Name: Ensayo Infinium para aplicaciones a gran escala de genotipado de SNP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 33 s
Description: Aprende el ensayo Infinium para genotipado de SNP a gran escala usando amplificación, hibridación y escaneo de muestras de ADN. Este protocolo permite analizar millones de variantes en cientos de muestras en tres días.

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La financiación de este trabajo ha sido proporcionada por NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959 y NIH R56 AI063274

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Los autores de este artículo no tienen intereses financieros en competencia a revelar.

Aplicaciones de genotipado a gran escala se han utilizado para comprender mejor el mecanismo genético subyacente en muchas enfermedades humanas. El descubrimiento de cualquier variante significativa a través de un análisis de asociación amplia del genoma puede destacar una región candidata para el estudio adicional. Además, los datos genotipo es una buena herramienta para el control de calidad en los proyectos de secuenciación. Para maximizar el rendimiento de la muestra, múltiples placas de muestra se pueden amplificar y almacenados en sus estados fragmentados, resuspendido. Ocho placas pueden ser amplificados en un solo día, la combinación de las primeras 24 h del protocolo para varios lotes y proporcionar material suficiente para ~ 2-8 días de procesamiento de chip. Si las placas amplificados se almacenan de antemano, y si las nuevas muestras se hibridan a los chips inmediatamente después de la exploración comienza en la ejecución anterior, el procesamiento puede funcionar continuamente sin la necesidad de hacer una pausa para la preparación de la muestra adicional. Por lo tanto, aunque las muestras tendrán tres días para someterse a la completaensayo, los datos se pueden generar todos los días. Fichas Assuming24 se procesan cada día, una semana laboral de 5 días permite más de un 1.000 muestras de ADN para que se ejecuten en un chip de talón 12 muestras. Si cualquier paso o reactivo no ha logrado, sin embargo, varios lotes podrían estar en riesgo de malos resultados antes de cualquier corrección se puede aplicar. Los errores pueden pasar desapercibidos hasta que los arrays se escanean o analizados, por lo tanto, si el rendimiento se maximiza, cientos de muestras en diferentes etapas del protocolo pueden ya han recibido el mismo tratamiento defectuoso sobre el descubrimiento. Como reactivos y la pérdida de datos no se pueden recuperar, el usuario debe sopesar estos riesgos contra la necesidad de un flujo de trabajo acelerado. El software de análisis de GenomeStudio es la primera oportunidad de medir realmente el éxito del proceso de determinación del genotipo. Si la norma-R vs parcelas intensidad Norma-Theta están debidamente agrupados, la tasa media de las llamadas (por ciento del total de SNPs escrito correctamente) de las muestras debe acercarse a 99%, aunque este valor varía slightly dependiendo del tipo de matriz. Los datos de cualquier muestra con una tarifa de llamadas inferiores a 85-90%, no es digno de confianza y deben desecharse. A efectos de control de calidad, los resultados deben ser comparados con ningún genotipos siempre que sea posible previamente conocidos. Si no existe tal información, intencional duplicación de la muestra es una herramienta útil en la verificación de la placa o de matriz colocaciones. Estos pares de duplicados se deben colocar en chips separados, placas, lotes o proyectos; sus genotipos comprueban tras generación. Si bien las limitaciones de CC específicos varían de acuerdo a la preferencia del investigador, las limitaciones SNP comunes se basan en el éxito llamada de ejemplo, Hardy-Weinberg o missingness entre casos y controles, mientras que las restricciones de muestra comunes se basan en las tarifas de llamadas, incoherencias mendelianos, o las referencias cruzadas del cromosoma X heterocigosidad a los datos clínicos de género [13]. Si surge algún problema, el Dashboard controles, que se encuentra en la sala de análisis, puede ser sometido a laempresa con el fin de determinar la causa. Estos controles a menudo pueden reducir la cuestión a la etapa más probable o el fracaso de reactivos. Si alguno de los SNPs de interés se encuentran a través de un experimento de genotipado Infinium, sus parcelas intensidad debe ser una doble comprobación en GenomeStudio por errores de agrupación antes de que se realicen más investigaciones. Un fallido Infinium experimento de genotipado es probablemente debido a un error de procesamiento humano o ADN de entrada de baja calidad. Ejemplo de cuantificación debe ser exacta y precisa. Para obtener los mejores resultados, ningún reactivo añadido a cualquier muestra o chip deben ser dispensadas en el volumen establecido por el protocolo. Las pipetas se calibran correctamente. Los reactivos no deben ejecutarse después de la caducidad y no deben volver a congelarse una vez descongelado, salvo para el reactivo RA1. Con el fin de minimizar los posibles errores de tinción y extensión, la mezcla formamida / EDTA debe estar preparado fresco cada mes. Todos los -20 ° C, los reactivos deben almacenarse en sólo congeladores de descongelación manual. Todo el material de laboratorio utilizado en la víaaining, de extensión y de lavado de partes del protocolo se deben enjuagar bien con agua y detergente suave inmediatamente después de dejar de usar. Los depósitos en la cámara de humidificación hyb se deben lavar con un cepillo de tubo de ensayo y un detergente suave. Las placas de vidrio se deben lavar con lejía al 10%, según las instrucciones de sus manuales de usuario, una vez a la semana.

