Transináptico Seguimiento de Metas periféricos con Pseudorrabia Virus Seguido de la toxina del cólera y Biotinylated dextrano Aminas doble etiquetado
14 de septiembre de 2015
El rastreo transsináptico se ha convertido en una poderosa herramienta para analizar las eferentes centrales que regulan objetivos periféricos a través de circuitos multisinápticos. Aquí presentamos un protocolo que explota el virus transsináptico de la pseudorrabia para identificar y localizar un circuito cerebral funcional, seguido de técnicas clásicas de rastreo de tracto para validar conexiones específicas en el circuito entre grupos de neuronas identificados.
El objetivo general de este procedimiento es descubrir la red premotora central de células distribuidas que inciden en un objetivo periférico específico y luego confirmar las conexiones específicas entre esas células en el cerebro. Esto se logra primero retrógradamente, infectando los circuitos premotores con un vector viral transsináptico que se administra periféricamente a través del músculo. El segundo paso del procedimiento es visualizar las células infectadas con microscopía fluorescente de luz.
El tercer paso es confirmar conexiones específicas en el cerebro mediante la inyección de trazadores sinápticos monos dirigidos a nodos previamente identificados en un circuito premotor. En última instancia, los resultados pueden mostrar cómo las células de una red premotora distribuida están conectadas entre sí a través de una combinación de rastreo viral transsináptico y técnicas neuroanatómicas monosinápticas tradicionales. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes como el neuro trazado sináptico tradicional, es que se pueden identificar los nodos de una red neuronal distribuida y las conexiones específicas entre las células de esa red se pueden resolver en un ratón anestesiado.
Prepare el sitio quirúrgico recortando el vello y desinfectando la piel con al menos tres exfoliantes alternos de Betadine y alcohol al 70%. Ahora haga una incisión en la piel en el área de la garganta y revele el músculo de interés. Por ejemplo, para acceder al músculo laríngeo cricotiroideo, primero es necesario quitar la parte suprayacente del músculo esternohioides y sellar los músculos seccionados con adhesivo de tejido de unión veterinaria.
A continuación, cargue el sistema de microjeringa de micro llenado nano de 10 microlitros con una solución PR RV recién descongelada. Limpie lentamente el espacio muerto y verifique que la solución salga de la punta de la microjeringa. Deseche el líquido como residuo biopeligroso y móntelo cuidadosamente en el dispositivo estereotáxico.
Con el dispositivo de microposicionamiento, coloque con cuidado la punta de la aguja en el músculo de interés. A continuación, llene lentamente el músculo hasta que se vea una ligera hinchazón. Ahora mueva la jeringa al siguiente músculo de interés, el cricoaritenoides lateral en este caso y repita.
El procedimiento de inyección solo perfora cada músculo. Una vez que la tasa de inyección variará en función del tamaño del músculo y del volumen a inyectar. Por ejemplo, se deben realizar cinco inyecciones de 200 nanolitros a una velocidad de cuatro nanolitros por segundo con un minuto de diferencia en el mismo sitio para llenar el músculo cricotiroideo.
Después de retraer la microjeringa, selle la rotura en la fascia con adhesivo de tejido de unión veterinaria. Una vez finalizadas todas las inyecciones, cierre la herida con adhesivo de tejido vet bond. Vigile al animal hasta que muestre decúbito esternal.
A continuación, proporcione analgesia, alimento, agua y cuidados según lo requiera su animal institucional. Pautas de uso. El procedimiento para analizar la expresión de EGFP y las neuronas infectadas con PRV se trata en detalle en el protocolo de texto.
El procesamiento de tejidos es muy similar al que se trata más adelante en este video. Comience por anestesiar a un ratón adulto protegiendo sus ojos y fijando la posición de su cabeza. A continuación, prepare el sitio quirúrgico como se ha indicado anteriormente alternando exfoliantes de Betadine y alcohol al 70%.
Ahora haga una incisión en el cuero cabelludo y retraiga el cuero cabelludo sobre el cerebro. Región de interés. Realizar una pequeña craneotomía con el taladro en las coordenadas estereotáxicas adecuadas.
