción de DAB dentro de las células debe aparecer marrón. Ahora monte las secciones sobre portaobjetos super frosts más, deshidrate el tejido mediante una serie de alcoholes graduados, seguido de dos lavados de clarificación en xileno. Luego cubra los portaobjetos con paramount y proceda con la obtención de imágenes.La tinción para EGFP debería comenzar a mostrar una señal débil en las neuronas motoras primarias 72 horas después de inyectar P RV 1 52, con una tinción más intensa después de 90 horas. Este núcleo ambiguo, que alberga las neuronas motoras laríngeas, se observa 94 horas después de la inyección de P RV 1 52 en dos de los siete músculos laríngeos. Debido a que el virus ingresó al cerebro a través de neuronas que inervan los músculos infectados.Otras poblaciones de motoneuronas bulbares, como el núcleo hipogloso, no expresan EGFP después de 90 horas. Se puede observar EGFP en células de segundo orden. Estas neuronas del tronco encefálico fueron marcadas posteriormente a la infección primaria en el núcleo ambiguo.La inyección fue unilateral y el patrón resultante de marcaje en el bulbo raquídeo muestra infección del núcleo ipsilateral. También se infectaron las interneuronas reticulares del núcleo ambiguo y del núcleo del tracto solitario, y se tiñen intensamente para EGFP. Estas interneuronas conectan diversas estructuras, incluidos los grupos de motoneuronas motores y el núcleo contralateral ambiguo.Sin embargo, sus objetivos eferentes permanecen sin marcar porque el virus solo se disemina en dirección retrógrada. El tiempo de supervivencia con PRV es limitado, pero puede mostrar tinción de EGFP en células de tercer orden y órdenes superiores infectadas. Las neuronas premotoras en la corteza motora expresaron EGFP contralateral al sitio de inyección periférica. Presumiblemente, solo la población de células que componía la representación cortical motora de la musculatura laríngea fue infectada.Los axones marcados con BDA a nivel del núcleo ambiguo, indicado por flechas, hacen contacto con las neuronas motoras positivas para CTB, marcadas de forma retrógrada mediante inyecciones en los músculos laríngeos, visibles en marrón; los axones forman varicosidades y bastones terminales putativos cerca de las dendritas de las neuronas motoras laríngeas y cerca del soma de estas neuronas motoras. Se requieren experimentos adicionales utilizando microscopía electrónica o electrofisiología para determinar si estas varicosidades representan sinapsis. Una inyección bilateral de BDA realizada en la corteza motora conectada con la laringe se observa en negro, ya que el BDA no es direccionalmente específico, por lo que pueden marcarse tanto las conexiones aferentes como eferentes.Por ejemplo, en el tálamo se observan tanto un campo de proyección de marcaje anterógrado como cuerpos celulares marcados por retrotrazado. Las células talámicas se identifican mediante la punta de flecha y la cápsula interna se marca para orientación. No olvide que trabajar con el virus de la rabia pseudotípica y DAB puede ser extremadamente peligroso y que son necesarias precauciones como la esterilización.Todos los materiales que estuvieron en contacto con PRV o DAB se trataron con una solución de lejía al 10%. Siempre se debe realizar una eliminación adecuada de los residuos biopeligrosos sólidos y líquidos de acuerdo con las regulaciones de su institución mientras se lleva a cabo este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Un método de rastreo de neuronas conectadas sinápticamente se describe. Usamos especificidad TVA de una célula de aguas arriba para probar si una población celular de interés recibe la entrada sináptica de tipos de células genéticamente definidos.

Trazado de Circuitos Viral genéticamente definidos Neural

Aprovechando una estrategia genética binaria, proporcionamos un protocolo detallado para el rastreo de circuitos neuronales en ratones que expresan trazadores transsinápticos complementarios después de la recombinación mediada por Cre. Debido a que la producción de trazadores específicos de células está codificada genéticamente, nuestro enfoque experimental es adecuado para estudiar la formación y maduración de circuitos neuronales durante el desarrollo del cerebro embrionario murino a una...

Condicional transsynaptic genética Seguimiento en el cerebro de embriones de ratón

Describimos una técnica para etiquetar las neuronas y sus procesos a través de anterógrada o retrógrada trazadores inyecciones en núcleos cerebrales utilizando una preparación in vitro. Hemos modificado un método existente de i n vitro electroporación trazador mediante el aprovechamiento de la etiqueta fluorescente mutantes de ratón y equipo óptico básica con el fin de aumentar la precisión de etiquetado.