Escribiendo polimorfismos de nucleótido único (SNP) es un método clave para la identificación de variantes de riesgo asociados con la enfermedad. Históricamente, el alcance de experimentos de genotipado ha sido limitada por la tecnología disponible. Métodos de genotipificación basados ​​en la electroforesis en gel se limitan en la muestra-y SNP-producción [1]. El desarrollo de estos ensayos a menudo puede ser de trabajo intensivo, basándose en la composición y la estructura de la región que rodea la variante para la optimización de [1]. Genotipificación TaqMan, desarrollado por Life Technologies, se puede ejecutar un gran número de muestras de forma rápida y con una mínima participación técnico [2], pero las restricciones SNP-multiplexación siguen limitando el número total de los genotipos a bastante menos de un millón al día [3,4 ]. Plataforma de Sequenom IPLEX también puede ejecutar muchas muestras a la vez, pero, ya que menos de un centenar de SNPs pueden ser multiplexados juntos, el rendimiento es comparativamente bajo en general [5]. Secuencia tecnología SNP de Beckman Coulterpodría producir teóricamente más de tres millones de genotipos por día, pero este rango de proyecto límites de la tecnología a un máximo de sólo cuarenta y ocho SNPs por reacción de [4,6]. Si bien el ensayo GoldenGate puede procesar casi doscientos muestras de ADN de cada día en cientos o miles de SNPs por muestra, el precio por el genotipo no es competitivo con, técnicas de ultra-alto rendimiento avanzados al escribir más de tres mil SNPs a la vez [4,7 ]. Para procesar varios millones de genotipos por día, la escala necesaria para grandes estudios de asociación de todo el genoma, los ensayos de matriz de hibridación se han convertido en la opción más rentable en el mercado. Línea de Affymetrix arrays de hibridación y de la línea de arrays basados ​​en Infinium de Illumina permiten potencialmente cientos de muestras que se escriben en los cientos de miles o millones de SNPs en paralelo [4,8]. Estos SNPs pueden estar dispersos por todo el genoma, localizada en las regiones de interés, como el exomes, o personalizado a la preferencia del usuario. Estas matrices tienen la ventaja de no sólo ser capaz de determinar el genotipo de forma precisa un millón de SNPs por muestra a la vez, sino también para medir el número de copias variación, anomalías cromosómicas potencialmente revelando. Alineados Infinium matrices OMNI BeadChip actualmente tienen la capacidad de determinar el genotipo de hasta casi cinco millones de marcadores por muestra, incluyendo medio de un millón de loci de encargo, en un máximo de casi un centenar de muestras de cada día. Como la mayoría de las enfermedades tienen un componente genético, estos experimentos a gran escala puede ser crucial en la búsqueda de genes asociados con la enfermedad. Genotipado de alto rendimiento permite una generación genotipo eficiente de ejemplo establece lo suficientemente grande para detectar de manera convincente de asociación genética en las frecuencias de alelos menores inferiores. Proyectos de genotipado de todo el genoma se pueden utilizar para localizar regiones con estadísticamente significativa frecuencia de los alelos de casos y controles o las diferencias de número de copias [9,10,11]. Según el Ge humano NacionalInstituto de Investigación nome, estudios de asociación del genoma llevó a 1.490 publicaciones separadas entre el 25 de noviembre de 2008 y 25 de enero 2013, derivada del descubrimiento de 8283 SNPs con un p-valor inferior a 1 x 10 -5 (ver http:// www.genome.gov/gwastudies/). Estos estudios, que investigan las condiciones que van desde la altura con el cáncer testicular, se benefició de las líneas generales que ofrece un análisis de todo el genoma. En casos como estos, regiones enteras de interés podrían haber escapado a la atención había el alcance de la tipificación sido demasiado restrictivo. Por lo tanto, para los análisis de asociación a gran escala, una técnica de determinación del genotipo de todo el genoma es la técnica de elección. Existen diferentes versiones del ensayo Infinium, cada uno diseñado para ser utilizado con los tipos específicos de arrays. El ensayo InfiniumUltra, discutido en profundidad más