Name: In vivo método de imagen para distinguir la inflamación aguda y crónica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprende a distinguir inflamación aguda y crónica en ratones mediante imagen bioluminiscente no invasiva con sustratos quimioluminiscentes. Este método permite visualizar la actividad de neutrófilos y macrófagos en tiempo real.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nancy Lurie Marcas. Damos las gracias a la Dra. Nancy E. Kohl para la lectura crítica del manuscrito. Agradecemos Kin K. Wong por su ayuda en la preparación de este informe en video.

Nota: Todos los estudios con animales se realizaron de acuerdo con protocolos institucionales aprobados y las directrices de cuidado de animales. 1. Reactivos y Soluciones <ol><li> Solución de PMA para la inoculación sc: Preparar una solución madre de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) a 5 mg / ml en DMSO. Guarde la solución madre a -20 ° C. Antes de la inoculación, descongelar la solución madre y se diluye hasta 1 mg / ml de PMA en PBS. </li><li> Solución de LPS para la inoculación sc: Disolver lipopolisacárido (LPS de Salmonella enterica serotipo enteritidis) en PBS estéril a 1 mg / ml antes de la inoculación sc. </li><li> Solución de luminol para obtener imágenes de fase aguda: Disolver luminol (,4-ftalazinediona, sal de sodio de 5-amino-2 ,3-dihidro-1) en solución salina normal estéril (0,9% NaCl) a 10 mg / ml. La solución puede ser almacenada a -20 ° C antes de su uso. </li><li> Solución Lucigenin para obtener imágenes de la fase crónica: Disolver lucigenin (bis-N-metilacridinio nitrato) en solución salina normal estérila 2,5 mg / ml. La solución puede ser almacenada a -20 ° C antes de su uso. </li></ol> 2. Subcutánea PMA inflamación Modelo <ol><li> Anestesie NCr ratones desnudos en una cámara de inducción con isoflurano 1-2%. Confirmar anestesia general por la pérdida de movimiento y un ritmo respiratorio constante. Transferir a un animal a un cono de nariz suministrado con gas isoflurano-mezclado y mantener al animal bajo anestesia. </li><li> Utilice un alcohol isopropílico limpiar para limpiar y desinfectar el lugar de la inyección en el flanco izquierdo. </li><li> Utilizando una técnica estéril, inyectar 50 l de la solución de inoculación PMA (que contiene 50 g de PMA) en el espacio subcutáneo en el flanco izquierdo. Retire el exceso de líquido del sitio de la inyección con un algodón con alcohol isopropílico. Evite el uso de analgesia, ya que puede afectar a las respuestas inflamatorias. </li><li> Mueva el animal de nuevo a la jaula de la vivienda y seguir de cerca su recuperación de la anestesia. A fin de ayudar en la recuperación, use una almohadilla térmica para mantener el calor del animal.