Un In-vitro Preparación de las neuronas entéricas aisladas y células gliales del plexo mientérico del ratón adulto

El objetivo general de este procedimiento es aislar neuronas funcionalmente viables y CLIA del plexo mientérico de ratón adulto. Esto se logra recubriendo primero la superficie de cultivo celular estéril con polilisina y laminina. El segundo paso es preparar las soluciones y el área quirúrgica para el aislamiento del plexo mientérico.

A continuación, extirpe el tracto gastrointestinal y aísle la sección deseada para crear una preparación del plexo mientérico muscular longitudinal. El paso final es digerir secuencialmente el LMMP en colagenasa y tripsina, seguido de la siembra de las células en las superficies de cultivo celular precodificadas. En última instancia, la electrofisiología, la inmunocitoquímica y la PCR de una sola célula se pueden utilizar para estudiar los efectos de las neuronas entéricas, la glía o la interacción entre estos dos tipos de células.

Trisha Har Smith, becaria postdoctoral en todo el laboratorio, y la asistirá Joy Gombe, candidata a doctorado en todo el laboratorio. La principal ventaja de esta técnica frente a las técnicas existentes es que las neuronas y la glía proceden del ratón adulto. Esto permite neuronas y glía completamente funcionales, que potencialmente pueden provenir de animales modificados genéticamente.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las propiedades eléctricas de las neuronas. También se puede aplicar a otras metodologías como la inmunocitoquímica, la PCR de una sola célula y las imágenes de calcio en tiempo real. Comience este procedimiento colocando un ratón eutanasiado en decúbito dorsal sobre la superficie quirúrgica.

A continuación, limpie la piel abdominal con etanol al 70%. A continuación, levántalo con unas pinzas y abre la cavidad abdominal con unas tijeras para revelar los órganos digestivos internos. Después de eso, levante una sección de íleon para revelar el mesentario.

Retire el tracto gastrointestinal y corte el mesenterio con unas tijeras. A continuación, retire y desenrede suavemente el íleon y el colon. Tenga cuidado de no extraer el mesenterio del íleon y el colon después de que se haya desenredado todo el intestino.

Extirpar el íleon cortando el intestino distal al estómago y proximal al ciego. Este procedimiento también se puede realizar con un tejido colónico mediante la extirpación del colon desde el distal hasta el ciego hasta el proximal al ano. A continuación, corte el íleon en tres o más piezas grandes.

Frote suavemente la solución de kreb a través de la sección intestinal hasta que toda la materia fecal se elimine en un contenedor de desechos separado. Coloque la sección limpia en el recipiente de Krebs etiquetado como limpio y repita los procedimientos hasta que se limpie todo el íleon. Para extraer el LMMP, corte el íleon en segmentos pequeños de dos a cuatro centímetros.

Después, coloque un segmento de íleon en una varilla de plástico o vidrio. El íleon debe quedar bien ajustado, pero no suelto ni tenso. Evite que el tracto gastrointestinal gire alrededor de la varilla sujetando suavemente el tubo a la varilla con el pulgar.

A continuación, retire suavemente los trozos de mesenterio que aún estén unidos al tracto gastrointestinal con pinzas. Después de eso, separe el LMMP del músculo circular subyacente. Frotando primero suavemente el borde de las pinzas a lo largo de toda la línea donde se unía el mesenterio de arriba a abajo del segmento.

Posteriormente, crea suavemente un espacio en el músculo longitudinal. A continuación, retira suavemente el músculo longitudinal con un bastoncillo de algodón unido con crebs empezando por la parte superior del espacio, utilizando el movimiento horizontal más ligero mientras aplicas una presión muy ligera hasta que el músculo longitudinal empiece a separarse del músculo circular. Haga esto a lo largo de toda la tira a lo largo del punto de fijación mesentario.

A continuación, trabaje suavemente alrededor del tubo gastrointestinal moviéndolo de arriba hacia abajo y hacia atrás. A medida que el músculo longitudinal se separa lentamente del músculo circular alrededor del tubo. Cuando esté completo, el LMMP se desprenderá naturalmente del tubo gastrointestinal restante.

A continuación, coloque la tira delgada de músculo longitudinal resultante en el vaso de precipitados etiquetado como LMMP y repita los procedimientos para todos los segmentos en este procedimiento. Coloque el enjuague en los segmentos LMMP en la solución de digestión. A continuación, corta el LMMP en trozos pequeños con unas tijeras.

A continuación, digéralos durante 60 minutos. En un baño de agua a 37 grados centígrados con una coctelera mientras se burbujea suavemente con carbógeno. Una vez completada la digestión, reúna las células por centrifugación durante ocho minutos a 356 G en una centrífuga, enfriando a cuatro grados centígrados.

