Name: Micron escala Resolución óptica tomografía de cerebro de ratón enteras con Hoja confocal Microscopía de Luz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-08T19:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprenda a reconstruir cerebros completos de ratón con resolución micrométrica mediante microscopía de hoja de luz confocal. Este protocolo permite visualizar la anatomía cerebral y la distribución neuronal en pocos días.

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La investigación que lleva a estos resultados ha recibido financiación de la Unión Europea del Séptimo Programa Marco (FP7/2007-2013) bajo acuerdos de subvención n. 228334 y 241526. Este proyecto de investigación ha sido apoyada también por la beca de investigación Human Frontier Science Program (RGP0027/2009), y por el Ministerio de Educación, Universidad e Investigación en el marco del Proyecto Nanomax Flagship italiano y por el Ministerio de Sanidad italiano, en el marco de la &quot;Células Madre Convocatoria de propuestas&quot;. Esta investigación se ha llevado a cabo en el marco de las actividades de investigación de la fundación ICON apoyados por &quot;Ente Cassa di Risparmio di Firenze&quot;.

1. Preparación del tejido y almacenamiento <ol><li> Fijar cerebro de ratón a través de la perfusión transcardial estándar 13 con 20 ml de 0,01 M tampón fosfato salino (PBS), seguido por 100 ml de paraformaldehído al 4% en 0,01 M de PBS. Ajustar cuidadosamente el pH de ambas soluciones a 7,6: valores ligeramente más bajos de pH pueden extinguir la fluorescencia de EGFP. </li><li> Post-fijar los cerebros extirpados durante la noche en paraformaldehído al 4% a 4 ° C. </li><li> Enjuague dos veces (30 min cada uno) en 0,01 M de PBS y guardar en 0,01 M de PBS a 4 ° C. </li></ol> 2. Deshidratación y Compensación Nota: el protocolo para la deshidratación y la limpieza sigue de cerca el descrito por Becker et al 10. <ol><li> Para eliminar los peróxidos del disolvente deshidratación (tetrahidrofurano, THF), que saciar fuertemente la fluorescencia XFP, THF filtro con óxido de aluminio activado básica (Grado de actividad Brockman I, aproximadamente 250 g / l de THF) utilizando un cromatografía de columna. Evitar el agrietamiento de la columna, lo cual reduciría la eliminación de peróxido. </li><li> Añadir estabilizador (hidroxitolueno butilado, 250 mg / L) a la solución final, incluso si el THF ya se estabilizó antes de la filtración. Estabilizador De hecho, es retenido por el óxido de aluminio: THF sin estabilizador puede desarrollar grandes cantidades de peróxidos y puede ser explosiva y peligrosa. </li><li> Deshidratar todo el cerebro de ratón en una serie graduada de THF en agua pura: 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%, 1 h cada uno, a continuación, 100% durante la noche. Colocar el vial con la muestra en una rueda giratoria. Para evitar la exposición a la luz, envolver los viales con una lámina de aluminio. </li><li> Se filtra el disolvente de compensación (éter de dibencilo, DBE) con óxido de aluminio (activado básica, grado de actividad de Brockman I, aproximadamente 250 g / L de DBE) usando un embudo de filtración. </li><li> Desactive la muestra en 100% DBE. Cambie la solución después de 3 y 6 hr. </li></ol> 3. Espécimen de montaje <ol><li> Cuando el cerebro se ve transparente a simple vista (típicamentemente 1 hora después del segundo cambio DBE), montar en la placa de imagen de punta por uno de los siguientes métodos: </li><li><ol><li> Montaje directo - hundir suavemente la muestra en una de las extremidades (Figura 3a). </li><li> Disco de agarosa - Sumérgete en un disco hecho de un 6% en gel de agarosa en las puntas. Fijar la muestra cuidadosamente en el disco de agarosa con pegamento acrílico (Figura 3b). Espere aproximadamente 1 minuto para el curado. </li><li> Vaso de precipitados de agarosa - Sumérgete un vaso hecho de un 3% en gel de agarosa en las puntas. Colocar suavemente la muestra en la parte inferior del vaso de precipitados (Figura 3c). </li></ol></li></ol> Nota 1: montaje en vaso de precipitados de agarosa debe ser preferible cuando es importante imágenes de la muestra en su totalidad, sin embargo, el gel de agarosa que rodea la muestra da lugar a dispersión de la luz adicional que podría ser perjudicial para la calidad de la imagen. Si una pequeña parte de la muestra podría ser excluido de la proyección de imagen, es preferible montar la especificaciónimen en el disco de agarosa o directamente en la punta. El primer método es el más adecuado para mantener el cerebro horizontal (excluyendo de imágenes de una porción ventral o dorsal del cerebro), este último para mantener el cerebro vertical (con exclusión de la imagen de una parte de los bulbos olfativos o de la médula espinal). Nota 2: el gel de agarosa se debe preparar en agua, después se deshidrata con THF (50% y 100% de 4 horas cada una) y se aclaró en DBE 100% durante 4 horas o hasta que se vea con claridad transparente. <ol start="3"><li> Después de montar la muestra