</li></ol> 3. Subcutánea LPS inflamación Modelo <ol><li> Anestesie ratones C57BL/6J con 1-2% isoflurano en una cámara de inducción. Una vez que se establece la anestesia general, la transferencia de un animal a un cono de la nariz suministrado con gas isoflurano y mantener al animal bajo anestesia. </li><li> Utilice un alcohol isopropílico para limpiar la zona de la inyección en la pata izquierda. </li><li> Utilizando una técnica estéril, inyectar 50 l de la solución de inoculación de LPS (que contiene 50 g de LPS) en la almohadilla de la pata izquierda. Retire el exceso de líquido del sitio de la inyección con un algodón con alcohol isopropílico. Evite el uso de analgesia, ya que puede afectar a las respuestas inflamatorias. </li><li> Mueva el animal de nuevo a la jaula de la vivienda y seguir de cerca su recuperación de la anestesia. Use una almohadilla térmica para mantener caliente el animal durante la recuperación. </li></ol> 4. Bioluminiscencia de imágenes de la inflamación <ol><li> Se anestesia al animal en una cámara de inducción con isoflurano 1-2% de gas mezclado. Confirm anestesia general por la pérdida de movimiento y un ritmo respiratorio constante. </li><li> Mientras que el animal es todavía bajo anestesia, por vía intraperitoneal (ip) inyectar la solución de luminol (10 mg / ml), o la solución de lucigenina (2,5 mg / ml) para obtener imágenes de la inflamación aguda o crónica, respectivamente. La dosis final es 100 mg / kg para el luminol y 25 mg / kg para lucigenina. Una dosis más baja de lucigenina (10-15 mg / kg) se puede utilizar para evitar la posible toxicidad de algunas cepas de ratón. Los signos de toxicidad incluyen falta de aliento y dificultad respiratoria. La cepa C57BL/6J tiene menor lucigenin tolerabilidad que la cepa nude NCR. </li><li> Transferir el animal en la cámara de formación de imágenes de un sistema de imágenes de bioluminiscencia. </li><li> Realizar imágenes de bioluminiscencia secuencial a intervalos de 1 min. Cada paso de imagen está compuesto por 1 min tiempo de adquisición, f / stop = 1, hurgar en la basura = 16 y 0 segundos de retardo. </li><li> En el panel de adquisición de imágenes, para permitir secuencial de imágenes de varios pasos, haga clic en la secuencia de la creación button. Proporcionar suficientes medidas de imagen en el perfil de adquisición para determinar la producción de luminiscencia máxima (normalmente 15 pasos de un minuto será suficiente). La sección de formación de imágenes 15-min permite tiempo suficiente para la absorción de sustrato y la circulación sistémica. </li><li> Retire el animal de la cámara de imágenes y moverlo de nuevo a la jaula de la vivienda. A fin de ayudar en la recuperación, use una almohadilla térmica para mantener el calor del animal. </li><li> Durante el análisis post-adquisición, utilizar el paquete de software de imágenes para el cálculo de pico de la señal bioluminiscente total a través de las regiones estandarizados de interés (ROI). Las imágenes se presentan como resplandor en fotones / s / cm 2 / sr con un umbral mínimo y máximo indicados. Los datos cuantitativos se presentan como flujo total de fotones por segundo por ROI. </li></ol>

