Name: Un In-vitro Preparación de las neuronas entéricas aisladas y células gliales del plexo mientérico del ratón adulto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Aprende a aislar neuronas y células gliales del plexo mientérico de ratón adulto mediante digestión enzimática y cultivo celular. Este método permite estudiar electrofisiología, inmunocitoquímica y PCR de célula única.

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Instituto Nacional de Salud Subvención DA024009, DK046367 y T32DA007027.

Todo el cuidado de los animales y los procedimientos experimentales se ajustaron y aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad de Virginia Commonwealth. 1. Preparación de cubreobjetos de vidrio estériles de poli-D-lisina y laminina revestida en placas de 24 pocillos <ol><li> Todos los procedimientos para el paso 1 se llevan a cabo en condiciones estériles; debajo de una campana, y con reactivos estériles. Cubreobjetos de vidrio y agua desionizada doble (ddH 2 O) deben ser esterilizados de antemano. Preparación de las placas puede hacerse hasta dos semanas antes del aislamiento neurona. </li><li> Bajo el capó, use pinzas estériles para colocar cubreobjetos de vidrio esterilizados en autoclave de 12 pocillos de una placa de 24 pocillos. </li><li> Prepare Stock poli-D-lisina antes de tiempo. Añadir 50 ml de ddH2O estéril a 5 mg de poli-D-lisina. Mezclar y almacenar en 3 ml alícuotas a -20 ° C. Descongele alícuotas antes de su uso. </li><li> Para obtener una concentración final de 1 ml de caldo de poli-D-lisina por 25 cm 2: pipeta de 80 lde stock poli-D-lisina en la parte superior de cada cubreobjetos de vidrio (2 cm 2). Deje que la solución reposar durante 10 min. </li><li> Retire poli-D-lisina de vacío y enjuague utilizando cubreobjetos de 3x con estéril ddH 2 O. </li><li> Permitir que las placas se sequen durante al menos 2 horas bajo el capó. </li><li> Las placas pueden ser almacenadas a 4 ° C o - 20 ° C antes de proceder al recubrimiento laminina. </li><li> Prepare Stock laminina antes de tiempo. Descongele laminina en hielo y mantener en hielo durante el uso. Diluir a una concentración de 50 g / ml; prestar atención a concentración mucho; cada lote será diferente. Dependiendo de la concentración mucho, se añadieron aproximadamente 20 ml de ddH 2 O a cada vial de laminina. Alícuota (5 ml) y se almacena a -80 ° C. Descongele alícuotas en hielo antes de su uso. </li><li> Cubreobjetos Abrigo con 5 mg / cm 2 laminina; Añadir 200 L de stock laminina en cada portaobjetos. </li><li> Incubar solución de laminina en cubreobjetos durante 1 hora. </li><li> Aspirar solución de laminina restante y enjuagar una vez con cubreobjetosddH 2 O. Evite raspar la superficie del cubreobjetos. </li><li> Placas se almacenan a 4 ° C durante un máximo de dos semanas. </li></ol> 2. Una preparación previa de la neurona Aislamiento Solutions <ol><li> Prepare una solución de Krebs (en mM: 118 NaCl, 4,6 KCl, 1,3 NaH 2 PO 4, 1,2 MgSO4, 25 NaHCO 3, 11 glucosa y 2,5 CaCl2). Place 13,79 g NaCl (FW 58,44), 0,686 g KCl (FW 74,55), 0,312 g NaH 2 PO 4 (FW 120), 0,289 g MgSO4 (FW 120,4), 4,20 g de NaHCO3 (FW 84,01), 3,96 g de glucosa (FW 180,2) y 0.555 g de CaCl2 (FW 111) en 2 l ddH 2 0. Enfriar a 4 ° C. </li><li> Preparar enjuague medios (medio F12 con suero bovino fetal al 10% (FBS) y antibiótico / antimicótico): A una botella ml de medio F12 500, añadir 50 ml de FBS y 5 ml de líquido 100x de antibiótico / antimicótico (Gibco). </li><li> Preparar los medios de comunicación neurona entérica (Neurobasal A los medios de comunicación con B-27, 2 mM de L-glutamina, 1% de FBS, 10 ng / ml, Neurotr derivado de la glíaFactor de ophic (GDNF), y de antibiótico / antimicótico líquido 100x). Para hacer un caldo GDNF, añadir 1 ml ddH2O GDNF a 10 mg y congelar de nuevo en 50 alícuotas, almacenar a -80 ° C. Para un ml frasco de medios de comunicación neurona completos 50, combinar ml Unos medios de comunicación 47.5 Neurobasal, 1 ml de B-27 (50x), 500 l de FBS, 500 mM de L-glutamina (Gibco) 50 de stock GDNF l l, 200 y 500 l antibióticos / Liquid 100x antimicótico. Los medios de comunicación se hace en pequeños lotes de 50 ml para garantizar la frescura de GDNF y para evitar la contaminación de grandes cantidades de esta mezcla de medios de comunicación celular caro. </li></ol> 3. Harvest Longitudinal Plexus (LMMP) Preparación del músculo / mientérico de ratones <ol><li> Éticos nacionales e institucionales apropiadas deben estar en su lugar antes de realizar experimentos con animales. Adultos ratones Swiss Webster que pesan más de 25 g (generalmente más de 8 semanas de edad) se encuentran en grupos de 