siguiendo uno de los métodos anteriores, la posición de la placa de imagen dentro de la cámara de la muestra con unas pinzas. Llene la cámara con la limpieza de la solución. </li></ol> 4. Preparación de Positrones <ol><li> Retire la ranura para recoger la mayor cantidad de fluorescencia posible. </li><li> Ilumine la muestra con láser de baja potencia para evitar photobleaching. </li><li> Mueva la muestra en las tres direcciones utilizando el microposicionamiento syste por softwarem. Identificar para cada dirección de la coordenadas mínima y máxima para la cual se ilumina la muestra y está dentro del campo de visión de la cámara (Figura 4a). </li><li> Introduzca las coordenadas anteriores como parámetros para la subrutina &#39;Pre-tomografía&#39;. Especificar también la distancia entre las pilas adyacentes para ser utilizado en la tomografía, y el paso de muestreo de pre-tomografía en dirección z. </li><li> Inicie el pre-tomografía, que recoge las imágenes en cada pila con la toma de muestras z especificada en (4,4). </li></ol> Nota: Las imágenes recogidas se utilizan por un software para preparar un mapa aproximado de la forma del espécimen y la posición (Figura 4b), que permite la restricción de adquisición tomografía sólo para el volumen realmente ocupado por la muestra, reduciendo el tiempo de formación de imágenes y, por tanto photobleaching. 5. Tomografía de Adquisición <ol><li> Mueva la muestra fuera de la hoja de la luz utilizando el sistema microposicionamiento. </li><li> Incpotencia del láser Rease y detener el movimiento de todos los sistemas de escaneo, con el fin de iluminar sólo una línea fija en el centro del campo de visión. </li><li> Monte la hendidura y alinearlo utilizando la señal de autofluorescencia de la solución de limpieza. Usted debe ver claramente la línea de corte en el centro del campo de visión. </li><li> Vuelva a activar el sistema de exploración, reducir la potencia del láser y mover la muestra dentro de la hoja de la luz utilizando el sistema microposicionamiento. Tenga en cuenta que la potencia del láser utilizado con la ranura será más alta que la utilizada sin él, ya que los bloques de filtros espaciales una fracción no despreciable de la luz. </li><li> Ajuste la amplitud y el desplazamiento de los sistemas de la exploración y de-escaneo con el software de control, hasta que las imágenes se ven claras y brillantes. </li><li> Ejecute el software de adquisición de la tomografía, después de ajustar el paso z apropiado para el experimento. El volumen será reflejado en muchos paralelos, parcialmente pilas superpuestas (Figura 5), y las imágenes se guardarán enuna estructura jerárquica de carpetas. </li></ol> 6. Costuras y Visualización <ol><li> Completar el volumen adquirido con imágenes negras sintéticos (es decir, imágenes de un mismo tipo y dimensiones de los recogidos queridos-, pero con intensidad cero) utilizando un software automatizado (Figura 4c). Este paso es obligatorio para que el software de costura para hacer frente a un volumen cúbico completo. </li><li> Software Vaa3D lanzamiento (descargable gratuitamente desde <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> ) con los plugins instalados TeraStitcher y TeraManager. </li><li> Cargar el plug-in TeraStitcher. Seleccione el directorio que contiene el volumen reflejado, indicar las orientaciones relativas de los ejes (con respecto a una referencia para diestros sistema de coordenadas) y el tamaño de voxel. </li><li> Lanzamiento de la primera parte de la costura. El software calcula el desplazamiento relativo entre las parejas de pilas, y encontrar una Placem óptimo globalent para todas las pilas juntas (Figura 5b). </li><li> Seleccione para guardar el volumen cosido en una sola resolución o en formato multi-resolución. Este último permite a la multi-resolución de visualización con el plugin TeraManager. En ambos casos, si la imagen de mayor resolución es mayor que unos pocos gigabytes, seleccione también el multi-pila ahorro modalidad y especificar el tamaño del substacks individuales. Esto permitirá un acceso eficiente a los datos almacenados. </li><li> Inicie la segunda parte de la costura. El software se fusionará las pilas alineadas, y guardarlos en cualquiera de los modos-stack múltiples de una o (Figuras 5c y 5d). Al final cerrar el plugin TeraStitcher. </li><li> Cargar el plug-in TeraManager. Seleccione la carpeta con el volumen multi-resolución multi-apilado, e indicar el tamaño de voxel y hachas orientaciones. El volumen se cargará en la resolución mínima. </li><li> Para acercarse a una resolución mayor, seleccione un punto de referencia con el botón derecho del ratón modality de Vaa3D, entonces hacer un zoom mediante desplazamiento del ratón. Alternativamente, usted puede seleccionar directamente el retorno de la inversión para ampliar la imagen con el botón derecho del ratón, o especificar las coordenadas del volumen de interés. </li><li> Para volver a la resolución más baja, sólo tiene que utilizar el scroll del ratón. </li></ol>