adelante, es apropiada para muchos 12 - o 24-muestra fichas de matriz. Estos a menudo genotipo más de cien mil SNPs por muestra de ADN y se centran en tregiones argeted, como en los paneles exoma o personalizados. Otras versiones de ensayo podrían ser necesarias para otros tipos de chips, tales como las matrices de genotipado de todo el genoma. Sin embargo, como todos los ensayos Infinium comparten una base común y difieren principalmente sólo por los nombres de reactivos, los volúmenes de reactivos, o el procedimiento exacto reactivo de tinción, técnicas perfeccionadas en una versión de ensayo a menudo pueden ser de aplicación universal. Otras matrices, tales como arrays de metilación, pueden utilizar un protocolo casi idéntico, también. Se debe tener cuidado al usar sólo la versión del ensayo requerida para el tipo de chip en uso. Algunos tipos, como aquellos que miden el nivel de expresión de genes, podrían requerir el uso de un protocolo nonInfinium. Las muestras deben ser procesadas en lotes. Por ejemplo, con el ensayo InfiniumUltra, tubos de reactivo de prehibridación contienen suficiente volumen para funcionar 96 muestras, y los tubos no se pueden volver a congelar. Por lo tanto, las muestras se deben ejecutar en lotes de 96 muestras a la vez. Las muestras se amplifican en los abetost días. Después de aproximadamente 1 hora de benchwork, las muestras deben ser calentados en un horno de convección durante 20-24 h. Al día siguiente, casi 4 horas se gastará fragmentación, lo que precipitó y resuspender las muestras, momento en el que las muestras pueden o bien ser congelados para uso futuro o hibrida con el chip. Cargando fichas toma cerca de 2 horas, después de lo cual las muestras se hibridó durante la noche de 16 a 24 h. En el tercer día, la etapa de tinción y la extensión toma ~ 4 horas. Una hora más se gastará de lavado, recubrimiento, y el secado de las virutas. Finalmente, las matrices se escanean, que puede tardar 15-60 min / viruta, dependiendo del tipo utilizado. Se aplican las medidas de seguridad de laboratorio y de limpieza estándar. Aunque la amplificación está basada en la PCR no es así, las estaciones de trabajo separadas para pre y postamplification procedimientos son necesarios con el fin de reducir al mínimo la probabilidad de contaminación. El número de identificación de cada reactivo kit suministrado en uso hay que estar inscrito en una hoja de seguimiento. Reagents deben descongelarse inmediatamente antes de su uso y de invertir varias veces antes de la dispensación. El ADN que ser escrito debe ser ADN genómico de alta calidad (260/280 relación de absorbancia de 1,6-2,0, 260/230 relación de absorbancia de por debajo de 3,0), aislado por métodos estándar y se cuantifica con un fluorómetro. La degradación de ADN es a menudo un factor que contribuye a los resultados del ensayo de baja calidad. Típicamente, se requiere 200 ng de ADN, aunque esta cantidad puede variar para algunos tipos de chips. Un robot de manejo de líquidos Tecan puede automatizar muchas de las etapas del protocolo y minimizar el error humano como factor.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Consumible o equipo</fuerte</td><td>><fuerte>Fabricante</fuerte</td><td>><fuerte>Número de pieza</fuerte></td><td><fuerte>Mínimo requerido para 96 muestras</fuerte></td></tr><tr><td>0,8 ml Placa de pocillo profundo</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0765 1 Plancha Thermo Scientific AB-0674</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>2</td></tr><tr><td>Cuenca de reactivos</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-502</td><td>9</td></tr><tr><td>Hojas termoselladas</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0559</td><td>1</td></tr><tr><td>Espaciador de flujo</td><td>continuo Fisher Scientific</td><td>NC9563984</td><td>6</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta - 200 &mu; l</td><td>Rainin</td><td>GP-L200F</td><td>192</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta - 10 &mu; l</td><td>Rainin</td><td>GP-L10F</td><td>16</td></tr><tr><td>puntas de pipeta - 1.000 &mu; l</td><td>Rainin</td><td>GP-L1000F</td><td>16</td></tr><tr><td>Tampón de suspensión de ADN</td><td>Teknova</td><td>T0220</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>0,1 N NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12419-0010</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>Isopropanol (grado HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Etanol (200 grados)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>330 ml</td></tr><tr><td>Formamida (100%)</td><td>Thomas Scientific</td><td>C001K38</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>Amresco</td><td>E177</td><td>0,2 ml</td></tr><tr><td>10 &mu; l Pipeta de 8 canales</td><td>Rainin</td><td>L8-10XLS</td><td>1</td></tr><tr><td>200 &mu; l Pipeta de 8 canales</td><td>Rainin</td><td>L8-200XLS</td><td>2</td></tr><tr><td>1.000 &mu; l Pipeta monocanal</td><td>Rainin</td><td>L-1000XLS</td><td>1</td></tr><tr><td>Agitador de microplacas</td><td>VWR</td><td>13500-890</td><td>1</td></tr><tr><td>Centrífuga de microplacas refrigerada</td><td>VWR</td><td>BK369434</td><td>1</td></tr><tr><td>Horno de hibridación</td><td>Illumina</td><td>SE-901-1001</td><td>1</td></tr><tr><td>Incubadora de micromuestras Hybex</td><td>SciGene</td><td>1057-30-0</td><td>1</td></tr><tr><td>Inserto</td> <td>de bloque de calor Hybex MIDIIllumina</td><td>BD-60-601</td><td>1</td></tr><tr><td>Termosellador</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0384</td><td>1</td></tr><tr><td>Cámara Hyb con inserto y tapete</td><td>Illumina</td><td>BD-60-402</td><td>2</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-804-20</td><td>1</td></tr><tr><td>Flujo a través de piezas de ensamblaje</td><td>Illumina</td><td>WG-10-202</td><td>8</td></tr><tr><td>Rejilla de lavado y plato</td><td>Illumina</td><td>BD-60-450</td><td>1</td></tr>Portaplatos y gradilla de <tr><td>cámara Genepaint</td><td>Tecan</td><td>760-800</td><td>1</td></tr><tr><td>Sonda de temperatura</td><td>Illumina</td><td>A1-99-109</td><td>1</td></tr><tr><td>Gradilla de tinción y plato</td><td>Illumina</td><td>WG-10-207</td><td>1</td></tr><tr><td>Pinzas de cierre automático</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>5374-NM</td><td>1</td></tr><tr><td>Colector de vacío</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>2240</td><td>1</td></tr><tr><td>iScan o HiScan</td><td>illumina</td><td>- </td><td>1</td></tr></tbody></table>

ensayo infinium para aplicaciones a gran escala de genotipado de snp

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Variantes de genotipado en el genoma humano ha demostrado ser un método eficaz para identificar asociaciones genéticas con fenotipos. La distribución de las variantes dentro de las familias o de las poblaciones puede facilitar la identificación de los factores genéticos de la enfermedad. Panel de Illumina de BeadChips genotipado permite a los investigadores determinar el genotipo de miles o millones de polimorfismos de nucleótido único (SNP) o para analizar otras variantes genómicas, como el número de copias, a través de un gran número de muestras de ADN. Estos SNPs se pueden propagar por todo el genoma o dirigidos en regiones específicas con el fin de maximizar el potencial descubrimiento. La prueba Infinium ha sido optimizado para producir alta calidad, resultados precisos de forma rápida. Con una configuración adecuada, un solo técnico puede procesar desde unos pocos cientos a más de mil muestras de ADN por semana, dependiendo del tipo de matriz. Este ensayo guía a los usuarios a través de cada paso, empezando con ADN genómico y terminando con el escaneo de la matriz. Usando Reage decoronts, ​​las muestras se amplifican, fragmentada, se precipitó, se resuspendió, se hibrida con el chip, prorrogado por una sola base, manchado, y escaneado a cada una de alta resolución del sistema óptico de imagen iScan o Hi Scan. Se requiere un paso durante la noche para amplificar el ADN. El ADN se desnaturaliza y isotérmicamente amplificado por amplificación de todo el genoma, por lo tanto, no se requiere la PCR. Las muestras se hibridan con las matrices durante una segunda etapa durante la noche. Por el tercer día, las muestras están listas para ser escaneado y analizado. El ADN amplificado puede ser almacenada en grandes cantidades, lo que permite matrices de perlas que se procesen todos los días de la semana, maximizando así el rendimiento.