6 antes de los experimentos. Los tejidos de dos ratones se utilizan para el aislamiento de las neuronas y células gliales entéricas ileales y tres ratones se utilizan paraaislamiento de las células del colon. </li><li> Prepare el área quirúrgica. Reunir pequeñas tijeras quirúrgicas, pinzas anguladas, hisopos de algodón, tres vasos de vidrio de 200 ml, y una varilla de vidrio / plástico (pincel). Asegúrese que todos los materiales son lavados y enjuagados antes de su uso para minimizar la contaminación de fondo. Este paso puede realizarse el día antes del experimento. </li><li> Coloque solución de Krebs en hielo y la burbuja con carbógeno (95% de oxígeno, 5% de CO 2) durante al menos 30 minutos para estabilizar el pH. </li><li> Encienda diversos equipos y los productos químicos calientes para estabilizar a temperaturas deseadas; baño de agua de calor (s) a 37 ° C, centrífuga fresco a 4 ° C, lugar de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y 0,5% de tripsina en baño de agua (37 ° C ). Medios de neuronas completas y enjuague medios de comunicación deben permanecer refrigerados. </li><li> Colocar 150 ml helada burbujea Krebs en tres vasos de vidrio de 200 ml etiquetados &#39;sucia&#39;, &#39;limpio&#39;, y &#39;LMMP&#39;. Vaso de burbuja etiqueta &#39;LMMP&#39; con carbógeno. </li><li> Tras la aprobación del comité de ética, la eutanasia mouse por dislocación cervical o la asfixia de CO 2. </li><li> Coloque el ratón en decúbito dorsal en la superficie quirúrgica, la piel limpia con un 70% EtOH, y levantar la piel del abdomen con unas pinzas. Con unas tijeras, la cavidad abdominal abierta y revelar órganos digestivos internos. </li><li> Retire la longitud del tracto gastrointestinal mediante el levantamiento de una sección de íleon y revelando su mesenterio. Snip través mesenterio con tijeras para quitar suavemente y desentrañar íleon y colon, con cuidado de no tirar de mesenterio del íleon / colon. </li><li> Después de que se descubrió la longitud completa del intestino grueso, eliminar el íleon cortando a través del intestino distal al estómago y proximal al intestino ciego Nota:. Este procedimiento también se puede realizar con el tejido del colon mediante la eliminación de los dos puntos de distal a la proximal al ciego hasta el ano. </li><li> Los tejidos se pueden dividir entre colon proximal y distal, y yeyuno, e íleon. El resto de este procedimiento se referirá al aislamiento del íleon; tque procedimiento es el mismo para el aislamiento de LMMP de colon. Coloque todo el íleon en un recipiente de vidrio con helado Krebs marcado &quot;sucio&quot;. </li><li> Crear una herramienta para limpiar el íleon; contundente una gran aguja de calibre 20 con una piedra de archivo y adjuntarlo a una jeringa grande (10 ml) que contiene helado Krebs. </li><li> Limpiar la materia fecal desde el íleon mediante el seccionamiento del íleon en tres o más piezas de gran tamaño. Eliminar una sección ileal del vaso de precipitados y colocar la aguja roma en el extremo de una pieza ileal. </li><li> Pase suavemente Krebs a través de la sección de intestino hasta que toda la materia fecal se elimina en un contenedor de residuos por separado. Coloque la sección de limpieza en el recipiente de Krebs marcada &quot;limpia&quot;. Repita hasta que se limpie toda íleon. </li><li> Para quitar el LMMP, corte el íleon en pequeños segmentos, aproximadamente 2-4 cm. Coloque un segmento de íleon en un plástico o varilla de vidrio; íleon debe encajar cómodamente, pero no estar suelto o tenso (~ 2 mm). Comienza la retirada del LMMP suavemente quitando trozos de mesenterio todavía adjuntared en el tracto gastrointestinal (GI) usando un fórceps. Evitar que el tracto GI de girar alrededor de la varilla por el fijar suavemente el tubo para la varilla con el pulgar. </li><li> Separar la LMMP del músculo circular subyacente; primera frotar suavemente el borde de las pinzas a lo largo de toda la línea donde se conecta el mesenterio, desde la parte superior a la parte inferior del segmento, creando suavemente un vacío en el músculo longitudinal. A continuación, se burlan suavemente el músculo longitudinal con un bastoncillo de algodón humedecido con Krebs. </li><li> Comience en la parte superior de la brecha en el músculo longitudinal y se burlan de distancia usando el trazo horizontal ligero mientras se aplica una presión muy ligera hasta que el músculo longitudinal empiece a separarse del músculo circular, hacer esto por toda la franja a lo largo del punto de fijación mesenterio. </li><li> Entonces comienzan suavemente para evitar el tubo gastrointestinal, moviéndose de arriba a abajo y de atrás como el