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<li>Jahrling, N., Becker, K., Schonbauer, C., Schnorrer, F., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+and+segmentation+of+intact+Drosophila+by+ultramicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction and segmentation of intact Drosophila by ultramicroscopy.</a> Front Syst. Neurosci. 4, 1(2010).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

CLSM junto con la limpieza química representa una poderosa herramienta para el estudio de la neuroanatomía de los cerebros enteros de ratón marcado con sondas fluorescentes, proteínas o los tintes sintéticos. Dado que la luz emitida fuera del plano focal está bloqueado por un filtro espacial física, imágenes de alto contraste es posible también en muestras gruesas, mientras que el mantenimiento de las altas tasas de cuadros típicos de la arquitectura de lámina de luz. El principal problema para hacer frente a cuando se usan los métodos descritos es la maximización del contraste. De hecho, la señal disponible se reduce tanto por factores químicos y ópticos. Desde el punto de vista químico, los procedimientos de compensación basados ​​en disolventes orgánicos pueden saciar las emisiones a partir de proteínas fluorescentes y otros tintes fluorescentes 7. La filtración del disolvente para eliminar peróxidos, como se ha descrito por Becker et al. 10, permite el mantenimiento de un buen nivel de fluorescencia también en los tejidos de disolvente despejado. Publicarmétodos de compensación a base de agua ED 14 no reducen la eficiencia de fluorescencia, pero dan como resultado más pobre transparencia cuando se trata de cerebros enteros murinos, al menos con técnicas ópticas lineales. Por otro lado, por el momento no existen objetivos comerciales con distancia de trabajo corregidos por el alto índice de refracción (n ≈ 1,56) desatascar las soluciones utilizadas. Por lo tanto, el desajuste del índice de refracción entre el medio en el que se sumerge la muestra y el diseño de uno de los objetivos da lugar a fuertes aberraciones esféricas. Además de reducir la resolución del microscopio, tales aberraciones resultan en una caída de la intensidad de la imagen y el contraste, ya que la luz se esparce sobre un área más amplia. Las posibles soluciones para este problema incluyen el uso de óptica adaptativa 15 y / o correctores asféricas estáticas. Cualquier mejora en el contraste de la imagen y la intensidad afecta fácilmente también la velocidad de imagen, ya que una más corta entiempo de integración por imagen puede ser elegido. En el momento CLSM puede permitirse una velocidad de imagen de aproximadamente 10 6 m 3 / seg, con un tiempo de exposición de la cámara de 100 mseg 9. A esta velocidad se tarda 1-3 días para la imagen de un cerebro de ratón entero, dependiendo del tamaño de la muestra. Aunque sin degradación significativa de la calidad de la imagen se observa a lo largo de dicha sesión de imágenes de largo, en su mayoría debido a la baja fotoblanqueo intrínseca de hoja de luz de iluminación 6, el largo tiempo necesario para una sola imagen del cerebro del ratón, en la práctica podría reducir la aplicabilidad de CLSM. Un aumento de 10 veces en la eficiencia del sistema, junto con el uso de una cámara de alta velocidad para la detección, reduciría el tiempo de formación de imágenes para varias horas, lo que permite un uso rutinario del protocolo descrito. A pesar de todas las limitaciones mencionadas, CLSM imágenes junto a la limpieza química de los tejidos permite reconstruir los cerebros enteros de ratón con una resolución de escala micrométrica en menos de unsemana. Otros métodos ópticos para imágenes del cerebro entero ofrecen mayor resolución que CLSM, pero al precio de una preparación más prolongada y / o el tiempo de formación de imágenes 2-4, o de un z escasa toma de muestras 5. Los métodos descritos en este artículo se pueden usar en combinación con diferentes estrategias para el marcaje fluorescente: animales transgénicos que expresan proteínas fluorescentes en subconjuntos seleccionados neuronales, la transfección vírica, inyección de colorante intraparenquimatosa, etc En la práctica, todas las estrategias de tinción precedentes sacrificio de animales son compatibles con CLSM . De hecho, el marcaje fluorescente post-mortem de los cerebros enteros de ratón no se ha demostrado hasta ahora, de todos modos, si tal clase de tinción sería posible en un futuro próximo, el número de ejemplares que pueden ser reconstruidas con CLSM se convertirá en mucho más grande, potencialmente incluyendo el tejido cerebral humano. En conclusión, la microscopía confocal de lámina de luz utilizada en combinación con tisclaro sue y gestión de datos multi-resolución puede permitir a los investigadores reconstruir y analizar muestras macroscópicas de la resolución en la escala del micrón, con esfuerzos tecnológicos que están bien de la mano de la mayoría de los laboratorios. Las aplicaciones potenciales de MBRC son, por supuesto, no se limita a la neurociencia, pero se extiende por todos los campos de investigación en los que la microscopía de lámina de luz que ya se ha utilizado, como la embriogénesis 16,17 y la anatomía de los animales pequeños 18.