Un chip de grano procesado correctamente, debe aparecer intensidades de luz láser de color rojo y de color verde brillante y distintas durante la exploración. En la figura 6, el software de exploración iScan muestra una muestra de ADN genómico estándar hibridado con éxito a una costumbre-panel de agrupación en el genotipado de SNP. Los nucleótidos marcados que fueron colocados durante las etapas de extensión y tinción fluorescente bajo las luces de los dos láseres. Como estos nucleótidos se extienden selectivamente la cadena de oligonucleótido de la perla hibridado a la cadena de ADN fragmentado, y como las cadenas de oligonucleótidos están diseñados para terminar en el sitio de la variante, el color y la intensidad de la señal resultante se puede utilizar para determinar los alelos presentes en la SNP sitio. Una hoja generado por los usuarios de la muestra, que coincide con los ID de las muestras y la información clínica a ChipID y la posición, y un SNP manifiesto específica de la matriz, que se obtiene directamente de la compañía, son necesarios para poder importar el scaarchivos de salida Nner en el software de análisis GenomeStudio. Hojas Ejemplo de muestra se pueden encontrar en el sitio web de la compañía. Una vez que el proyecto GenomeStudio está construido, los genotipos se pueden obtener a partir de los grupos de intensidad resultantes generados automáticamente por el software. Aunque existen múltiples opciones de visualización, la vista predeterminada, Norm-R (un valor de intensidad normalizada) vs Norma-Theta (una relación de intensidad alélica), es a menudo el argumento más fácil de diferenciar tres grupos distintos. La mayoría de los SNPs deben mostrar uno, dos, o tres grupos, dependiendo de la frecuencia del alelo menor. Los tres grupos representan muestras que demuestran AA, AB, BB o alelos (véase la Figura 7). Estos grupos se pueden asignar genotipos, ya sea mediante la importación de una plantilla de la posición estándar de la agrupación directamente de la empresa, mediante la selección de &quot;Cluster Todos SNPs&quot; de la barra de herramientas de análisis del software, o haciendo clic y arrastrando los círculos de colores en las parcelas intensidad para edi manualmente<html> t llama. El color de la muestra en el gráfico de intensidad (rojo, púrpura o azul) indica que la llamada (AA, AB, BB o, respectivamente); negro indica que no hay llamada. Al desplazarse por los SNPs que figuran en el panel de datos completa del software, la agrupación para cada SNP puede ser visto o recordado. Una vez que los grupos se asignan las llamadas satisfactorias, el panel de datos completa del software enumera los genotipos para cada muestra individual en cada SNP particular. La opción Selector de columnas por encima de la tabla puede cambiar los formatos de datos. Los datos pueden ser exportados, ya sea a través de la barra de herramientas de análisis o directamente de la tabla completa de datos para un análisis en profundidad. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. Información general - Protocolo de ensayo Infinium.683/50683fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver la imagen más grande. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Complete Chamber Hyb base y colchón, y tapa. [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3.jpg" width="600px" /> Figura 3 Carga de un BeadChip -.. Dispense la muestra en los puertos de entrada [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande</a><html> imagen. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4 Extracción de la BeadChip Coverseal -.. Sujete el sello en la esquina y quitar con cuidado en diagonal [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5.jpg" width="600px" /> Figura 5. Conjunto completo BeadChip Flow-through - El BeadChip se separa de un portaobjetos de vidrio con un espaciador y ató con broches.&gt; Haga clic aquí para ver la imagen más grande. <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6.jpg" width="600px" /> Figura 6. Exitosa BeadChip Scan - A) El BeadChip se escanea con tanto un láser rojo y verde, el software de escaneo muestra tanto de forma simultánea. Secciones pasan QC intensidad destacarán verde en la pantalla BeadChip a la izquierda. Secciones defecto QC intensidad se destacan rojo en la pantalla BeadChip. B) Una vez finalizado el escaneo, el software se superpondrá a las pantallas de color rojo y verde. Se muestra una imagen con zoom-in. El color y la intensidad de cada grano individual indica el alelo presente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.wipáginas delgado = &quot;always&quot;&gt; <img alt="La figura 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7.jpg" width="500px" /> Figura 7. SNP NORMA-R vs Perfiles del clúster NORM-THETA - A) Un SNP es válido con tres grupos distintos que representan a AA, AB, BB y genotipos, de color rojo, púrpura y azul B) Una edición que requiere SNP.. El grupo medio, que debe ser homocigotos AB, se deja llamado-un. El cluster BB está equivocadamente llamado AB. C) Una de bajo rendimiento SNP. No hay genotipos se pueden obtener de esta parcela intensidad, ya que no existen grupos distintos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> .

