Micron escala Resolución óptica tomografía de cerebro de ratón enteras con Hoja confocal Microscopía de Luz

El objetivo general de este procedimiento es reconstruir y visualizar un cerebro de ratón completo con una resolución a escala micrométrica. Esto se logra mediante la deshidratación inicial, una serie de tetraedros integrados en el cerebro fijo del ratón. El segundo paso es limpiar la muestra en éter bencílico.

A continuación, se obtienen imágenes del cerebro con un microscopio de lámina de luz confocal. El último paso es utilizar un software para alinear y unir las pilas de imágenes adquiridas. En última instancia, se puede utilizar una herramienta de visualización de resolución múltiple para navegar por el volumen de la imagen reconstruida.

La principal ventaja de esta técnica de otros métodos como el confocal o la fotomicroscopía es que se puede obtener una imagen del volumen completo del cerebro de un ratón en tan solo unos días. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como la distribución de diferentes tipos de neuronas en todo el cerebro. ¿Esta tapa metálica proporciona información sobre la autonomía del cerebro fino?

También se puede aplicar a embriones de ratón o moscas de pie, lo que demuestra que el procedimiento será reiniciado. Un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para comenzar este protocolo, realice la fijación estándar de cerebros de ratones a través de trans cardio perfusión y postfijo durante la noche antes de realizar la deshidratación y la limpieza.

Luego, dado que el solvente de deshidratación, THF apaga fuertemente la fluorescencia XFP y realiza una filtración para eliminar los peróxidos con óxido de aluminio activado básico utilizando una columna de cromatografía, evite el agrietamiento de la columna, lo que reduciría la eliminación de peróxido en un estabilizador hasta la solución final. Incluso si el THF ya estaba estabilizado antes de la filtración, el estabilizador será retenido por el óxido de aluminio. Tenga en cuenta que el THF sin estabilizador puede desarrollar grandes cantidades de peróxidos y puede ser explosivo y peligroso.

A continuación, deshidrate toda la serie integrada del cerebro del ratón de THF en agua pura. A continuación, coloque el vial con la muestra en una rueda giratoria para evitar la exposición a la luz. Envuelva el frasco con papel de aluminio.

Finalmente, filtre el solvente de limpieza con óxido de aluminio usando un embudo de filtración. A continuación, limpie la muestra al 100% de DBE, cambiando la solución a las tres y seis horas cuando el cerebro parece transparente. Por lo general, una hora después del segundo cambio de DBE, móntelo en una placa de imagen con punta mediante uno de los métodos que se ven aquí.

Montaje directo montaje a través de un disco agros o montaje a través de un altavoz agro para el montaje directo, sumerja suavemente la muestra en una de las puntas para utilizar el disco de inmersión aros. Un disco hecho de gel de 6%aros en las puntas. A continuación, fije suavemente la muestra en el disco agros con cola acrílica y espere aproximadamente un minuto para que se acumule el curado.

Usando el vaso de precipitados agros plunge, un vaso de precipitados hecho de gel 3%agros en las puntas. A continuación, coloque suavemente la muestra en el fondo del vaso de precipitados. Después de montar la muestra siguiendo uno de estos métodos, coloque la placa de imagen dentro de la cámara de la muestra con pinzas.

A continuación, llene la cámara con solución limpiadora. A continuación, prepárese para la tomografía. Primero, retire la rendija para recolectar la mayor cantidad de fluorescencia posible y luego ilumine la muestra con baja potencia láser.

Para evitar el fotoblanqueo, mueva la muestra en las tres direcciones x, y y Z utilizando el sistema de microposicionamiento controlado por software. Para cada dirección, identifique las coordenadas mínimas y máximas para las que se ilumina la muestra mientras se encuentra dentro del campo de visión de la cámara. A continuación, inserte las coordenadas determinadas como parámetros para la subrutina de pretomografía.

Especifique también la distancia entre las pilas adyacentes que se utilizarán en la tomografía y el paso de muestreo previo a la tomografía en la dirección Z. Finalmente, inicie la pretomografía, que recogerá las imágenes en cada pila con los parámetros de muestreo Z como se especificó en el paso anterior. Para comenzar la adquisición, primero, mueva la muestra fuera de la lámina de luz utilizando el sistema de microposicionamiento.

A continuación, aumente la potencia del láser y detenga el movimiento de todos los sistemas de escaneo para iluminar sólo una línea fija en el centro del campo de visión. A continuación, monte la ranura y alinéela utilizando la señal autofluorescente de la solución de limpieza. Ahora debería ver claramente la línea de hendidura en el centro del campo de visión.