Cuando se compara a nuestra comprensión de la función cerebral subyacente mecanismos moleculares y celulares, nuestro conocimiento de la neuroanatomía se ve bien todavía en su infancia 1. De hecho, todavía carecemos de mapas detallados de la posición de los cuerpos celulares neuronales o de proyecciones a largo plazo en todo el cerebro. En realidad, muchos de los esfuerzos tecnológicos se dedican a reconstruir el cerebro del ratón con resolución microscópica. Los métodos ópticos basados ​​en la serie de corte de muestras embebido en resina, como Knife-Edge Scanning Microscopy (KESM) 2, Micro-óptica Seccionamiento Positrones (MOST) 3 y fluorescencia-MOST (fMOST) 4, puede proporcionar sub-micras de resolución en tres dimensiones imágenes de los cerebros enteros de ratón. Sin embargo, el tiempo total necesario para la preparación y formación de imágenes de una sola muestra es del orden de varias semanas, lo que limita la aplicación práctica de tales métodos. Otra técnica basada en el seccionamiento de serie (pero sin la incrustación de resina), de serie en dosPhoton tomografía (STP) 5, permite obtener imágenes de alta resolución en tres dimensiones. Sin embargo, esta técnica se ha demostrado en los cerebros de ratón enteros sólo con una toma de muestras muy escasa, la recogida de la sección 1 de cada 50 micras 5, y para nuestro conocimiento STP no han producido todavía una reconstrucción de muestreo completo de un cerebro murino. Un método óptico de última generación para reconstruir especímenes completos en tres dimensiones a gran velocidad es hoja de microscopía de luz 6. En este esquema óptico de la muestra es iluminada con una lámina delgada de luz y la emisión de fluorescencia se recoge a lo largo de un eje perpendicular al plano de iluminación. De esta manera sólo fluoróforos en foco están entusiasmados y es posible lograr seccionamiento óptico de configuración de campo amplia, garantizando alta velocidad de fotogramas. Cuando se acopla a la limpieza de los protocolos basados ​​en la sustitución de agua con un líquido de adaptación de índice de refracción 7, microscopía de hoja de luz se ha aplicado amuestras macroscópicas, como todo el cerebro del ratón 8. Sin embargo, la muestra inducida por dispersión de la luz, que afecta a los especímenes aún despejados, degrada la lámina de luz que conduce a la excitación de los fluoróforos fuera de foco que se suma un total desenfoque de las imágenes adquiridas. Para recoger selectivamente sólo los fotones en foco, hace poco acoplada luz de iluminación hoja a un esquema de detección confocal 9. En confocal de microscopía de luz de hoja (CLSM), fuera de foco y los fotones dispersados ​​son rechazados por un filtro espacial lineal (ITSL) antes de la detección (Figura 1). Para lograr un funcionamiento confocal en la arquitectura de lámina de luz, la iluminación se produce por medio de una línea de exploración, y un sistema de barrido en la trayectoria de detección crea una imagen estática de la línea de exploración de la excitación a la ubicación de la ranura. Un tercer sistema de escaneo reconstruye una imagen bidimensional en el sensor de la cámara. CLSM ofrece una mejora del contraste del 100% en el ratón despejadocerebros con respecto a la microscopía de luz convencional hoja, mientras se mantiene una tasa de 10 Hz marco. Con CLSM es posible reconstruir los cerebros enteros de ratón con la resolución de 2 micras de XY y 9 micras de Z, y con un contraste suficiente para discernir las neuronas sola etiqueta fluorescente. En este artículo describimos la tubería experimental de reconstruir un cerebro de ratón con CLSM. Cerebros de ratón de aldehído-fijo se deshidratan en una serie graduada de tetrahidrofurano exento de peróxidos y posteriormente liquidadas en libre de peróxido de dibencilo éter (Figura 2), siguiendo el protocolo desarrollado por Becker et al. 10 El espécimen limpiado luego se monta con cuidado sobre una punta placa y se coloca en la cámara de imágenes de un microscopio confocal de lámina de luz a medida. La muestra se puede montar directamente al sumergirse en una punta de la placa (Figura 3a), alternativamente, se puede pegar en un disco de gel de agarosa borrado (Figura3b) o colocado en la cavidad de un vaso de precipitados hecha de gel de agarosa borrado (Figura 3c). A continuación se realiza una tomografía óptica de todo el cerebro, como muchas pilas adyacentes paralelas se adquieren para cubrir todo el volumen del cerebro (Figura 4). Un muestreo de pre-tomografía, que produce un mapa aproximado de la posición de la muestra y la forma, garantiza que las imágenes se lleva a cabo sólo en el volumen ocupado por la muestra. Las pilas de tomografía son posteriormente cosidos con software a medida y se guardan en un esquema jerárquico de resolución múltiple 11. Cerebros de los ratones con el tiempo se pueden explorar con el software multi-resolución de visualización de Google Maps-como prototipos. Ambos instrumentos de software se integran como plugins en la plataforma de código abierto Vaa3D 12. Finalmente mostramos imágenes representativas de cerebros de ratón para demostrar las capacidades de la tubería experimental descrito en el estudio de multa neuroanatom murinoY.