Un protocolo se describe que utiliza ensayos Infinium de Illumina para llevar a cabo la genotipificación a gran escala. Estos ensayos pueden determinar el genotipo de forma fiable a millones de SNPs a través de cientos de muestras de ADN individuales en tres días. Una vez generada, estos genotipos se pueden utilizar para comprobar las asociaciones con una variedad de diferentes enfermedades o fenotipos.

Ensayo Infinium para aplicaciones a gran escala de genotipado de SNP

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar con éxito el ensayo Infinium para procesar un chip de perlas de genotipificación. Esto se logra primero amplificando, fragmentando y aislado el ADN. El segundo paso consiste en hibridar la cadena de ADN desnaturalizado con oligonucleótidos unidos a perlas en la matriz.A continuación, el oligonucleótido unido al gránulo se tiñe y se extiende selectivamente con una base. El paso final consiste en escanear las matrices de gránulos para detectar el nucleótido marcado. En última instancia, los resultados de genotipificación se utilizan para determinar los alelos presentes en el sitio de interés.La demostración visual de este método es fundamental porque muchos de los pasos para la tinción y carga de las placas para abejas son difíciles de aprender. Muchas de las maniobras no se encuentran en otros métodos de genotipificación y muchos de los equipos tienen nombres muy similares. Un día antes de la amplificación, prepare la dispensación de ADN colocando 200 nanogramos de ADN por pocillo en una placa de 96 muestras con pocillos profundos.Debe sembrarse al menos 96 muestras para asegurar que ningún reactivo se desperdicie. Etiquete la placa con una etiqueta de código de barras suministrada por el kit y centrifúguela para normalizar los volúmenes. Deje las muestras en un cajón o campana extractora durante la noche para que el líquido se evapore.Cubra la placa de forma suelta con una tapa o una toalla de papel para evitar el polvo a la mañana siguiente. Verifique que los pocillos estén secos y utilice una cubeta de reactivo y una pipeta multicanal de 10 microlitros para dispensar cuatro microlitros de tampón de resuspensión de ADN en cada pocillo, con el fin de rehidratar las muestras. Si se tiene cuidado de no tocar el líquido, no es necesario desechar las puntas de pipeta entre cada columna.A continuación, dispense 20 microlitros del reactivo MA uno en cada pocillo de la placa utilizando una pipeta de ocho canales y una cubeta de reactivo nueva. Cubra la placa con un sello reutilizable, haga una centrifugación breve y vortexee durante un minuto a 1600 RPM en un agitador para microplacas e incube a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Los pasos restantes para la amplificación no se mostrarán en este video, pero el protocolo puede encontrarse en el manuscrito adjunto.Después de haber agregado todos los reactivos, coloque la placa en un horno debidamente calibrado ajustado a 37 grados Celsius durante 20 a 24 horas. Tras la amplificación, las muestras de ADN se fragmentan y precipitan según se describe en el manuscrito tras la precipitación en una centrífuga de alta velocidad. Inspeccione la parte inferior de la placa sin invertirla.Para confirmar que las muestras se han precipitado en un pellet azul, deseche la tapa y elimine rápidamente el líquido invirtiendo la placa y golpeándola con fuerza sobre la superficie de la mesa cubierta con toallas de papel. Una vez que la placa esté invertida, tenga cuidado de no volverla a su posición original. Mientras quede líquido, golpee repetidamente la placa contra la superficie de la mesa hasta que todo el líquido haya sido eliminado.Coloque la placa boca abajo sobre un soporte para tubos de ensayo para incubarla a temperatura ambiente durante una hora. Posteriormente, el ADN se resuspende para iniciar el procedimiento de hibridación. Coloque una placa de 96 pocillos que contenga ADN resuspendido en un bloque térmico a 95 grados Celsius durante 20 minutos.Para desnaturalizar el ADN después de 20 minutos, retire la placa de muestras del bloque térmico e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mientras la placa de muestras se enfría, prepare la cámara de colmena. Se necesitará una cámara por cada cuatro chips de abejas procesados. Coloque una alfombrilla de