Ahora vuelva a activar el sistema de escaneo. Reduzca la potencia del láser y mueva la muestra dentro de la lámina de luz mediante el sistema de microposicionamiento. Tenga en cuenta que la potencia del láser utilizada con la ranura será mayor que la utilizada sin ella.

Dado que el filtro espacial bloquea una fracción no despreciable de luz, ajuste la amplitud y el desplazamiento de los sistemas de escaneo y escaneo d con el software de control hasta que las imágenes se vean claras y brillantes. A continuación, establezca el paso Z adecuado para el experimento y ejecute el software de adquisición de tomografías. El volumen se visualizará en muchas pilas paralelas y parcialmente superpuestas, y las imágenes se guardarán en una estructura de carpetas jerárquica.

Para que el software de costura funcione con un volumen cúbico completo, complete el volumen adquirido con imágenes negras sintéticas, es decir, imágenes del mismo tipo y dimensiones de las recopiladas, pero con intensidad cero utilizando software automatizado. A continuación, inicie el software VA A 3D con los complementos, Terra, Stitcher y tarly instalados y cargue el complemento Terra Stitcher. Seleccione el directorio que contiene el volumen de la imagen e indique las orientaciones relativas de los ejes con respecto a un sistema de coordenadas diestro de referencia y el tamaño del vóxel.

Ahora inicie la primera parte de la costura. El software calculará el desplazamiento relativo entre pares de pilas y encontrará una ubicación óptima general para todas las pilas juntas, seleccionará guardar el volumen unido en una sola resolución o en formato de resolución múltiple. La escalera permite la visualización de múltiples resoluciones con el complemento tarly.

En ambos casos, si la imagen de mayor resolución es mayor que unos pocos gigabytes, seleccione también la modalidad de guardado de varias pilas y especifique el tamaño de las subpilas individuales. Esto permitirá un acceso eficiente a los datos almacenados. Ahora inicie la segunda parte de la costura.

El software fusionará las pilas alineadas y las guardará en modo de pila única o múltiple. Cuando haya terminado, cierre el complemento Terra Stitcher. A continuación, cargue el complemento terra fly.

Seleccione la carpeta con el volumen de resolución múltiple de pila múltiple e indique el tamaño de la trinchera y las orientaciones de los ejes. El volumen se cargará a la resolución mínima. Para hacer zoom a una resolución más alta, simplemente use el desplazamiento del mouse.

Alternativamente, se puede hacer doble clic en un punto específico de la imagen o seleccionar acercar un punto de referencia existente o especificar directamente las coordenadas del volumen de interés. Para volver a una resolución más baja, simplemente use el desplazamiento del mouse. El protocolo descrito se puede utilizar para reconstruir con una resolución a escala micrométrica cerebros de ratón enteros o partes extirpadas sin necesidad de corte físico.

Como resultado representativo, aquí se muestra en este animal todo el cerebelo de un ratón L seven GFP después del día 10. Todas las neuronas del gen Perkin están marcadas con EGFP. Después de hacer zoom se puede ver la estructura laminar típica de la corteza cerebelosa, un mayor acercamiento permite distinguir claramente cada soma de células de burkini.

Por lo tanto, el protocolo descrito se puede utilizar para evaluar la organización espacial neuronal en varios estudios de neurodesarrollo. Como segundo resultado representativo, aquí podemos ver imágenes del cerebro seccionado por la ONU de un muslo adulto, un ratón GFPM. En este animal transgénico, el EGFP se expresa en un subconjunto neuronal disperso aleatorio.

Aquí se muestra la mitad derecha del cerebro. A medida que nos acercamos más y más, los procesos neuronales se vuelven distinguibles. Este resultado demuestra que el protocolo descrito permite obtener imágenes con resolución a escala micrométrica en cerebros completos de ratones adultos, lo que abre la posibilidad de estudiar la anatomía de todo el cerebro a resolución celular.

En modelos de ratón de enfermedades neurodegenerativas, una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres o cuatro días si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar filtrar adecuadamente la deshidratación y la solución de limpieza para preservar la fluorescencia de GFP. La herramienta de visualización de resolución múltiple que se presenta aquí también se puede utilizar para explorar conjuntos de datos muy grandes obtenidos con otras técnicas, como la sección microóptica en tomografía.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo fechar, calificar y borrar el cerebro fijo del ratón. Visualícelos con microscopía de lámina confocal y visualice el volumen reconstruido con el VR 3D utilizando el complemento Tely.