músculo longitudinal se separa lentamente del músculo circular todo el camino alrededor del tubo. Cuando esté completo, elLMMP forma natural desprenderse del resto del tubo digestivo. </li><li> Coloque la tira fina resultante de músculo longitudinal en el vaso de precipitados con la indicación «LMMP &#39;. Repita este procedimiento para todos los segmentos. </li><li> Después de todas las franjas de LMMP presentadas proceden de un ratón, repita el procedimiento con los otros ratones que se utilizan. Enjuague los vasos &#39;sucias&#39; y &#39;limpio&#39; antes de volver a usarla. </li><li> Enjuague el LMMP 3x para eliminar la contaminación biológica. Llenar tres 2 ml tubos Eppendorf con helada Krebs. Coloque las tiras LMMP en el primer tubo y girar durante 30 segundos a 356 xg en una centrífuga enfriada a 4 ° C. Retirar con cuidado el sobrenadante con una pipeta y mover las tiras a LMMP siguiente tubo lleno de Krebs limpio. Repita este procedimiento para cada tubo restante. </li></ol> 4. Resumen LMMP <ol><li> Preparar la solución de la digestión mediante la colocación de 13 mg de colagenasa de tipo 2 y 3 mg de BSA en 10 ml de solución de Krebs-burbujeó carbógeno. </li><li> Coloque los segmentos de LMMP enjuagado en solución de digestión y uso LICsores para cortar LMMP en pequeños pedazos. </li><li> Resumen LMMP durante 60 min a 37 ° C en baño de agua con agitador mientras se burbujeaba suavemente con carbógeno. </li><li> Después de la digestión es completa, recoger las células por centrifugación durante 8 minutos a 356 xg en centrífuga enfriada a 4 ° C. </li><li> De aquí en adelante todos los procedimientos deben realizarse en condiciones estériles en una campana de cultivo celular! Todos los reactivos y los contenedores deberán ser esterilizados antes de su uso. </li><li> Durante la centrifugación, preparar una solución de tripsina 0,05% mediante la colocación de 1 ml calentó 0,25% de tripsina y 4 ml de HBSS calentado en un tubo de ml de cultivo celular estéril 50. </li><li> Después de la centrifugación, extraer y desechar el sobrenadante. No utilice una aspiradora, lo que probablemente va a chupar el pellet celular debido a la baja velocidad de centrifugación. Retire cuidadosamente el sedimento celular y el lugar en el tubo limpio con 5 ml de solución de tripsina 0,05%. </li><li> Digerir las células en solución de tripsina 0,05% en baño de agua a 37 ° C con agitación durante 7 min. No exceda 7 min del tratamiento total de tripsina o neuronas perecerá. </li><li> Neutralizar la tripsina con 10 ml de enjuague medios fríos después de 7 min de tratamiento con tripsina. </li><li> Centrifugar las células durante 8 min a 356 x g. Retire y deseche los medios de comunicación. </li><li> Durante la centrifugación, equilibrar una sección de malla Nitex esterilizado en la parte superior de un tubo de 15 ml de cultivo celular estéril. </li><li> Después de la centrifugación, extraer y desechar el sobrenadante. Suavemente mezcla de células se resuspende por trituración en ml de medio de neuronas completos 3. Evitar la generación de burbujas de aire durante esta etapa y todos los pasos futuros en los que se tritura mezcla de células. Todas las trituraciones se debe hacer con mucho cuidado. Filtrar a través de solución de células Nitex de malla limpia en 15 ml de tubo de cultivo de células. </li><li> Opcional: tubo de cultivo de células de Cap y el lugar en el mezclador de Hula refrigerado (o cualquier mezclador que proporciona una rotación) con el balanceo y la inclinación suave durante 30 min. Este paso es opcional pero recomendado. </li><li> Opcional: Después de mezclador de Hula, añadir 2 ml de enjuague medios fría para lavar las células. </li><li> Reunir las células por centrifugación (8 min, 356 xg). Quitar y desechar el sobrenadante. </li><li> Resuspender las células en los medios de comunicación 1200 neurona completos l. Triturar las células utilizando suavemente 1 ml de plástico punta de la pipeta. No generar burbujas de aire. Pipetear lenta y suavemente hasta que la mayoría de los bloques se dividen y las células se suspenden en líquido. </li><li> Añadir 750 l de medio completo a cada uno de los 12 pocillos que contenían un cubreobjetos de vidrio pre-recubiertas y añadir 100 ml de la solución de células triturado. </li><li> Incubar las neuronas en cultivo celular incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> Cambie la mitad de los medios celulares cada 2 días. </li><li> Las neuronas son listos para las grabaciones electrofisiológicas después de 1 - 2 días en cultivo. </li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no existen intereses importantes en conflicto.