goma sobre la parte superior de la base de la cámara de colmena, alineando el orificio más grueso con el frente de la base.El símbolo de código de barras grabado en la base debe seguir siendo visible. Con una pipeta de 1000 microlitros, distribuya 400 microlitres del reactivo PB dos en cada uno de los ocho reservorios humidificadores tallados en la base. Coloque la tapa de la cámara hi sobre la base y sujete ambos extremos colocando dos cierres en lados diagonalmente opuestos.Primero, coloque cuatro insertos de cámara Hi sobre el banco para cada cámara Hi utilizada justo antes de completar los 30 minutos. Enfriar. Abrir los paquetes de chips de perlas plateadas.Retire los chips de sus fundas de plástico transparente sin tocar las perlas. Coloque cada chip de abeja en un inserto de cámara alta. Oriente el código de barras del chip con el símbolo de código de barras grabado en la superficie superior del inserto.El siguiente paso, que consiste en la carga de los chips para abejas, puede ser el paso más crítico del protocolo. Para realizarlo correctamente, es necesario visualizar de antemano la transferencia de la muestra desde la placa de ADN al chip para abejas. Retire y deseche la tapa de la placa de muestras. Puede utilizarse una pipeta multicanal para dispensar líquido sobre los chips, pero se debe planificar cuidadosamente aspirar únicamente el número de muestras que puedan colocarse de forma segura en el chip para abejas, ya que el número de filas en una placa no siempre coincide con el número de filas en un chip.Tome 15 microlitros de muestra de la placa de muestra y dispense lentamente en la entrada del arreglo. Se debe tener un cuidado extraordinario para colocar la muestra correcta en el chip de abeja correcto, en la posición que coincida con el chip de perlas, según el orden registrado anteriormente.Abrir la cámara hi y colocar las inserciones sobre los depósitos humidificadores. El código de barras del chip debe colocarse sobre el grabado del código de barras en la base de la cámara hive. Volver a colocar la tapa de la cámara hive y cerrar los cuatro cierres cerrando los cierres en lados diagonalmente opuestos.Primero, incubar la cámara hi en un horno a 48 grados Celsius durante 16 a 24 horas. Al finalizar la hibridación, retirar las cámaras hi del horno y incubarlas a temperatura ambiente durante 25 minutos para que se enfríen. Cuando las cámaras hi se hayan enfriado, abrir una cámara hi. Retirar el sello de cobertura de un chip bee sujetando el sello por una esquina y despegándolo suavemente en diagonal.Una vez retirado el sello, coloque inmediatamente el chip sobre una bandeja de chips para abejas y sumérjalo en PB1 sin tocar los gránulos. Repita hasta que la bandeja esté llena de chips con gránulos, teniendo cuidado de que ningún chip se seque.Agite suavemente la bandeja para eliminar cualquier burbuja y deje los trozos sumergidos durante un minuto. Agite la bandeja nuevamente. Transfiera la bandeja con los trozos de abeja a un segundo recipiente de lavado lleno con PB.One, agite suavemente y deje reposar enjabonando durante un minuto.Luego agite nuevamente en el flujo líquido a través de la estación de ensamblaje. Coloque cuatro soportes plásticos negros de paso en las ranuras. Llene la estación con PB uno hasta que el líquido alcance casi la altura de los ocho soportes de ensamblaje, uno a la vez.Retire los chips de perlas de la bandeja y colóquelos en la estación de ensamblaje sobre una sujeción plástica de flujo continuo; el código de barras del chip debe alinearse por encima del símbolo de código de barras grabado en la estación de ensamblaje. Una vez que haya cuatro chips en la estación de ensamblaje, coloque un separador plástico transparente encima de cada chip de perlas. Los bordes externos del separador deben rodear los soportes dentro de la estación de ensamblaje.Coloque la barra de ensamblaje de plástico en la estación de ensamblaje ajustándola sobre las ranuras. Coloque suavemente una portaobjetos de vidrio encima del espaciador de plástico empujando el extremo trasero del portaobjetos contra la barra de ensamblaje y bajando lentamente el frente hacia el líquido. La ranura en la parte superior del portaobjetos debe orientarse hacia abajo, directamente encima del código de barras del chip, dejando un espacio