<table><tbody><tr><td>Comprimidos de solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417_100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Agar Scientific</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano sin peróxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>186562</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de aluminio activado, básico, Brockmann I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199443</td><td></td></tr><tr><td>Éter dibencilo</td><td>Sigma-Aldrich 108014</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidroxitolueno butilado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W218405</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa Tipo III-A, Alto EEO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento acrílico</td><td>Bostik</td><td>D2498</td><td></td></tr><tr><td>Vaa3D software</td><td>de código</td><td></td> abierto <td>descargable gratuitamente desde <a href="http://www.vaa3d.org/" target="_blank">http://www.vaa3d.org/</a> </td></tr></tbody></table>

micron escala resolución óptica tomografía de cerebro de ratón enteras con hoja confocal microscopía de luz

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Descripción de la arquitectura del cerebro de los mamíferos con una resolución de una sola célula es una de las cuestiones clave de la neurociencia. Sin embargo, la cartografía de soma neuronal y las proyecciones a lo largo de todo el cerebro sigue siendo un reto para las tecnologías de imagen y gestión de datos. De hecho, los volúmenes macroscópicos necesitan ser reconstruido con alta resolución y contraste en un plazo razonable, la producción de conjuntos de datos en el rango terabyte. Recientemente hemos demostrado un método óptico (microscopía confocal de luz de hoja, CLSM), capaces de alcanzar la reconstrucción a escala micrométrica de cerebros enteros de ratón marcado con aumento de proteína verde fluorescente (EGFP). La combinación de luz de iluminación general y de detección confocal, CLSM permite obtener imágenes en el interior de las muestras macroscópicas compensados ​​con un alto contraste y velocidad. Aquí se describe la tubería experimental completa para obtener imágenes completas y legibles de los cerebros enteros de ratón marcadas con proteínas fluorescentes. La compensación y la p de montajeROCEDIMIENTOS se describen, junto con los pasos para realizar una tomografía óptica en todo su volumen mediante la adquisición de muchas pilas adyacentes paralelas. Demostramos el uso de herramientas de software a medida de código abierto que permite la costura de las múltiples pilas y navegación de datos multi-resolución. Por último, hemos ilustrado algunos ejemplos de mapas cerebrales: el cerebelo de un ratón transgénico L7-GFP, en la que todas las células de Purkinje están etiquetados de forma selectiva, y todo el cerebro de un ratón Thy1-GFP-H, caracterizado por un etiquetado neuronal escasa aleatoria.