<ol><li>Premack, B. A., Schall, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptors%3A+gateways+to+inflammation+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptors: gateways to inflammation and infection.</a> Nat. Med. 2, 1174-1178 (1996).</li>
<li>Singer, A. J., Clark, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Cutaneous wound healing.</a> N. Engl. J. Med. 341, 738-746 (1999).</li>
<li>Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation%2C+stress%2C+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Inflammation, stress, and diabetes.</a> J. Clin. Invest. 115, 1111-1119 (2005).</li>
<li>Weitzman, S. A., Gordon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+cancer%3A+role+of+phagocyte-generated+oxidants+in+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inflammation and cancer: role of phagocyte-generated oxidants in carcinogenesis.</a> Blood. 76, 655-663 (1990).</li>
<li>Ridker, P. M., Cushman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation%2C+aspirin%2C+and+the+risk+of+cardiovascular+disease+in+apparently+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men.</a> N. Engl. J. Med. 336, 973-979 (1997).</li>
<li>Wyss-Coray, T., Mucke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+neurodegenerative+disease--a+double-edged+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Inflammation in neurodegenerative disease--a double-edged sword.</a> Neuron. 35, 419-432 (2002).</li>
<li>Hamilton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony-stimulating+factors+in+inflammation+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Colony-stimulating factors in inflammation and autoimmunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 533-544 (2008).</li>
<li>Harlan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial interactions.</a> Blood. 65, 513-525 (1985).</li>
<li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li>
<li>Rest, R. F., Spitznagel, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+distribution+of+superoxide+dismutases+in+human+neutrophils.+Influence+of+myeloperoxidase+on+the+measurement+of+superoxide+dismutase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Subcellular distribution of superoxide dismutases in human neutrophils. Influence of myeloperoxidase on the measurement of superoxide dismutase activity.</a> Biochem. J. 166, 145-153 (1977).</li>
<li>Hampton, M. B., Kettle, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside+the+neutrophil+phagosome%3A+oxidants%2C+myeloperoxidase%2C+and+bacterial+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing.</a> Blood. 92, 3007-3017 (1998).</li>
<li>Serhan, C. N., Savill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+inflammation%3A+the+beginning+programs+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Resolution of inflammation: the beginning programs the end.</a> Nat. Immunol. 6, 1191-1197 (2005).</li>
<li>Jiang, F., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase-mediated+redox+signaling%3A+roles+in+cellular+stress+response%2C+stress+tolerance%2C+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase-mediated redox signaling: roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair.</a> Pharmacol. Rev. 63, 218-242 (2011).</li>
<li>Calafat, J., Kuijpers, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+small+intracellular+vesicles+in+human+blood+phagocytes+containing+cytochrome+b558+and+the+adhesion+molecule+CD11b%2FCD18%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evidence for small intracellular vesicles in human blood phagocytes containing cytochrome b558 and the adhesion molecule CD11b/CD18.</a> Blood. 81, 3122-3129 (1993).</li>
<li>Johansson, A., Jesaitis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+subcellular+localization+of+cytochrome+b+and+the+dormant+NADPH-oxidase+in+neutrophils+and+macrophages%3A+effect+on+the+production+of+reactive+oxygen+species+during+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Different subcellular localization of cytochrome b and the dormant NADPH-oxidase in neutrophils and macrophages: effect on the production of reactive oxygen species during phagocytosis.</a> Cell. Immunol. 161, 61-71 (1995).</li>
<li>Kumar, A. P., Piedrafita, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma+ligands+regulate+myeloperoxidase+expression+in+macrophages+by+an+estrogen-dependent+mechanism+involving+the+-463GA+promoter+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligands regulate myeloperoxidase expression in macrophages by an estrogen-dependent mechanism involving the -463GA promoter polymorphism.</a> J. Biol. Chem. 279, 8300-8315 (2004).</li>