Animales utilizados
Este protocolo ha sido optimizado para ratones Swiss Webster. Sin embargo, este método es fácilmente adaptable a otros mamíferos de pequeño tamaño como ratas y a otras cepas de ratones. Hemos realizado con éxito aislamientos preliminares con ratones C57 y knock-outs de receptores opioides μ. Sin embargo, también es posible que otras cepas de ratones puedan ser problemáticas debido a variaciones morfológicas en el tracto gastrointestinal. Además, existen diferencias conocidas e...

El sistema nervioso entérico (ENS) es vasta red de nervios y glía que recorre toda la longitud del tracto gastrointestinal (GI). La ENS controla funcionalmente todos los aspectos de la digestión, incluyendo el peristaltismo, la absorción / secreción de fluidos, sensación de estímulos, etc (para revisión ver 1). Contiene más de 500 millones de neuronas, más que las encontradas en la médula espinal, y contiene todas las clases neurotransmisor encontrado en el cerebro. Por otra parte, la ENS es única, ya que puede funcionar sin reflejo de entrada desde el sistema nervioso central 2. La comprensión de la ENS es crucial, no sólo para comprender su papel fisiológico normal, pero para comprender su participación en una variedad de neuropatías que pueden ser congénito (enfermedad de Hirschsprung), adquirida (enfermedad de Chagas), secundaria a estados de enfermedad (gastroparesia diabética), drogas inducida (síndrome de intestino narcótico), o debido a una lesión (íleo posoperatorio) 1. Además, las neuronas entéricas pueden ser un reSERVOIR para la infección viral (varicela zoster) 3. Debido a sus similitudes con el cerebro y los altos niveles de serotonina en el intestino, medicamentos destinados a tratar los defectos del sistema nervioso central a menudo tienen efectos secundarios no deseados en la ENS 2. También es digno de mención que muchas neuropatías tales como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson muestran cambios celulares similares en las neuronas entéricas mucho antes de su aparición en las neuronas centrales, por lo que la ENS un modelo accesible para estudiar la patogénesis de estas enfermedades 4. Por lo tanto, un conocimiento profundo de la ENS es una necesidad en la comprensión de los estados de enfermedad y la prevención / la predicción de efectos secundarios farmacológicos. Las neuronas de la ENS se han estudiado tradicionalmente en el conejillo de indias usando preparaciones de wholemount 5-7 o neuronas cultivadas 8. A pesar de la facilidad con la que las neuronas pueden ser estudiados en este gran animal, este modelo tiene muchas limitaciones comofalta de cepas modificadas genéticamente, la falta de reactivos específicos para esta especie, y el alto costo asociado con el pedido y albergar estos temas. El desarrollo de un modelo de sistema nervioso entérico murino tiene la ventaja única de diversos sistemas de golpe hacia fuera, una amplia gama de otras metodologías establecidas que pueden ser utilizados en conjunción con la técnica de cultivo celular, y la capacidad de proporcionar una validación para el modelo de cobaya . La ENS se compone de tres plexi que corren a lo largo del tracto gastrointestinal: el plexo mientérico exterior (entre el músculo longitudinal y circular), que es principalmente responsable de las acciones peristálticos del intestino, así como los plexos submucosa y la mucosa, ( encontrado en y dentro de la mucosa, respectivamente), que controla en gran medida la absorción / secreción de fluido y la detección de los estímulos 1. Este método comienza con el aislamiento de la preparación del plexo muscular / mientérico longitudinal (LMMP) por peladofuera de la capa muscular exterior del tracto GI. Esto reduce drásticamente los problemas de contaminación que surgen cuando la capa de la mucosa está involucrado en el aislamiento. Como resultado, este proceso es ideal para el estudio del control neuronal de la motilidad en lugar de acciones de secreción de la ENS. El método que aquí se presenta resultados en un cultivo mixto de las neuronas y células gliales entéricas. Al menos dos tipos diferentes de neuronas se basan presente en las anteriores observaciones electrofisiológicas y inmunocitoquímico 9. La presencia de la glía es muy ventajoso, ya que no sólo son un importante tipo de células a estudiar en su propio derecho, pero que contribuyen a la supervivencia de las neuronas entéricas 10 y mantener la expresión del receptor nativo en la superficie celular neuronal 11. Por otra parte, las deficiencias de la glía entérica pueden conducir a estados de enfermedad motilidad gastrointestinal anormal, acuñadas 12 &#39;neuro-gliopathies. Por lo tanto, la cultura ENS presenta aquí resultados en varios tipos de células que están maduras para la investigación. Las ventajas de este método son la facilidad de aislamiento, requerimientos de herramientas de bajo costo y muy poco tiempo para dominar la técnica por personal de laboratorio con experiencia. Limitaciones de la metodología incluyen el rendimiento general de la célula baja de volúmenes de los tejidos y la exclusión de las neuronas del plexo ENS mucosa y submucosa. Este procedimiento será muy ventajoso para los estudiosos especializados en electrofisiología, inmunohistoquímica, PCR de una sola célula, y otras metodologías.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Fisherbrand Cubreobjetos para Cubreobjetos de Crecimiento (12 mm de diámetro)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poly-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407- 5 mg</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>placa de cultivo celular de 24 pocillos</td><td>CELLTREAT</td><td>229124</td><td>Puede utilizar cualquier marca</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>BD Biosciences</td><td>354 232</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td>Puede prepararse en el laboratorio&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga estéril de 15 ml</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga estéril de 50 ml</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227261</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-212</td><td>MW 58.44</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-500</td><td>MW 74.55</td></tr><tr><td>NaH2PO4 .2H2O</td><td>Fisher Chemicals</td><td>S369-3</td><td>MW137.99</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td>MW 120.4</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014-5KG</td><td>MW 84.01</td></tr><tr><td>glucosa</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D16-1</td><td>MW 180.16</td></tr><tr><td>CaCl22H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td>MW 147.02</td></tr><tr><td>F12 medios</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino</td><td>Calidad Biológica Inc.</td><td>110-001-101HI</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>Antibiótico/antimicótico 100x líquido</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Neurobasal A media</td><td>Gibco</td><td>10888</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>200 mM de L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Factor Neurotrófico Derivado de Glial (GDNF)</td><td>Neurómica</td><td>PR27022</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tijeras de disección de punta afilada</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>Pinzas de disección para tejidos</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>Aplicadores con punta de algodón</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>250 ml Vaso de precipitados de vidrio graduado</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-100-250</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>2 L Matraz de vidrio Erlenmyer</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-500-2000</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>Varilla de plástico (pincel para niños)</td><td>Crayola</td><td>05 3516</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN 3156</td><td>5% CO2</td></tr><tr><td>10 ml Jeringa Leur-lock</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2 pulg. Aguja hipodérmica</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>Puede utilizar cualquier marca</td></tr><tr><td>de colagenasa tipo 2</td><td>Worthington</td><td>LS004174</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Albúmina Suero Bovino AB00440</td><td>Bioanalítica Americana</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microcentrífuga de 2 ml Tubos Eppendorf</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-864-252</td><td>Puede utilizar cualquier marca</td></tr><tr><td>Nitrex Mesh 500 &micro; M</td><td>Elko Filtering Co</td><td>100560</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>Juego de pipetas</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-377-328</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>Piedra de afilado</td><td>Fisher Scientific NC9681212</td><td></td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>LabGard ES 425 Gabinete de seguridad biológica (campana de cultivo celular)</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-400</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>10 L Baño de agua agitable</td><td>Edvotek</td><td>5027</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>Microcentrífuga 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Puede usar una sola centrífuga más grande con adaptadores de tamaño</td></tr><tr><td>Centrífuga de la serie Allegra 6</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>HuluMixer Sample Mixer</td><td>Invitrogen</td><td>15920D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 con camisa de agua AutoFlow</td><td>Nuiare</td><td>NU-4750</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr><tr><td>Báscula de equilibrio analítico</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS104</td><td>Puede usar cualquier marca</td></tr></tbody></table>

