Micron escala Resolución óptica tomografía de cerebro de ratón enteras con Hoja confocal Microscopía de Luz

El objetivo general de este procedimiento es reconstruir y visualizar un cerebro de ratón completo con resolución a escala micrométrica. Esto se logra primero deshidratando un cerebro de ratón fijado integrado en una serie de tetrahedranos. El segundo paso consiste en aclarar la muestra en éter bencílico.

A continuación, se obtiene una imagen del cerebro mediante un microscopio confocal de hoja de luz. El paso final consiste en utilizar un software para alinear y unir las pilas de imágenes adquiridas. En última instancia, se puede utilizar una herramienta de visualización de múltiples resoluciones para navegar por el volumen de imagen reconstruido.

La principal ventaja de esta técnica frente a otros métodos como la microscopía confocal o la microscopía óptica es que se puede obtener una imagen del volumen completo de un cerebro de ratón en tan solo unos días. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como la distribución de diferentes tipos neuronales en todo el cerebro. ¿Proporciona esta cubierta metálica información sobre la autonomía cerebral fina?

También puede aplicarse a embriones de ratón o moscas de los pies, demostrando que el procedimiento se reanudará. Un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para comenzar este protocolo, realice la fijación estándar de cerebros de ratón mediante perfusión transcardial y postfije durante la noche antes de realizar la deshidratación y la clarificación.

Luego, dado que el disolvente de deshidratación, THF, apaga fuertemente la fluorescencia de XFP, realice una filtración para eliminar los peróxidos mediante óxido de aluminio activado básico utilizando una columna de cromatografía; evite la formación de grietas en la columna, ya que reduciría la eliminación de peróxidos al añadir un estabilizante a la solución final. Incluso si el THF ya estaba estabilizado antes de la filtración, el estabilizante será retenido por el óxido de aluminio. Tenga en cuenta que el THF sin estabilizante puede generar grandes cantidades de peróxidos y puede ser explosivo y peligroso.

A continuación, deshidrate el cerebro completo del ratón mediante una serie escalonada de THF en agua pura. Luego, coloque el vial con la muestra sobre una rueda rotatoria para evitar la exposición a la luz. Envuelva el vial con papel de aluminio.

Finalmente, filtre el disolvente de clarificación con óxido de aluminio utilizando un embudo de filtración. Luego, aclare la muestra en DBE al 100 %, cambiando la solución tras tres y seis horas cuando el cerebro aparezca transparente. Normalmente, una hora después del segundo cambio de DBE, monte la muestra sobre una placa de imagenología inclinada mediante uno de los métodos mostrados aquí.

Montaje directo mediante disco agros o montaje mediante un altavoz agro para montaje directo, introduzca suavemente la muestra en una de las puntas para utilizar el disco de inmersión aros. Un disco hecho de gel aros al 6 % sobre las puntas. Luego, fije suavemente la muestra al disco agros con pegamento acrílico y espere aproximadamente un minuto para que cure antes de montarla.

Utilizando el embudo de agros, coloque un vaso de precipitados hecho de gel de agros al 3% sobre las puntas. Luego, coloque suavemente la muestra en el fondo del vaso de precipitados. Después de montar el espécimen siguiendo uno de estos métodos, coloque la placa de imagen dentro de la cámara del espécimen usando pinzas.

Luego, llene la cámara con solución de clarificación. A continuación, prepárese para la tomografía. Primero, retire la rendija para recoger la mayor cantidad posible de fluorescencia y, luego, ilumine la muestra con baja potencia láser.

Para evitar el fotoblanqueo, mueva la muestra en las tres direcciones x, y y Z utilizando el sistema de micro-posicionamiento controlado por software. Para cada dirección, identifique las coordenadas mínima y máxima para las cuales la muestra esté iluminada mientras se encuentra dentro del campo de visión de la cámara. Luego, inserte las coordenadas determinadas como parámetros para la subrutina previa a la tomografía.

Asimismo, especifique la distancia entre pilas adyacentes que se utilizará en la tomografía y en el paso de muestreo previo a la tomografía en la dirección Z. Finalmente, inicie la tomografía previa, que recopilará las imágenes en cada pila con los parámetros de muestreo en Z especificados en el paso anterior. Para comenzar la adquisición, primero mueva la muestra fuera del plano de luz utilizando el sistema de micro-posicionamiento.

Luego, aumente la potencia del láser y detenga el movimiento de todos los sistemas de escaneo para iluminar únicamente una línea fija en el centro del campo de visión. A continuación, coloque la rendija y alinéela utilizando la señal de autofluorescencia de la solución de clarificación. Ahora debería ver claramente la línea de la rendija en el centro del campo de visión.