<li>Tseng, J. C., Kung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+inflammatory+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of inflammatory phagocytes.</a> Chem Biol. 19, 1199-1209 (2012).</li>
<li>Gross, S., Gammon, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+myeloperoxidase+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo.</a> Nat. Med. 15, 455-461 (2009).</li>
<li>Kielland, A., Blom, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+in+inflammation+using+the+luminescent+probe+L-012%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012.</a> Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Tsai, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+assessment+of+localized+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive assessment of localized inflammatory responses.</a> Free Radic. Biol. Med. 52, 218-226 (2012).</li>
<li>Karlsson, A., Nixon, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phorbol+myristate+acetate+induces+neutrophil+NADPH-oxidase+activity+by+two+separate+signal+transduction+pathways%3A+dependent+or+independent+of+phosphatidylinositol+3-kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase.</a> J. Leukoc. Biol. 67, 396-404 (2000).</li>
<li>Taylor, R. G., McCall, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathologic+features+of+phorbol+myristate+acetate-induced+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Histopathologic features of phorbol myristate acetate-induced lung injury.</a> Lab Invest. 52, 61-70 (1985).</li>
<li>Fukaya, S., Matsui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+TNF-alpha-converting+enzyme+in+fibroblasts+augments+dermal+fibrosis+after+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Overexpression of TNF-alpha-converting enzyme in fibroblasts augments dermal fibrosis after inflammation.</a> Lab Invest. 93, 72-80 (2013).</li>
<li>Lu, Y. C., Yeh, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPS%2FTLR4+signal+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42, 145-151 (2008).</li>
<li>Aitken, R. J., Buckingham, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+and+human+spermatozoa%3A+analysis+of+the+cellular+mechanisms+involved+in+luminol-+and+lucigenin-dependent+chemiluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species and human spermatozoa: analysis of the cellular mechanisms involved in luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence.</a> J. Cell. Physiol. 151, 466-477 (1992).</li>
<li>Allen, R. C., Loose, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+activation+of+a+luminol-dependent+chemiluminescence+in+rabbit+alveolar+and+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Phagocytic activation of a luminol-dependent chemiluminescence in rabbit alveolar and peritoneal macrophages.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 69, 245-252 (1976).</li>
<li>Caldefie-Chezet, F., Walrand, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+neutrophil+reactive+oxygen+species+production+measured+by+luminol+and+lucigenin+chemiluminescence+intra+or+extracellular%3F+Comparison+with+DCFH-DA+flow+cytometry+and+cytochrome+c+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Is the neutrophil reactive oxygen species production measured by luminol and lucigenin chemiluminescence intra or extracellular? Comparison with DCFH-DA flow cytometry and cytochrome c reduction.</a> Clin. Chim. Acta. 319, 9-17 (2002).</li>
<li>Dahlgren, C., Aniansson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+formylmethionyl-leucyl-phenylalanine-induced+luminol-+and+lucigenin-dependent+chemiluminescence+in+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pattern of formylmethionyl-leucyl-phenylalanine-induced luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence in human neutrophils.</a> Infect. Immun. 47, 326-328 (1985).</li>
<li>Dahlgren, C., Karlsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+burst+in+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Respiratory burst in human neutrophils.</a> J. Immunol. Methods. 232, 3-14 (1999).</li>
<li>Aerts, C., Wallaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+superoxide+anion+by+alveolar+macrophages+in+pulmonary+sarcoidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Release of superoxide anion by alveolar macrophages in pulmonary sarcoidosis.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 465, 193-200 (1986).</li>
<li>Zhang, N., Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+myeloperoxidase+activity+in+deep+tissues+through+luminescent+excitation+of+near-infrared+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of myeloperoxidase activity in deep tissues through luminescent excitation of near-infrared nanoparticles.</a> Nat Med. , (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés en este estudio.