un<em&gt; in-vitro</em&gt; preparación de las neuronas entéricas aisladas y células gliales del plexo mientérico del ratón adulto

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

El sistema nervioso entérico es una vasta red de neuronas y glía que recorren la longitud del tracto gastrointestinal que funcionalmente controla la motilidad gastrointestinal. Se describe un procedimiento para el aislamiento y cultivo de una población mixta de neuronas y células gliales del plexo mientérico. Los cultivos primarios se pueden mantener durante más de 7 días, con conexiones en desarrollo entre las neuronas y la glía. La tira de músculo longitudinal con el adjunto del plexo mientérico se extrae del músculo circular subyacente del íleon o colon del ratón y se sometió a digestión enzimática. En condiciones estériles, la población de neuronas y glía aislado se conservan dentro del sedimento después de la centrifugación y se sembró en cubreobjetos. Dentro de 24 a 48 horas, neuritas se produce y las neuronas se pueden identificar por marcadores pan-neuronal. Después de dos días en cultivo, aisladas neuronas potenciales de acción del fuego como se observa en los estudios de patch clamp. Por otra parte, la glía entérico también puede ser identifdiado por tinción GFAP. Una red de neuronas y células gliales en estrecha aposición se forma dentro de 5 - 7 días. Neuronas entéricas pueden ser individualmente y estudiado directamente utilizando métodos tales como la inmunohistoquímica, la electrofisiología, imágenes de calcio, y la PCR de una sola célula. Por otra parte, este procedimiento se puede realizar en animales modificados genéticamente. Esta metodología es simple de realizar y de bajo costo. En general, este protocolo expone los componentes del sistema nervioso entérico de una manera fácil de manipular por lo que podemos descubrir mejor la funcionalidad de la ENS en estados normales y de enfermedad.