Ahora reactive el sistema de escaneo. Reduzca la potencia del láser y mueva la muestra dentro de la lámina de luz utilizando el sistema de micro posicionamiento. Tenga en cuenta que la potencia del láser utilizada con la rendija será mayor que la utilizada sin ella.

Dado que el filtro espacial bloquea una fracción no despreciable de luz, ajuste la amplitud y el desplazamiento de los sistemas de escaneo y escaneo d mediante el software de control hasta que las imágenes se vean nítidas y brillantes. Luego, establezca el paso Z adecuado para el experimento y ejecute el software de adquisición de tomografía. El volumen será imagenado en muchas series paralelas y parcialmente superpuestas, y las imágenes se guardarán en una estructura jerárquica de carpetas.

Para que el software de ensamblaje funcione con un volumen cúbico completo, complemente el volumen adquirido con imágenes negras sintéticas, es decir, imágenes del mismo tipo y dimensiones que las recolectadas, pero con intensidad cero, utilizando software automatizado. A continuación, inicie el software VA A 3D con los complementos Terra, Stitcher y Tarly instalados, y cargue el complemento Terra Stitcher. Seleccione el directorio que contiene el volumen imagenado e indique las orientaciones relativas de los ejes con respecto a un sistema de coordenadas dextrógiro de referencia y el tamaño del vóxel.

Ahora inicie la primera parte del ensamblaje. El software calculará el desplazamiento relativo entre pares de pilas y encontrará una colocación óptima general para todas las pilas juntas; seleccione guardar el volumen ensamblado en formato de resolución única o en formato de múltiple resolución. La escalera permite la visualización de múltiple resolución con el complemento tarly.

En ambos casos, si la imagen de mayor resolución es más grande que unos pocos gigabytes, seleccione también el modo de guardado múltiple y especifique el tamaño de las subpilas individuales. Esto permitirá un acceso eficiente a los datos almacenados. Ahora inicie la segunda parte del ensamblaje.

El software fusionará las pilas alineadas y las guardará en modo individual o múltiple. Una vez finalizado, cierre el complemento Terra Stitcher. A continuación, cargue el complemento terra fly.

Seleccione la carpeta con el volumen multicanal de múltiples resoluciones e indique el tamaño del agujero y las orientaciones de los ejes. El volumen se cargará con la resolución mínima. Para acercarse a una resolución más alta, simplemente use la rueda del ratón.

Alternativamente, se puede hacer doble clic en un punto específico de la imagen, seleccionar hacer zoom alrededor de un punto de referencia existente o especificar directamente las coordenadas del volumen de interés. Para regresar a una resolución más baja, simplemente use la rueda del ratón. El protocolo descrito puede utilizarse para reconstruir con resolución a escala micrométrica cerebros completos de ratón o partes extirpadas sin necesidad de seccionamiento físico.

Como resultado representativo, aquí se muestra el cerebelo completo de un ratón L siete GFP del día 10 posnatal en este animal. Todas las neuronas del gen Perkin están marcadas con EGFP. Tras acercar la imagen, puede observarse la estructura laminar típica de la corteza cerebelosa; un mayor acercamiento permite distinguir claramente el soma de cada célula burkini.

Por lo tanto, el protocolo descrito puede utilizarse para analizar la organización espacial neuronal en diversos estudios de neurodesarrollo. Como segundo resultado representativo, aquí podemos observar imágenes de la sección de cerebro UN de un muslo adulto, de un ratón GFPM. En este animal transgénico, EGFP se expresa en un subconjunto neuronal aleatorio y disperso.

Se muestra aquí la mitad derecha del cerebro. A medida que aumentamos el zoom, los procesos neuronales se vuelven distinguibles. Este resultado demuestra que el protocolo descrito permite obtener imágenes con resolución a escala micrométrica en cerebros completos de ratones adultos, abriendo la posibilidad de estudiar la anatomía de todo el cerebro a resolución celular.

En modelos murinos de enfermedades neurodegenerativas, una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres o cuatro días si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar filtrar adecuadamente la solución de deshidratación y limpieza para preservar la fluorescencia de GFP. La herramienta de visualización de múltiple resolución presentada aquí también puede utilizarse para explorar conjuntos de datos muy grandes obtenidos con otras técnicas, como la sección óptica microscópica en tomografía.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo datar, clasificar y aclarar el cerebro fijado de ratón. Imagenelo mediante microscopía de hoja confocal y visualice el volumen reconstruido en 3D con realidad virtual utilizando el complemento Tely.