Por ejemplo, las coordenadas de la corteza motora conectada a la laringe identificada por el trazado PRV en un ratón adulto son 1,2 milímetros laterales y 0,2 milímetros rostral al bgma. A continuación, prepare una solución al 7,5% de aminas de dextrano biotiniladas en agua estéril. A continuación, cargue el sistema de dos micropipetas nano jet con suficiente solución de BDA para las inyecciones planificadas.
Limpie lentamente el espacio muerto y verifique que la solución esté saliendo de la punta de la micropipeta. Con el dispositivo de microposicionamiento, baje con cuidado la punta de la micropipeta en la región del cerebro de interés e inyecte lentamente la solución de BDA. Ajuste la velocidad en función del tamaño de la región que se va a etiquetar.
Por ejemplo, se deben realizar 12 inyecciones de 4,6 nanolitros en cuatro lugares diferentes, a 0,2 milímetros de distancia. Stro mima para cubrir la corteza motora conectada laríngea en un ratón adulto.
El volumen final de inyección debe ajustarse de acuerdo con el tamaño de la región de interés. Tenga en cuenta que la etiqueta puede difundirse desde el núcleo de la inyección a través del tejido cerebral y a lo largo de los procesos de las neuronas marcadas. Limpie y humedezca la craneotomía con solución salina estéril y cierre la herida del cuero cabelludo con adhesivo tisular vet bond.
Vigile al animal hasta que muestre decúbito esternal. A continuación, proporcione analgesia, alimento, agua y cuidados según lo requiera su animal institucional. Pautas de uso.
Seis días después, la subunidad B de la toxina del cólera se puede inyectar en el músculo del animal. Luego, en tres días, el animal debe ser sacrificado para su análisis. Corte secciones a 40 micras en un criostato y guarde las secciones flotantes en PBS de 0,1 molares, enfríe las secciones con peróxido de hidrógeno al 0,3% en PBS durante 30 minutos con agitación y protéjalas de la luz.
Lave las secciones tres veces en PBS durante cinco minutos por lavado. A continuación, reaccione durante una hora en una solución A, b, C recién preparada a temperatura ambiente. Ahora lave las secciones tres veces en tampón de fosfato durante 10 minutos por lavado.
A continuación, revele las secciones durante ocho minutos con agitación en tampón de fosfato. pH 7,4 que contiene peróxido de hidrógeno DAB y cloruro de níquel. El producto de reacción DAB dentro de las células debe aparecer negro.
A continuación, bloquee las secciones mientras agita durante 30 minutos en PBS que contiene 0.3%tween 20 con suero de conejo normal del kit Vector Stain Elite. A continuación, incubar las secciones bloqueadas en anti CTB de cabra agitando durante dos horas a temperatura ambiente. A continuación, lave las secciones tres veces más en PBS durante cinco minutos por lavado.
Aplicar el anticuerpo secundario antigo conejo del kit VE e incubar los trozos agitando durante una hora a temperatura ambiente. Lave las secciones tres veces en PBS durante cinco minutos por lavado y luego reaccione durante 30 minutos en una solución A, b, C recién preparada a temperatura ambiente. Lave las secciones tres veces en tampón de fosfato durante 10 minutos e incube las secciones durante ocho minutos.
En la solución de revelado, el producto de reacción DAB dentro de las células debe aparecer de color marrón. Ahora monte las secciones en súper heladas más portaobjetos en los portaobjetos, deshidrate el tejido a través de series de alcohol graduado, seguido de dos lavados de limpieza en xileno. A continuación, cubra los portaobjetos con Paramount y proceda con la toma de imágenes.
La tinción para EGFP debe comenzar a mostrar una señal débil en las neuronas motoras primarias 72 horas después de inyectar P RV 1 52 y la tinción se vuelve robusta después de 90 horas. Este núcleo ambiguo, que alberga las neuronas motoras laríngeas, se observa 94 horas después de la inyección de P RV 1 52 en dos de los siete músculos laríngeos. Porque el virus entró en el cerebro a través de las neuronas que inervan los músculos infectados.