En este informe, se demuestra un método para obtener imágenes de bioluminiscencia no invasivo de la inflamación en los animales vivos. Tomando ventaja de dos sustratos luminiscente, el luminol y lucigenina, el método puede distinguir diferentes fases de la inflamación. Bioluminiscencia Luminol se asocia con los neutrófilos en la fase aguda de la inflamación, mientras que la bioluminiscencia lucigenina está mediada por los macrófagos en la fase crónica. Relativamente pequeño (PM = 177,16 g / mol) y no cargado eléctricame...

La inflamación es una respuesta biológica altamente regulado que participan en una variedad de enfermedades humanas, incluyendo la infección microbiana 1, cicatrización de la herida 2, 3 la diabetes, el cáncer de 4, 5 cardiovasculares, neurodegenerativas 6, 7 y enfermedades autoinmunes. Inflamación de tejidos requiere la coordinación adecuada de diversas células inmunes con el fin de lograr la autorización patógeno, la reparación de tejidos, y la resolución de la enfermedad. Los neutrófilos y los macrófagos son mediadores inmunes clave de la inflamación del tejido. En la fase aguda de la inflamación, los neutrófilos son los primeros en responder a diversos estímulos nocivos y daños en los tejidos 8. Los neutrófilos extravasación rápidamente de la circulación para el sitio de la lesión, donde las células inactivan los microbios invasores mediante la liberación de gránulos anti-microbianos y la fagocitosis. Durante la fagocitosis, neutrófilos fagocitan los microbios invasores en fagosomas, dentro de la cual las células producen niveles elevados de superóxidoide (O 2 · -). Superóxido phagosomal es la fuente principal de muchas especies reactivas de oxígeno (ROS aguas abajo). Por ejemplo, se puede dismutado superóxido a peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) por dismutación espontánea o por la superóxido dismutasa (SOD) 9, 10. En los neutrófilos, la mieloperoxidasa (MPO) convierte más peróxido de hidrógeno a ácido hipocloroso antimicrobiana (HOCl) 11. Como las respuestas inflamatorias siguen, los monocitos circulantes migran gradualmente en el sitio de la lesión y se diferencian en macrófagos maduros 2, cuya función fagocítica ayudar a eliminar patógenos inactivados y restos celulares. Además, como un regulador clave en la última fase de la inflamación, los macrófagos promueve la reparación del tejido mediante la producción de citocinas antiinflamatorias y 12 mediante la generación de ROS extracelular a un nivel inferior 9. El ROS generado en esta etapa posterior a regular la remodelación de tejidos, formación de nuevos vasos, y reepithelialización 13. Fagocito NADPH oxidasa (Phox) es la fuente primaria de la producción de superóxido en neutrófilos y macrófagos 9. Phox es un complejo multi-subunidad cuyo montaje es estrictamente regulados 9. La holoenzima contiene varias subunidades reguladoras citosólicas (p67 phox, p47 phox, p40 phox y RAC) y una membrana heterodímero citocromo b 558 (compuesto por subunidades CYBA y CYBB). Citocromo b 558 es el núcleo de reacción dentro de la cual la subunidad CYBB (también conocido como p91 phox y NOX2) lleva a cabo la reacción en cadena redox primaria 9. Curiosamente, sus lugares de concentración son diferentes entre los neutrófilos y los macrófagos. En los neutrófilos en reposo, el citocromo b 558 es sobre todo presente en la membrana de los gránulos de almacenamiento intracelular 14. Durante la fagocitosis, neutrófilos montar la holoenzymes en fagosomas 9, donde también están presentes altos niveles de actividad de MPO. El neutrófilo Phox consume rápidamente oxígeno y ejerce su poder microbicida por la producción de ROS, un fenómeno denominado el estallido respiratorio 11. En contraste, los macrófagos tienen un nivel más bajo de expresión de MPO y el citocromo b 558 se encuentra principalmente en la membrana de plasma 15, 16. Por lo tanto los neutrófilos producen altos niveles de superóxido para la actividad anti-microbiana, mientras que los macrófagos generan menos superóxido para las funciones de regulación 15. Dado que la inflamación es un intrincado proceso in vivo, los métodos de imagen no invasivas específicos para las diferentes fases de la inflamación serían permiten la evaluación cuantitativa y longitudinal de modelos de enfermedad. Uso de estudios mecanísticos, hemos demostrado previamente el uso de dos agentes quimioluminiscentes, luminol (5-amino-2 ,3-dihidro-1 ,4-ftalazinediona) y lucigenina (bis-N-metilacridinio nitrato), Para formación de imágenes no invasiva de las etapas agudas y tardías (crónica) de la inflamación, respectivamente 17. Luminol permite la visualización de la actividad de MPO de neutrófilos en la fase aguda de la inflamación 18-20, mientras que la bioluminiscencia lucigenina se puede utilizar para evaluar la actividad de los macrófagos en asociación con la fase tardía o la inflamación crónica 17. En este manuscrito, se utilizaron dos modelos experimentales de inflamación (sc PMA y sc LPS) para demostrar estas técnicas de imagen.