entre el chip de abeja y el portaobjetos en el extremo del código de barras.Después de verificar que no hay burbujas entre el chip y la diapositiva, coloque dos abrazaderas metálicas alrededor del vidrio. Deslice una hacia el extremo del código de barras y otra hacia la parte trasera. Los bordes de las abrazaderas de plástico deben sujetar la brida de flujo de plástico situada debajo del chip.Este gráfico muestra un diagrama completo de ensamblaje de flujo continuo. Una vez que todas las perlas estén en sus ensamblajes de flujo continuo, tome un par de tijeras quirúrgicas y corte ambos extremos del espaciador lo más cerca posible del portaobjetos de vidrio. Una vez que el soporte de la cámara esté a 44 grados, comience este procedimiento colocando un ensamblaje de flujo continuo del chip de abeja en el soporte de la cámara, deslizando el ensamblaje hacia abajo y enganchando el soporte en la parte superior. El lado posterior del chip de abeja debe estar en contacto con el soporte de la cámara.La portaobjetos de vidrio debe quedar orientada hacia afuera con la ranura en la parte superior para formar un depósito de reactivo. Una vez que todos los ensamblajes del chip para abejas se hayan colocado en el soporte de la cámara, utilice una pipeta de 200 microlitros para añadir 150 microlitros del reactivo RA uno a los ensamblajes de flujo continuo. Al dispensar el líquido en el depósito de vidrio, el reactivo fluirá naturalmente hacia abajo por la portaobjetos y saldrá por la base del ensamblaje, permitiendo que los reactivos posteriores se coloquen directamente en el depósito.No se mostrarán los pasos restantes para la tinción de una extensión. Consulte el protocolo en el manuscrito adjunto al finalizar la tinción y la extensión. Desarme el ensamblaje de flujo mediante la inserción de una barra metálica delgada entre los cierres y el soporte.Luego, gire. Aparte la portaobjetos y retire inmediatamente el chip de abeja, coloque un chip de abeja en una bandeja vertical para chips de abeja y sumérjalo en PB1, repita este procedimiento para cada ensamblaje de flujo continuo. Tenga cuidado de orientar cada chip de abeja en la misma dirección y minimice su exposición al aire.Posteriormente, complete este procedimiento. Según el protocolo en el texto adjunto, un chip de abeja procesado adecuadamente debe mostrar intensidades brillantes y bien definidas de luz láser roja y verde al ser escaneado, ya que los nucleótidos marcados que se unieron durante las etapas de extensión y tinción fluorescerán bajo las luces de los dos láseres. Aquí se muestra una muestra estándar de ADN genómico hibridada con éxito a secciones de una matriz personalizada de genotipificación de SNP que cumplen con la intensidad.El control de calidad mostrará en verde en la pantalla del chip de abeja las secciones izquierdas. Intensidad deficiente. El control de calidad mostrará en rojo en la pantalla del chip de abeja.Una vez finalizado el escaneo, se superpondrán las visualizaciones roja y verde. Se muestra aquí una imagen ampliada, ya que estos nucleótidos extienden selectivamente la cadena de oligonucleótidos de las perlas hibridizadas al fragmento de ADN. Y dado que las cadenas de nucleótidos están diseñadas para terminar en el sitio de la variante, el color y la intensidad de la señal resultante pueden utilizarse para determinar los alelos presentes en el sitio del SNP.Los archivos de salida del escáner se importan al software de análisis Genome Studio, que genera perfiles de agrupamiento. Este es un ejemplo de un SNP válido con tres agrupamientos distintos que representan los genotipos aa, A, B y B, B, coloreados en rojo, morado y azul respectivamente. Este gráfico de intensidad muestra el SNP que requirió editar el agrupamiento central negro, que debería ser homocigoto.AB queda sin llamar. El grupo BB se llama erróneamente ab. El último gráfico de intensidad muestra un SNP con bajo rendimiento.No se pueden obtener genotipos a partir de este gráfico de intensidad, ya que no existen grupos distintos. Al realizar este procedimiento, es importante recordar procesar rápidamente las chips de abeja. No las exponga al aire durante períodos prolongados de tiempo.

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Biología

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