Otros grupos de neuronas motoras atorias, como el núcleo hipogloso, no expresan EGFP después de 90 horas. El EGFP se puede ver en células de segundo orden. Estas neuronas del tronco encefálico se tiñeron después de la infección primaria en el núcleo ambiguo.
La inyección fue unilateral y el patrón resultante de etiqueta en el tronco encefálico muestra infección del núcleo ipsilateral. Las interneuronas reticulares de núcleo reticular ambiguas y solitarias también se infectaron y se tiñeron fuertemente para EGFP. Estas interneuronas conectan varias estructuras, incluidas las neuronas motoras atoratorias, los grupos y el núcleo contralateral. Ambiguo.
Sin embargo, sus objetivos eferentes permanecen sin etiquetar porque el virus solo se propaga en dirección retrógrada. El tiempo de supervivencia con PRV es limitado, pero puede mostrar tinción de EGFP en células de tercer orden y neuronas premotoras infectadas en la corteza motora que expresan EGFP contralateral al sitio de inyección periférico. Presumiblemente, solo la población de células que componían la representación cortical motora de la musculatura laríngea estaba infectada.
Los axones marcados con BDA a nivel del núcleo ambiguo marcados por puntas de flecha, hacen contacto con las neuronas motoras CTB positivas retrógradas marcadas por inyecciones en los músculos laríngeos vistos en marrón, los axones forman várices y bastones terminales putativos cerca de las dendritas de las neuronas motoras laríngeas y cerca del soma de las neuronas motoras laríngeas. Se requieren más experimentos utilizando microscopía electrónica o electrofisiología para determinar si estas várices representan sinápticas. Una inyección bilateral de BDA colocada en la corteza motora conectada a la laringe se ve en negro porque el BDA no es direccionalmente específico, tanto las conexiones aferentes como las eferentes pueden estar etiquetadas.
Por ejemplo, en el tálamo se observa tanto un campo de proyección de etiqueta anterógrada como cuerpos celulares marcados retrógrados. Las células talámicas se identifican por la punta de flecha y la cápsula interna está etiquetada para orientarse. No olvide que trabajar con el virus de la pseudo rabia y el DAB puede ser extremadamente peligroso y precauciones como la esterilización.
Todos los materiales que estuvieron en contacto con PRV o DAB utilizando una solución de lejía al 10%. Siempre se debe realizar una disposición adecuada de los residuos sólidos y líquidos biopeligrosos de acuerdo con las regulaciones de su institución mientras se realiza este procedimiento.
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Resumen
Este artículo presenta un protocolo para analizar eferencias centrales que regulan objetivos periféricos mediante circuitos multisinápticos utilizando rastreo transsináptico. El método emplea un virus de la rabia pseudorrábies transsináptico para identificar y localizar circuitos cerebrales, seguido de técnicas clásicas de rastreo de trayectos para su validación.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Neuroanatomía
- Técnicas de trazado viral
Antecedentes
- El rastreo transsináptico es una herramienta poderosa para mapear circuitos neuronales.
- El uso de vectores virales permite la identificación de redes neuronales distribuidas.
- Las técnicas clásicas de rastreo de trayectos proporcionan validación de las conexiones.
- Este método mejora la comprensión de las redes premotoras y sus objetivos periféricos.
Objetivo del estudio
- Descubrir la red premotora central de células que proyectan a áreas periféricas específicas.
- Confirmar conexiones específicas entre neuronas identificadas en el cerebro.
- Utilizar una combinación de rastreo viral y técnicas tradicionales para la cartografía integral.
Métodos Utilizados
- Infección retrógrada de circuitos premotores mediante un vector viral transsináptico.
- Visualización de células infectadas mediante microscopía fluorescente de luz.
- Inyección de trazadores monosinápticos para confirmar las conexiones en el cerebro.
- Análisis de la conectividad dentro de una red premotora distribuida.
Resultados principales
- Identificación de nodos en la red premotora.
- Visualización de conexiones específicas entre neuronas.
- Demuestra las ventajas del rastreo transsináptico frente a los métodos tradicionales.
- Información sobre la organización de los circuitos premotores que afectan a los objetivos periféricos.