<table><tbody><tr><td>Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO</td><td>P8139</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipopolisacárido de Salmonella enterica serotipo enteritidis</td><td>Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO</td><td>L2012</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Luminol (5-amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazidinadiona, sal de sodio)</td><td>Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO</td><td>A4685</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Lucigenina (nitrato de bis-N-metilacridinaio)</td><td>Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO</td><td>M8010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sistema de imagen IVIS Spectrum con paquete de software Living Imaging 4.2</td><td>Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

in vivo método de imagen para distinguir la inflamación aguda y crónica

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

La inflamación es un aspecto fundamental de muchas enfermedades humanas. En este informe de vídeo, se demuestra las técnicas de imagen no invasivas bioluminiscencia que distinguen a la inflamación aguda y crónica en modelos de ratón. Con daños en los tejidos o la invasión de patógenos, los neutrófilos son la primera línea de defensa, jugando un papel importante en la mediación de la respuesta inflamatoria aguda. A medida que avanza la reacción inflamatoria, los monocitos circulantes migran gradualmente en el sitio de la lesión y se diferencian en macrófagos maduros, que median la inflamación crónica y promover la reparación del tejido mediante la eliminación de restos de tejido y la producción de citocinas antiinflamatorias. La inyección intraperitoneal de luminol (,4-ftalazinediona, sal de sodio de 5-amino-2 ,3-dihidro-1) permite la detección de la inflamación aguda en gran parte mediada por neutrófilos infiltrantes de tejidos. Luminol reacciona específicamente con el superóxido generado dentro de los fagosomas de neutrófilos desde bioluminiscencia resulta de una mieloperoxidasa (MPO) reacción mediada. Lucigenin (bis-N-metilacridinio nitrato) también reacciona con el superóxido con el fin de generar bioluminiscencia. Sin embargo, lucigenin bioluminiscencia es independiente de MPO y se basa únicamente en la NADPH oxidasa de fagocitos (Phox) en los macrófagos durante la inflamación crónica. Juntos, el luminol y lucigenina permiten la visualización no invasiva y la evaluación longitudinal de diferentes poblaciones fagocitos a través de fases inflamatorias tanto agudas como crónicas. Teniendo en cuenta el importante papel de la inflamación en una variedad de enfermedades humanas, creemos que este método de formación de imágenes no invasiva puede ayudar a investigar los papeles diferenciales de los neutrófilos y macrófagos en una variedad de condiciones patológicas.

Se realizó imágenes de bioluminiscencia longitudinal para evaluar la inflamación aguda y crónica en modelos experimentales de inflamación. Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) es un agonista de la proteína quinasa C potente (PKC) que activa Phox para la producción de anión superóxido y desencadena intensas respuestas inflamatorias agudas 21. Inyección subcutánea de 50 mg de PMA en ratones desnudos NCr causó irritación de la piel rápido y la inflamación aguda en los sitios de inyección 18, 22, 23. S...

Se describe un método de imagen no invasiva para distinguir las fases inflamatorias. El suministro sistémico de luminol revela zonas de inflamación aguda que dependen de la actividad MPO en neutrófilos. En contraste, la inyección de lucigenina permite la visualización de la inflamación crónica dependiente de la actividad Phox en los macrófagos.

In vivo método de imagen para distinguir la inflamación aguda y crónica

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

El objetivo general de este procedimiento es distinguir visualmente la inflamación aguda y crónica en ratones vivos. Esto se logra mediante la inyección subcutánea de cuatro, ball 12 me state, 13 acetato o PMA para desencadenar una respuesta inflamatoria aguda intensa. A continuación, se realiza una inyección intraperitoneal del sustrato quimioluminiscente, luminol o lucigén, para inducir señales de luz en el sitio de la inflamación. La luminiscencia de la luminol indica inflamación aguda. Mientras que la luminiscencia de la lucigénina revela áreas de inflamación en estadio tardío o crónica, el animal se coloca entonces dentro de un imagenador de bioluminiscencia, que visualiza las señales de luminiscencia producidas por los sustratos quimioluminiscentes en los sitios de inflamación. A continuación, se realizan pasos secuenciales de obtención de imágenes para capturar la emisión máxima de luminiscencia para análisis cuantitativo, y el procedimiento de imagen se repite en diferentes puntos temporales para seguimiento de diversas respuestas inflamatorias.En última instancia, los resultados de imágenes longitudinales muestran respuestas inflamatorias diferenciales basadas en la cinéti

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí se describe una manera no invasiva de dos fotones (2P), microscopía de enfoque para el estudio de leucocitos de recalada en la almohadilla plantar del ratón. Se discuten los aspectos técnicos de la preparación de imágenes de tejidos y caminar al lector a través de un experimento típico de la configuración inicial a la colección de ejecución y los datos.

De imagen no invasivas de Homing leucocitos y Migración In vivo</em

Demostramos cómo realizar macrófagos RM con contraste superparamagnético ultra pequeño (USPIO) en la artritis séptica, lo que permite una inicial y...

En vivo los macrófagos de imágenes utilizando MR Agente de contraste dirigida para la Evaluación Longitudinal de Artritis séptica

Se describe un multi-ángulo de rotación del sistema de formación de imágenes ópticas (Maroi) para la cuantificación in vivo de un marcador fluorescente emitido por saposina C (SAPC)-dioleilfosfatidil serina (DOPS) nanovesículas. El empleo de modelos de ratón de cáncer y la artritis, demostramos cómo el análisis de la curva de la señal de Maroi se puede utilizar para la cartografía precisa y caracterización biológica de los procesos de enfermedad.