El protocolo descrito se puede utilizar para reconstruir con la resolución, ya sea cerebros de ratón enteros a escala micrométrica o partes escindidas, sin la necesidad de seccionamiento física. Como resultado representativo, en la figura 6 se muestra todo el cerebelo de un ratón L7-GFP (día postnatal 10). En este animal todas las neuronas de Purkinje están etiquetados con EGFP. Si nos acercamos, la estructura laminar típica de la corteza cerebelosa puede verse (Figura 7). Además, en el zoom permite distinguir claramente cada soma de células de Purkinje (Figura 8). El protocolo descrito por lo tanto se puede utilizar para detectar organización espacial neuronal en diversos estudios del desarrollo neurológico. Como segundo resultado representativo, se presentan las imágenes del cerebro de un unsectioned thy1-GFP-M de ratón adulto. En este animal transgénico EGFP se expresa en un subconjunto neuronal escasa aleatoria. La mitad derecha del cerebro se muestra en la Figura 9. Comozoom-in más y más (Figuras 10 y 11), los procesos neuronales se vuelven distinguibles. Este resultado demuestra que el protocolo descrito permite formación de imágenes de resolución a escala micrométrica en los cerebros enteros de ratón adulto, abriendo la posibilidad de estudiar la anatomía de todo el cerebro en resolución celular en modelos de ratón de enfermedad neurodegenerativa. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema óptico confocal de microscopía de luz de hoja (CLSM). (A) Vista superior del aparato, mostrando la vía de excitación. Emisión láser desde un estado sólido (DPSS) láser bombeado por diodo de 488 nm, después de la expansión y la colimación por un primer telescopio, entra en un filtro sintonizable acústico-óptico (AOTF) que regula la intensidad del haz. Luego, un segundo telescopio amplía aún más la viga. Un espejo galvo el vertical (y) explora el ser<html> am, que se centra por una lente dentro de la cámara de la muestra. (b) Vista lateral del aparato, mostrando la vía de detección. Luz recogida por el objetivo de detección se descanned verticalmente por un espejo galvo y enfocada por una lente, produciendo una imagen fija de la línea de excitación en movimiento. En la posición de la imagen fija se coloca un filtro espacial lineal (hendidura). Después de la hendidura, un espejo galvo colocado dentro de un sistema de lentes 4f reconstruye una imagen 2-dimensional en el chip de un dispositivo de acoplamiento de carga de electrones multiplicando (EM-CCD). Un filtro de paso de banda de fluorescencia eliminar toda la luz difusa de excitación antes de la detección. Rayos representativos de excitación, la detección y la luz de detección de paso de banda con filtro son representados por los rayos azules y verdes azules, luz, respectivamente. Las distancias focales de todos los lentes realmente utilizados en el microscopio se indican. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50696/50696fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig2.jpg" /> Figura 2. Compensación de la pieza. Cerebros de ratón fijadas con formaldehído, que se almacenan en PBS 0,1 M a 4 ° C (a), se deshidratan en una serie graduada de tetrahidrofurano (THF, b) y, posteriormente, se aclaró en 100% de dibencil-éter (DBE , c). La etapa de deshidratación provoca también una cierta contracción del tejido. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig3.jpg" /> Figura 3. De la pieza de montaje para la formación de imágenes CLSM. El cerebro aclarado puede ser sumergida directamente en la placa de montaje con punta (a), pegada sobre un disco de agarosa borrado (b), o insertado en un vaso de precipitados de agarosa (c) aclarado. Figura 4. Adquisición de Positrones. Los pre-tomografía muestras de rutina de un paralelepípedo que contiene el cerebro (a) para definir el número y la duración de las pilas adyacentes paralelos necesarios para la imagen de todo el espécimen (b). Después de la tomografía, imágenes en negro se generan para completar el volumen adquirido virtual a un paralelepípedo (c). <img alt="La figura 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig5.jpg" /> Figura 5. Costura Volumen. La imagen obtenida se acumula se solapan parcialmente entre sí (a), lo que permite su alineación precisa con el plugin TeraStitcher (b). El plugin continuación, combina las pilas alineadas en un único apilados (c) o multi-stacked (d) la representación multi-resolución. <img alt="La figura 6" fo:conteint-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig6.jpg" /> Figura 6. Todo el cerebelo de un ratón L7-GFP P10, en el que todas las neuronas de Purkinje están etiquetados con EGFP. Barra de escala, 1 mm. <img alt="La figura 7" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig7.jpg" /> Figura 7. Zoom-en de una porción del cerebelo se muestra en la Figura 6, que muestra la estructura laminar típica de la corteza cerebelosa. Barra de escala, 500 micras. <img alt="Figura 8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig8.jpg" /> Figura 8. Además de zoom-en de una porción del cerebelo se muestra en la Figura 6. Células de Purkinje soma puede ser claramente distinguired. La barra de escala, 200 m. <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig9.jpg" /> La Figura 9. La mitad derecha del cerebro de un thy1-GFP-M ratón adulto, que se caracteriza por una escasa inespecíficos etiquetado EGFP neuronal. Barra de escala, 1 mm. <img alt="Figura 10" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig10.jpg" /> Figura 10. Zoom-en de una porción de la mitad del cerebro se muestra en la Figura 9, que muestra parte del hipocampo y de la corteza. Barra de escala, 200 micras. <img alt="Figura 11" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50696/50696fig11.jpg" /> Figura 11. Además del zoom-in de una porción de la mitad del cerebro se muestra en la Figura 9. Varios axones en la corteza pueden distinguirse claramente. La barra de escala, 50 micras.