Conclusiones
- El protocolo mapea eficazmente circuitos neuronales complejos.
- El rastreo transsináptico proporciona una comprensión más clara de la conectividad neuronal.
- Este enfoque puede aplicarse a diversos estudios de redes neuronales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite a los investigadores de biofármacos mapear redes premotoras distribuidas que regulan objetivos periféricos, apoyando la validación de objetivos en el descubrimiento de neuroterapéuticos. Al combinar el rastreo viral transsináptico con la marcación neuroanatómica clásica, mejora la reducción de riesgos mecanicistas de hipótesis sobre circuitos centrales que afectan la fisiología periférica. El enfoque aumenta la confianza predictiva en las primeras etapas del descubrimiento al resolver la conectividad sináptica dentro de redes funcionalmente definidas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Investiga hipótesis terapéuticas mediante la identificación de neuronas premotoras centrales vinculadas sinápticamente a sitios efectores periféricos.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de dianas mediante el rastreo retrógrado transsináptico desde sitios de inyección muscular periféricos.
- Valor predictivo: Apoya la selección de proyectos al aclarar la organización jerárquica de las redes neuronales distribuidas que modulan la fisiología periférica.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara poblaciones neuronales validadas para el cribado posterior de compuestos que afectan la modulación de circuitos central-periféricos.
- Valor operativo: Estandariza la marcación específica de conexiones mediante doble marcación con BDA y CTb, mejorando la reproducibilidad entre experimentos.
- Escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma para mapear múltiples objetivos periféricos utilizando protocolos de trazado idénticos.
Investigación Translacional y Preclínica
- Continuidad Traductiva: Vincula la cartografía de circuitos en fase de descubrimiento con la validación preclínica al confirmar conexiones monosinápticas entre nodos premotores identificados y sus objetivos periféricos.
- Reducción de Incertidumbre Mecanicista: Disminuye la ambigüedad en los modelos de circuitos centrales al determinar si las neuronas marcadas forman conexiones directas o indirectas con los efectores periféricos.
- Relevancia para Enfermedades: Apoya estudios sobre trastornos neuromusculares, disregulación autonómica y patologías del control motor en las que la integridad del circuito central-periférico es fundamental.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde el Descubrimiento Inicial hasta la Identificación de Compuestos Prometedores y la Validación Preclínica, permitiendo la refinación iterativa de dianas centrales en circuitos que modulan la fisiología periférica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la identificación de redes premotoras distribuidas a través del rastreo viral transsináptico retrógrado desde sitios periféricos.
- Selección: Permite la preparación del ensayo mediante la etiquetación estandarizada y cuantitativa de conexiones sinápticas utilizando BDA y CTb con detección por DAB.
- Análisis: Genera lecturas multiplexadas (eGFP, BDA, CTb) que permiten el análisis comparativo de la fuerza y especificidad de las conexiones en distintas condiciones experimentales.
- Investigación Traductiva: Conecta los resultados del rastreo viral con la continuidad preclínica al validar enlaces monosinápticos entre neuronas centrales y dianas periféricas.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para mapear circuitos central-periféricos en múltiples modelos de enfermedad y campañas de validación de dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en las relaciones entre circuitos centrales y efectores periféricos.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad mediante la validación con doble marcado de las conexiones rastreadas transsinápticamente.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar una resolución a nivel de circuito que reduce los riesgos en las estrategias de interacción con objetivos centrales.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en la intensidad y especificidad confirmadas de la conectividad central-periférica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en neurociencia viral, cirugía estereotáxica y técnicas de trazado neuroanatómico.
- Depende de infraestructura de bioseguridad para el manejo del PRV152 y de reactivos de detección peligrosos basados en DAB.
- Necesita protocolos estandarizados de perfusión, corte e inmunohistoquímica entre laboratorios para obtener resultados reproducibles.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a modelos no roedores debido a las limitaciones del rango de hospedero del PRV.
- Las limitaciones prácticas incluyen restricciones en el tiempo de supervivencia con el PRV y la posibilidad de etiquetado inespecífico por difusión del BDA a lo largo de los procesos neuronales.