Inmediatamente después del aislamiento de las células derivadas de la capa muscular con plexo mientérico (LMMP), los neuronas y otros tipos celulares no serán fácilmente evidentes. Pueden observarse células vivas de forma redonda con fenotipo indistinto, así como detritos tisulares procedentes de fragmentos de tejido digeridos incompletamente y tejido conectivo. Este material flotante no representa un problema y será eliminado en gran parte con el primer cambio de medio en dos días. No intente limpiar las laminillas ante...

Demostramos un protocolo de cultivo celular para el estudio directo de los componentes neuronales y gliales del sistema nervioso entérico. Se prepara un cultivo mixto de neurona/glía en cubreobjetos a partir del plexo mientérico de un ratón adulto, lo que proporciona la capacidad de examinar la función individual de las neuronas y la glía mediante electrofisiología, inmunohistoquímica, etc.

Un<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparación de las neuronas entéricas aisladas y células gliales del plexo mientérico del ratón adulto

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar neuronas funcionalmente viables y CLIA del plexo mientérico de ratón adulto. Esto se logra primero recubriendo la superficie estéril de cultivo celular con polilisina y laminina. El segundo paso consiste en preparar las soluciones y el área quirúrgica para el aislamiento del plexo mientérico.A continuación, retire el tracto gastrointestinal y aísle la sección deseada para crear una preparación del plexo mientérico del músculo longitudinal. El último paso consiste en digerir secuencialmente el LMMP en colagenasa y tripsina, seguido del sembrado celular en superficies de cultivo celular previamente codificadas. Finalmente, se pueden utilizar electrofisiología, inmunocitoquímica y PCR de célula única para estudiar los efectos de las neuronas entéricas, la glía o la interacción entre estos dos tipos celulares.El procedimiento será demostrado por la Dra. Trisha Har Smith, investigadora postdoctoral en el laboratorio, y la asistirá Joy Gombe, candidata al doctorado en el laboratorio. La principal ventaja de esta técnica frente a las técnicas existentes es que las neuronas y las células gliales provienen del ratón adulto. Esto permite obtener neuronas y células gliales completamente funcionales, que potencialmente pueden provenir de animales genéticamente modificados.Aunque este método puede proporcionar información sobre las propiedades eléctricas de las neuronas, también puede aplicarse a otras metodologías, como inmunocitoquímica, PCR de célula individual e imágenes de calcio en tiempo real. Comience este procedimiento colocando un ratón sacrificado en posición recostada dorsal sobre la superficie quirúrgica.A continuación, limpie la piel abdominal con etanol al 70%. Luego, levántela con un par de pinzas y abra la cavidad abdominal con tijeras para exponer los órganos digestivos internos. Después, levante una sección del íleon para revelar el mesenterio.Retire el tracto gastrointestinal y corte a través del mesenterio con tijeras. Luego, retire suavemente y desenrede el íleon y el colon. Tenga cuidado de no tirar del mesenterio desde el íleon y el colon una vez que el intestino completo haya sido desenredado.Retire el íleon cortando el intestino distal al estómago y proximal al ciego. Este procedimiento también puede realizarse con un tejido colónico retirando el colon desde la parte distal al ciego hasta la parte proximal al ano. A continuación, corte el íleon en tres o más fragmentos grandes.Frote suavemente la solución de Krebs a través del segmento intestinal hasta que toda la materia fecal sea eliminada en un recipiente de desecho aparte. Coloque el segmento limpio en el recipiente de Krebs etiquetado como limpio y repita los procedimientos hasta que todo el íleon esté limpio. Para eliminar el LMMP, corte el íleon en segmentos pequeños de dos a cuatro centímetros.Posteriormente, coloque un segmento de íleon sobre una varilla de plástico o vidrio. El íleon debe ajustarse firmemente, pero sin estar suelto ni tenso. Evite que el tracto gastrointestinal gire alrededor de la varilla fijando suavemente el tubo a la varilla con el pulgar.Luego, retire suavemente con pinzas los restos de mesenterio que aún estén adheridos al tracto gastrointestinal. A continuación, separe la capa muscular longitudinal-mucosa (LMMP) del músculo circular subyacente, frotando primero suavemente el borde de la pinza a lo largo de toda la línea donde estaba adherido el mesenterio, desde la parte superior hasta la inferior del segmento.Posteriormente, cree suavemente una abertura en el músculo longitudinal. Luego, separe con cuidado el músculo longitudinal utilizando un hisopo de algodón empapado con crebs, comenzando por la parte superior de la abertura, con la pasada horizontal más ligera posible y aplicando una presión muy leve hasta que el músculo longitudinal comience a separarse del músculo circular. Realice este procedimiento a lo largo de toda la tira, siguiendo el punto de fijación del mesenterio.A continuación, trabaje suavemente alrededor del tubo GI moviéndose de arriba hacia abajo y viceversa, mientras el músculo longitudinal se separa lentamente del músculo circular alrededor de todo el tubo. Una vez completado, el LMMP se desprenderá naturalmente del tubo GI restante.Luego, coloque la tira delgada resultante de músculo longitudinal en el vaso de precipitados etiquetado como LMMP y repita los procedimientos para todos los segmentos de este procedimiento. Coloque el lavado de los segmentos LMMP en la solución de digestión. A continuación, corte el LMMP en trozos pequeños con tijeras.A continuación, incubar durante 60 minutos en un baño de agua a 37 grados Celsius con agitación, burbujeando