En vivo de imágenes óptico de tumores del cerebro y la artritis Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

La matriz extracelular se somete a la remodelación sustancial durante la cicatrización de heridas, la inflamación y la tumorigénesis. Se presenta un novedoso enfoque de inmunofluorescencia microscopía intravital de visualizar la dinámica de fibrilar, así como componentes de la matriz de tipo malla con una alta resolución espacial y temporal mediante epifluorescencia o microscopía de dos fotones.

A largo plazo intravital Inmunofluorescencia imágenes de tejido Componentes de Matriz con epifluorescencia y microscopía de dos fotones

La activación de la microglia y microgliosis son respuestas clave a la neurodegeneración crónica. A continuación, presentamos los métodos para in vivo, visualización a largo plazo de la retina células microgliales CX3CR1-GFP + por oftalmoscopía confocal y de umbral y los análisis morfométricos para identificar y cuantificar su activación. Hacemos un seguimiento de los cambios microgliales durante las primeras etapas del glaucoma relacionada con la edad.

En Vivo Dinámica de Retina Microglial Activación Durante Neurodegeneración: Confocal oftalmoscópico Imaging y Morfometría celular en el ratón Glaucoma

Detallamos un protocolo para monitorizar el comportamiento de neutrófilos y monocitos en venas mesentéricas en estado estacionario e inflamatorio utilizando microscopía confocal intravital en ratones anestesiados.

Imaging neutrófilos y monocitos en mesentérica venas por Microscopia intravital en ratones anestesiados en Tiempo Real

Este documento explica la aplicación de imagen fluorescente utilizando una sonda de formación de imágenes óptico activable para visualizar la actividad in vivo de las metaloproteinasas de matriz de teclas en dos modelos experimentales diferentes de inflamación.

No invasiva<em&gt; En Vivo</emHome Idiomas Ingresar a Epistemonikos Búsqueda avanzada Fluorescencia de imágenes ópticas de la actividad MMP inflamatoria utilizando un agente de imagen fluorescente activable

Sondas específicas de objetivo representan una herramienta innovadora para el análisis de los mecanismos moleculares, como la expresión de proteínas en diversos tipos de enfermedad (p. ej., inflamación, infección y tumorigenesis). En este estudio, describimos una evaluación tomográfica tridimensional cuantitativa de la infiltración de macrófagos intestinales en un modelo murino de colitis con F4/80-específica mediada por fluorescencia tomografía.

Tomografía mediada por fluorescencia para la detección y cuantificación de la inflamación Intestinal murina relacionadas con macrófagos

Los cambios morfológicos ocurren en las células de fibroblastos inmune sensibles después de la activación y promueven alteraciones en el reclutamiento celular. Utilización de imágenes de 2 fotones junto con una proteína específica de fibroblastos de ingeniería genética 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) línea de ratón y verde fluorescently etiquetado lipopolysaccharide-FITC, podemos ilustrar la absorción altamente específica de lipopolisacárido en fibroblastos dérmicos y cambios...

In Vivo 2-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Este artículo describe un método para la observación crónica in vivo de la microglía en reposo en el hipocampo de ratón CA1 utilizando cirugía controlada con precisión y microscopía de dos fotones.

In vivo Imágenes crónicas de dos fotones de microglia en el hipocampo del ratón

La imagen in vivo de las articulaciones es una técnica valiosa para descubrir el comportamiento migratorio de los leucocitos y la dinámica molecular dentro de las articulaciones inflamadas. Aquí presentamos un protocolo detallado para la obtención de imágenes in vivo de las articulaciones utilizando un modelo murino de artritis inducida por colágeno tipo II (CIA).

In vivo Las imágenes revelan el comportamiento migratorio de los leucocitos dentro de las articulaciones

Aprende a distinguir inflamación aguda y crónica en ratones mediante imagen bioluminiscente no invasiva con sustratos quimioluminiscentes. Este método permite visualizar la actividad de neutrófilos y macrófagos en tiempo real.

In vivo método de imagen para distinguir la inflamación aguda y crónica

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