Mientras tanto, prepare una solución de tripsina al 0,05 % en una campana de cultivo celular agregando un mililitro de tripsina al 0,25 % calentado y cuatro mililitros de HBSS calentado en un tubo de cultivo celular estéril de 50 mililitros. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante, retire con cuidado el pellet de celda y colóquelo en un tubo limpio con cinco mililitros de solución de tritina al 0,05%. A continuación, digiera las células en una solución de tryin al 0,05% en un baño de agua a 37 grados centígrados agitando durante siete minutos, neutralice el tryin con 10 mililitros de medios de enjuague fríos.

Después de siete minutos de tratamiento con tripsin, centrifugar las células durante ocho minutos a 356 gs. Mientras tanto, equilibre la sección de malla TX esterilizada sobre un tubo de cultivo celular estéril de 15 mililitros. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente la mezcla celular activándola en tres mililitros.

Medios neuronales completos. Todas las alteraciones deben hacerse con mucha suavidad para evitar generar burbujas de aire, luego filtre la solución celular a través de la malla NYX en un tubo de cultivo celular limpio de 15 mililitros. Recoja las células por centrifugación durante ocho minutos a 356 gs.

Después de eso, retire y deseche el sobrenadante. Re suspender las células en 1200 microlitros de medios neuronales completos. A continuación, frote suavemente las células con una punta de pipeta de plástico de un mililitro.

Tenga cuidado de no generar burbujas de aire, pipetee lenta y suavemente hasta que la mayoría de los trozos se rompan y las células queden suspendidas en líquido. Ahora, agregue 750 microlitros del medio completo a cada uno de los 12 pocillos que contienen un cubreobjetos de vidrio precodificado. A continuación, añada 100 microlitros de la solución celular clasificada.

Incubar las neuronas en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados con un cambio de dióxido de carbono del 5%. La mitad de los medios celulares cada dos días. Las neuronas están listas para los registros electrofisiológicos después de uno o dos días en cultivo.

Aquí se muestra la caracterización inmunohistoquímica de las neuronas entéricas. Lea aislada del ratón. La microscopía confocal muscular longitudinal reveló la tinción de beta tres tubulina neuronal específica en toda la preparación del músculo longitudinal ileal de Mount en el ratón.

Y estas son las células aisladas de las preparaciones de LMMP, que contienen las neuronas que se tiñeron positivamente para la unión a cal y las células gliales de Retin que se muestran aquí se visualizaron con el marcador específico de glía GFAP. Sin embargo, no se observó tinción cuando se omitió el anticuerpo primario. Aquí están las neuronas y la glía aisladas del músculo longitudinal del ratón que crecen muy cerca unas de otras.

Las imágenes de microscopía confocal indican que las neuronas verdes y las ggl rojas crecen fácilmente adyacentes entre sí y parecen interactuar in vitro. Esta figura muestra la electrofisiología de las neuronas entéricas cultivadas y CLIA en el modo de pinza amperimétrica. Todas las neuronas mostraron potenciales de acción tras la inyección de corriente.

Los CLIA no tienen potenciales de acción, pero muestran grandes potenciales electrotónicos en respuesta a la inyección de corriente. Las neuronas cultivadas a partir del íleon del ratón son una población heterogénea electrofisiológica. En el modo de pinza de corriente, una inyección de corriente de 0,09 nanoamperios en las neuronas da como resultado potenciales de acción.

Las neuronas HP negativas regresan inmediatamente al potencial de membrana en reposo después de la estimulación. Mientras que una HP positiva, las neuronas muestran una HP A después de la estimulación, en la que el potencial de membrana en reposo cae por debajo de la línea de base antes de volver lentamente al valor inicial. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener la cristalería y los instrumentos quirúrgicos lo más limpios posible. Además, itere y burbujee las células suavemente y cambie la mitad de los medios de cultivo celular cada dos días siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar métodos como la electrofisiología y la inmunocitoquímica para responder a preguntas adicionales como cómo los canales iónicos en el intestino responden al tratamiento farmacológico, y para aprender sobre la expresión de proteínas en las neuronas y lia, y cómo la interacción de estos dos tipos de células se ve alterada por diversos tratamientos después de su desarrollo.

Esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la neurobiología exploren las funciones básicas de las neuropatías y neuropatías g del sistema nervioso entérico en animales modificados genéticamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar las neuronas y la glía del plexo TER del sistema nervioso entérico del ratón adulto.