suavemente con carbógeno. Una vez finalizada la digestión, recoger las células mediante centrifugación durante ocho minutos a 356 Gs en una centrífuga refrigerada a cuatro grados Celsius.Mientras tanto, prepare una solución de tripsina al 0,05 % en una cabina de cultivo celular añadiendo un mililitro de tripsina al 0,25 % previamente calentada y cuatro mililitros de HBSS calentado en un tubo de cultivo celular estéril de 50 mililitros. Tras la centrifugación, deseche cuidadosamente el sobrenadante, retire el botón celular y colóquelo en un tubo limpio con cinco mililitros de solución de tripsina al 0,05 %. A continuación, realice la digestión celular en la solución de tripsina al 0,05 % en un baño de agua a 37 grados Celsius con agitación durante siete minutos, y neutralice la tripsina con 10 mililitros de medio de lavado frío.Después de siete minutos de tratamiento con tripsina, centrifugue las células durante ocho minutos a 356 gs. Mientras tanto, coloque un trozo esterilizado de malla TX sobre un tubo estéril de cultivo celular de 15 mililitros. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y resuspenda suavemente la mezcla celular agitándola en tres mililitros.Medio completo para neuronas. Todas las alteraciones deben realizarse muy suavemente para evitar la formación de burbujas de aire, luego filtre la solución celular a través de una malla NYX hacia un tubo de cultivo celular limpio de 15 mililitros. Recopile las células mediante centrifugación durante ocho minutos a 356 gs.A continuación, elimine y deseche el sobrenadante. Re suspenda las células en 1200 microlitros de medio neuronal completo. Luego, mezcle suavemente las células utilizando una punta de pipeta plástica de un mililitro.Tenga cuidado de no generar burbujas de aire; pipete lentamente y con suavidad hasta que la mayoría de los fragmentos se hayan desintegrado y las células estén suspendidas en el líquido. Ahora, agregue 750 microlitros del medio completo a cada uno de los 12 pocillos que contienen un cubreobjetos de vidrio con código previo. Luego, agregue 100 microlitros de la solución de células valorada.Incube las neuronas en un incubador de cultivo celular a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono. Cambie la mitad del medio celular cada dos días. Las neuronas están listas para registros electrofisiológicos después de uno a dos días en cultivo.Se muestra aquí la caracterización inmunohistoquímica de neuronas entéricas. Lea aislada del ratón. La microscopía confocal del músculo longitudinal reveló la tinción específica de la beta tres tubulina neuronal en la preparación completa del músculo longitudinal ileal del ratón.Y estas son las células aisladas de las preparaciones de LMMP, que contienen las neuronas que se tiñeron positivamente para calbindina y las células gliales Retin. Las células gliales mostradas aquí se visualizaron con el marcador específico para glia GFAP. Sin embargo, no se observó tinción cuando se omitió el anticuerpo primario. Aquí se muestran las neuronas y las células gliales aisladas del músculo longitudinal de ratón creciendo en estrecha proximidad unas con otras.Las imágenes de microscopía confocal indican que las neuronas verdes y el ggl rojo crecen fácilmente adyacentes entre sí y parecen interactuar in vitro. Esta figura muestra la electrofisiología de las neuronas entéricas cultivadas y de la CLIA en el modo de fijación de corriente. Todas las neuronas mostraron potenciales de acción tras la inyección de corriente.Las CLIA no presentan potenciales de acción, pero muestran grandes potenciales electrotónicos en respuesta a la inyección de corriente. Las neuronas cultivadas del íleon de ratón constituyen una población electrofisiológicamente heterogénea. En el modo de fijación de corriente, la inyección de una corriente de 0,09 nanoamperios en las neuronas provoca potenciales de acción.Las neuronas negativas para HP regresan inmediatamente al potencial de membrana en reposo tras la estimulación. Mientras que las neuronas positivas para HP muestran un AHP tras la estimulación, en el cual el potencial de membrana en reposo cae por debajo de la línea base antes de regresar lentamente al valor inicial. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cuatro horas si se lleva a cabo correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener el material de vidrio y los instrumentos quirúrgicos lo más limpios posible. Además, es necesario realizar iteraciones y burbujear las células suavemente, y cambiar la mitad del medio de cultivo celular cada dos días tras seguir este procedimiento. Se pueden realizar métodos como la electrofisiología y la inmunocitoquímica para responder preguntas adicionales, como la forma en que los canales iónicos del intestino responden al tratamiento con fármacos, y para conocer la expresión de proteínas en neuronas y en las células de la glía, así como cómo la interacción entre estos dos tipos celulares se altera mediante diversos tratamientos tras su desarrollo.Esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la neurobiología exploren las funciones básicas de las neuropatías y las neuropatías del sistema nervioso entérico en animales modificados genéticamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar neuronas y células gliales del plexo TER del sistema nervioso entérico del ratón adulto.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Una forma alternativa de aislar a las neuronas motoras de embriones de ratón de la médula espinal se describe. El método tiene en cuenta el hecho de que las lectinas pueden unirse a los nervios de baja afinidad p75NTR receptor del factor de crecimiento. Esta lectina preplating basado permite una purificación similar a la que con un anticuerpo específico contra el p75NTR.