Neuronal Tracing en explantes cerebrales guiadas por láser

Este video muestra el procedimiento de craneotomía que permite obtener imágenes crónicas de neuronas en la corteza retroesplenial de ratón utilizando microscopía in vivo de dos fotones en la línea transgénica Thy1-GFP. Este enfoque se combina con la inyección de virus adenoasociados que expresan mCherry en el hipocampo dorsal. Estas técnicas permiten el seguimiento a largo plazo de la plasticidad estructural dependiente de la experiencia en RSC.

Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

Este protocolo describe reconstrucciones a gran escala de poblaciones neuronales selectivas, etiquetadas después de la infección retrógrada con un virus de la rabia modificado expresan marcadores fluorescentes, y analiza, racimo imparcial independiente que permiten la caracterización completa de las métricas morfológicas entre subclases neuronales distintas.

Las reconstrucciones de gran escala e imparcial La agrupación independiente, basada en métricas morfológicas para clasificar las neuronas en poblaciones selectivos

Aquí, presentamos un protocolo refinado para revelar con eficacia biotinilado amina de dextrano (BDA) etiquetado con un fluorescente tinción a través de una vía neural recíproca. Es conveniente para el análisis de la estructura fina de la BDA de etiquetado y distinguirlo de otros elementos neurales en un láser confocal de barrido microscopio.

Mejorar la aplicación de la amina de biotinilado dextrano de alto peso Molecular para la proyección de talamocorticales remontar en la rata

Describimos un análisis óptico para la vesícula sináptica (SV) reciclado en neuronas cultivadas. Combinar este protocolo con doble transfección para expresar un marcador presináptico y la proteína de interés nos permite localizar sitios presinápticos, su vesícula sináptica capacidad de reciclaje y determinar el papel de la proteína de interés.

Un análisis óptico para el reciclaje de la vesícula sináptica en neuronas cultivadas Overexpressing proteínas presinápticas

El protocolo actual demuestra un método simple para el rastreo de las proyecciones de glutamato del área tegmental ventral (VTA) al hipocampo. La fotoestimulación de las neuronas de glutamato VTA se combinó con el registro de CA1 para demostrar cómo los terminales de glutamato VTA modulan la tasa de disparo piramidal putativa CA1 in vivo.

Trazado anatómico y funcional combinado in vivo de terminales de glutamato del área tegmental ventral en el hipocampo

Aquí presentamos un protocolo que describe la transducción viral de regiones cerebrales discretas con construcciones optogenéticas para permitir la caracterización electrofisiológica específica de la sinapsis en cortes cerebrales agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogación optogenética de la transmisión sináptica de largo alcance y la plasticidad de la corteza prefrontal medial a la corteza entorrinal lateral

Utilizando ratones fluorescentes transgénicos, se describen protocolos detallados para evaluar el transporte axonal in vivo de endosomas de señalización y mitocondrias dentro de los axones motores y sensoriales del nervio ciático intacto en animales vivos.

Ampliación del kit de herramientas para imágenes in vivo del transporte axonal

La tomografía de dos fotones en serie (STPT) es una técnica para obtener imágenes de una masa de tejido en su forma tridimensional mediante la combinación de imágenes de dos fotones con el control automático de la etapa y el corte de micrótomos. Aquí describimos un protocolo para implementarlo en cerebros de tití para comprender mejor sus características estructurales.

Tomografía seriada de dos fotones de todo el cerebro del tití para análisis neuroanatómicos

Aprenda a rastrear circuitos neuronales premotores mediante trazado transináptico con virus pseudorrabia y técnicas de trazado clásico en ratones. Este método permite identificar redes neuronales distribuidas y confirmar conexiones específicas entre neuronas en el cerebro.

Transináptico Seguimiento de Metas periféricos con Pseudorrabia Virus Seguido de la toxina del cólera y Biotinylated dextrano Aminas doble etiquetado (Video) | JoVE Journal

Transináptico Seguimiento de Metas periféricos con Pseudorrabia Virus Seguido de la toxina del cólera y Biotinylated dextrano Aminas doble etiquetado

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