En este artículo se describe el procedimiento experimental completo para reconstruir, con alta resolución, la anatomía del cerebro multa de cerebros de ratón marcados con fluorescencia. El protocolo descrito incluye la preparación de muestras y el desmonte, la muestra de montaje para imágenes, datos post-procesamiento y visualización multi-escala.

Micron escala Resolución óptica tomografía de cerebro de ratón enteras con Hoja confocal Microscopía de Luz

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

El objetivo general de este procedimiento es reconstruir y visualizar un cerebro de ratón completo con resolución a escala micrométrica. Esto se logra primero deshidratando un cerebro de ratón fijado integrado en una serie de tetrahedranos. El segundo paso consiste en aclarar la muestra en éter bencílico.A continuación, se obtiene una imagen del cerebro mediante un microscopio confocal de hoja de luz. El paso final consiste en utilizar un software para alinear y unir las pilas de imágenes adquiridas. En última instancia, se puede utilizar una herramienta de visualización de múltiples resoluciones para navegar por el volumen de imagen reconstruido.La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos como la microscopía confocal o la microscopía óptica es que se puede obtener una imagen del volumen completo de un cerebro de ratón en tan solo unos días. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como la distribución de diferentes tipos neuronales en todo el cerebro. ¿Proporciona esta cubierta metálica información sobre la autonomía cerebral fina?También puede aplicarse a embriones de ratón o moscas de los pies, demostrando que el procedimiento se reanudará. Un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para comenzar este protocolo, realice la fijación estándar de cerebros de ratón mediante perfusión transcardial y postfije durante la noche antes de realizar la deshidratación y la clarificación.Luego, dado que el disolvente de deshidratación, THF, apaga fuertemente la fluorescencia de XFP, realice una filtración para eliminar los peróxidos mediante óxido de aluminio activado básico utilizando una columna de cromatografía; evite la formación de grietas en la columna, ya que reduciría la eliminación de peróxidos al añadir un estabilizante a la solución final. Incluso si el THF ya estaba estabilizado antes de la filtración, el estabilizante será retenido por el óxido de aluminio. Tenga en cuenta que el THF sin estabilizante puede generar grandes cantidades de peróxidos y puede ser explosivo y peligroso.A continuación, deshidrate el cerebro completo del ratón mediante una serie escalonada de THF en agua pura. Luego, coloque el vial con la muestra sobre una rueda rotatoria para evitar la exposición a la luz. Envuelva el vial con papel de aluminio.Finalmente, filtre el disolvente de clarificación con óxido de aluminio utilizando un embudo de filtración. Luego, aclare la muestra en DBE al 100 %, cambiando la solución tras tres y seis horas cuando el cerebro aparezca transparente. Normalmente, una hora después del segundo cambio de DBE, monte la muestra sobre una placa de imagenología inclinada mediante uno de los métodos mostrados aquí.Montaje directo mediante disco agros o montaje mediante un altavoz agro para montaje directo, introduzca suavemente la muestra en una de las puntas para utilizar el disco de inmersión aros. Un disco hecho de gel aros al 6 % sobre las puntas. Luego, fije suavemente la muestra al disco agros con pegamento acrílico y espere aproximadamente un minuto para que cure antes de montarla.Utilizando el embudo de agros, coloque un vaso de precipitados hecho de gel de agros al 3% sobre las puntas. Luego, coloque suavemente la muestra en el fondo del vaso de precipitados. Después de montar el espécimen siguiendo uno de estos métodos, coloque la placa de imagen dentro de la cámara del espécimen usando pinzas.Luego, llene la cámara con solución de clarificación. A continuación, prepárese para la tomografía. Primero, retire la rendija para recoger la mayor cantidad posible de fluorescencia y, luego, ilumine la muestra con baja potencia láser.Para evitar el fotoblanqueo, mueva la muestra en las tres direcciones x, y y Z utilizando el sistema de micro-posicionamiento controlado por software. Para cada dirección, identifique las coordenadas mínima y máxima para las cuales la muestra esté iluminada mientras se encuentra dentro del campo de visión de la cámara. Luego, inserte las coordenadas determinadas como parámetros para la subrutina previa a la tomografía.Asimismo, especifique la distancia entre pilas adyacentes que se utilizará en la tomografía y en el paso de muestreo previo a la tomografía en la dirección Z. Finalmente, inicie la tomografía previa, que recopilará las imágenes en cada pila con los parámetros de muestreo en Z especificados en el paso anterior. Para comenzar la adquisición, primero mueva la muestra fuera del plano de luz utilizando el sistema de micro-posicionamiento.Luego, aumente la potencia del láser y detenga el movimiento de todos los sistemas de escaneo para iluminar únicamente una línea fija en el centro del campo de visión. A