Lectina basado en Aislamiento y cultivo de motoneuronas embrionarias de ratón

Este video muestra un método para aislar células gliales entéricas de la submucosa y la lámina propia del intestino del ratón. Describe los pasos involucrados en la extracción de tejido de la submucosa y la lámina propia, el aislamiento de las células gliales entéricas de ellas y el cultivo de las células en una placa de pocillo recubierta para establecer un cultivo de células gliales entéricas.

Aislamiento de células gliales entéricas de la submucosa y la lámina propia de un ratón

Neuronas sensoriales musculares están implicadas en la señalización propioceptor y también informan sobre los eventos estatales y lesiones relacionados con el metabolismo. Describimos un ratón adulto en preparación muscular del nervio vitro para estudios sobre los aferentes musculares activados por estiramiento.

Un In Vitro Mouse Adulto Preparación músculo-nervio para estudiar las propiedades de cocción de los aferentes musculares

Este video demuestra un protocolo para realizar registros electrofisiológicos de una sola fibra en una preparación in vitro del nervio colorrectal de ratón.

In vitro Caracterización funcional de ratón colorrectal aferente Endings

El sistema nervioso entérico (SNE) es una red de neuronas y glía localizada en la pared intestinal que controla los reflejos intestinales. Este protocolo describe los métodos para registrar la actividad de las neuronas entéricas y la glía en preparaciones vivas de ENS utilizando imágenes de Ca2+.

In Situ Ca 2+ Imaging del sistema nervioso entérico

El sistema nervioso entérico está formado por células de la cresta neural que proliferan, migran y colonizan el intestino. Las células de la cresta neural se diferencian en neuronas con marcadores específicos para su fenotipo de neurotransmisor. Este protocolo describe una técnica de disección, fijación e inmunotinción del tracto gastrointestinal embrionario murino para visualizar la expresión de neurotransmisores del sistema nervioso entérico.

La inmunotinción para visualizar murino entérica Desarrollo del Sistema Nervioso

Aquí, describimos el aislamiento de las células entéricas glial de la intestinal submucosa con incubaciones secuenciales de EDTA para quelar cationes divalentes y luego de incubación en la solución de recuperación no enzimática de la célula. La suspensión de células resultante de poly-D-lisina y laminina de la galjanoplastia resulta en una cultura altamente enriquecida de las células gliales submucosas de análisis funcional.

Aislamiento de las células gliales entéricas de la Submucosa y la lámina propia del ratón adulto

Aquí, presentamos una nueva técnica microquirúrgica para el aislamiento de las células madre neurales de la eminencia gangliónica E13 ratón embrión.

Aislamiento y cultivo de las células madre neurales embrionarias de ratón

Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento in vitro de múltiples poblaciones de células gliales de un SNC de ratón. Este método permite la segregación de microglía regional, células precursoras de oligodendrocitos y astrocitos para estudiar los fenotipos de cada uno en una variedad de sistemas de cultivo.

Disección y aislamiento de la glía murina de múltiples regiones del sistema nervioso central

Este protocolo presenta una forma única de generar cultivos celulares del sistema nervioso central a partir de cerebros embrionarios de ratón del día 17 para la investigación neuro(inmuno)lógica. Este modelo se puede analizar utilizando varias técnicas experimentales, incluyendo RT-qPCR, microscopía, ELISA y citometría de flujo.

Establecimiento de cultivos mixtos de células neuronales y gliales a partir de cerebros embrionarios de ratones para estudiar la infección y la inmunidad innata

Este protocolo describe el aislamiento de astrocitos y microglía purificados de la médula espinal de ratones adultos, lo que facilita aplicaciones posteriores como el análisis de ARN y el cultivo celular. Incluye métodos detallados de disociación celular y procedimientos diseñados para mejorar tanto la calidad como el rendimiento de las células aisladas.

Aislamiento de astrocitos puros y microglía de la médula espinal de ratón adulto para ensayos in vitro y estudios transcriptómicos

Aprende a aislar neuronas y células gliales del plexo mientérico de ratón adulto mediante digestión enzimática y cultivo celular. Este método permite estudiar electrofisiología, inmunocitoquímica y PCR de célula única.

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