continuación, coloque la rendija y alinéela utilizando la señal de autofluorescencia de la solución de clarificación. Ahora debería ver claramente la línea de la rendija en el centro del campo de visión.Ahora reactive el sistema de escaneo. Reduzca la potencia del láser y mueva la muestra dentro de la lámina de luz utilizando el sistema de micro posicionamiento. Tenga en cuenta que la potencia del láser utilizada con la rendija será mayor que la utilizada sin ella.Dado que el filtro espacial bloquea una fracción no despreciable de luz, ajuste la amplitud y el desplazamiento de los sistemas de escaneo y escaneo d mediante el software de control hasta que las imágenes se vean nítidas y brillantes. Luego, establezca el paso Z adecuado para el experimento y ejecute el software de adquisición de tomografía. El volumen será imagenado en muchas series paralelas y parcialmente superpuestas, y las imágenes se guardarán en una estructura jerárquica de carpetas.Para que el software de ensamblaje funcione con un volumen cúbico completo, complemente el volumen adquirido con imágenes negras sintéticas, es decir, imágenes del mismo tipo y dimensiones que las recolectadas, pero con intensidad cero, utilizando software automatizado. A continuación, inicie el software VA A 3D con los complementos Terra, Stitcher y Tarly instalados, y cargue el complemento Terra Stitcher. Seleccione el directorio que contiene el volumen imagenado e indique las orientaciones relativas de los ejes con respecto a un sistema de coordenadas dextrógiro de referencia y el tamaño del vóxel.Ahora inicie la primera parte del ensamblaje. El software calculará el desplazamiento relativo entre pares de pilas y encontrará una colocación óptima general para todas las pilas juntas; seleccione guardar el volumen ensamblado en formato de resolución única o en formato de múltiple resolución. La escalera permite la visualización de múltiple resolución con el complemento tarly.En ambos casos, si la imagen de mayor resolución es más grande que unos pocos gigabytes, seleccione también el modo de guardado múltiple y especifique el tamaño de las subpilas individuales. Esto permitirá un acceso eficiente a los datos almacenados. Ahora inicie la segunda parte del ensamblaje.El software fusionará las pilas alineadas y las guardará en modo individual o múltiple. Una vez finalizado, cierre el complemento Terra Stitcher. A continuación, cargue el complemento terra fly.Seleccione la carpeta con el volumen multicanal de múltiples resoluciones e indique el tamaño del agujero y las orientaciones de los ejes. El volumen se cargará con la resolución mínima. Para acercarse a una resolución más alta, simplemente use la rueda del ratón.Alternativamente, se puede hacer doble clic en un punto específico de la imagen, seleccionar hacer zoom alrededor de un punto de referencia existente o especificar directamente las coordenadas del volumen de interés. Para regresar a una resolución más baja, simplemente use la rueda del ratón. El protocolo descrito puede utilizarse para reconstruir con resolución a escala micrométrica cerebros completos de ratón o partes extirpadas sin necesidad de seccionamiento físico.Como resultado representativo, aquí se muestra el cerebelo completo de un ratón L siete GFP del día 10 posnatal en este animal. Todas las neuronas del gen Perkin están marcadas con EGFP. Tras acercar la imagen, puede observarse la estructura laminar típica de la corteza cerebelosa; un mayor acercamiento permite distinguir claramente el soma de cada célula burkini.Por lo tanto, el protocolo descrito puede utilizarse para analizar la organización espacial neuronal en diversos estudios de neurodesarrollo. Como segundo resultado representativo, aquí podemos observar imágenes de la sección de cerebro UN de un muslo adulto, de un ratón GFPM. En este animal transgénico, EGFP se expresa en un subconjunto neuronal aleatorio y disperso.Se muestra aquí la mitad derecha del cerebro. A medida que aumentamos el zoom, los procesos neuronales se vuelven distinguibles. Este resultado demuestra que el protocolo descrito permite obtener imágenes con resolución a escala micrométrica en cerebros completos de ratones adultos, abriendo la posibilidad de estudiar la anatomía de todo el cerebro a resolución celular.En modelos murinos de enfermedades neurodegenerativas, una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres o cuatro días si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar filtrar adecuadamente la solución de deshidratación y limpieza para preservar la fluorescencia de GFP. La herramienta de visualización de múltiple resolución presentada aquí también puede utilizarse para explorar conjuntos de datos muy grandes obtenidos con otras técnicas, como la sección óptica microscópica en tomografía.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo datar, clasificar y aclarar el cerebro fijado de ratón. Imagenelo mediante microscopía de hoja confocal y visualice el volumen reconstruido en 3D con realidad virtual utilizando el complemento Tely.

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Neurociencia

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