Name: Un ensayo de exonucleasa basado en fluorescencia para caracterizar DmWRNexo, ortólogo de la exonucleasa WRN progeroide humana, y su aplicación a otras nucleasas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Aprende a medir la actividad exonucleasa mediante un ensayo fluorescente reproducible que utiliza sustratos de ADN marcados. Este método permite cuantificar la degradación enzimática y determinar condiciones óptimas de reacción de forma segura.

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Agradecemos al Programa de Nueva Dinámica del Envejecimiento por financiar este trabajo [ES/G037086/1] y al Prof. Dave Sherratt (Departamento de Bioquímica, Universidad de Oxford) por el acceso al Fuji FLA-3000.

<ol><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%22%5BJournal%5D)">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr. 34, 1317-1340 (2012).</li>
<li>Payne, M., Hickson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+instability+and+cancer%3A+lessons+from+analysis+of+Bloom%27s+syndrome%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Genomic instability and cancer: lessons from analysis of Bloom's syndrome).</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 553-559 (2009).</li>
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<li>Huang, S., Li, B., Gray, M. D., Oshima, J., Mian, I. S., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+premature+ageing+syndrome+protein%2C+WRN%2C+is+a+3%27--%3E5%27+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The premature ageing syndrome protein, WRN, is a 3'-->5' exonuclease.</a> Nat. Genet. 20, 114-116 (1998).</li>
<li>Goto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndrome-causing+mutations+in+Werner+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci.+Trends%22%5BJournal%5D)">Syndrome-causing mutations in Werner syndrome.</a> Biosci. Trends. 2, 147-150 (2008).</li>
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<li>Opresko, P. L., Laine, J. P., Brosh, R. M., Seidman, M. M., Bohr, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+action+of+the+helicase+and+3%27+to+5%27+exonuclease+of+Werner+syndrome+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coordinate action of the helicase and 3' to 5' exonuclease of Werner syndrome protein.</a> J. Biol. Chem. 276, 44677-44687 (2001).</li>
<li>Plchova, H., Hartung, F., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+an+exonuclease+from+Arabidopsis+thaliana+reveals+similarities+to+the+DNA+exonuclease+of+the+human+Werner+syndrome+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of an exonuclease from Arabidopsis thaliana reveals similarities to the DNA exonuclease of the human Werner syndrome protein.</a> J. Biol. Chem. 278, 44128-44138 (2003).</li>
<li>Hartung, F., Plchova, H., Puchta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterisation+of+RecQ+homologues+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular characterisation of RecQ homologues in Arabidopsis thaliana.</a> Nucleic Acids Res. 28, 4275-4282 (2000).</li>
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<li>Cox, L. S., Clancy, D. J., Boubriak, I., Saunders, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Werner+Syndrome+in+Drosophila+melanogaster%3A+hyper-recombination+in+flies+lacking+WRN-like+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling Werner Syndrome in Drosophila melanogaster: hyper-recombination in flies lacking WRN-like exonuclease.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1119, 274-288 (2007).</li>
<li>Boubriak, I., Mason, P. A., Clancy, D. J., Dockray, J., Saunders, R. D., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DmWRNexo+is+a+3%27-5%27+exonuclease%3A+phenotypic+and+biochemical+characterization+of+mutants+of+the+Drosophila+orthologue+of+human+WRN+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">DmWRNexo is a 3'-5' exonuclease: phenotypic and biochemical characterization of mutants of the Drosophila orthologue of human WRN exonuclease.</a> Biogerontology. 10, 267-277 (2009).</li>
<li>Mason, P. A., Boubriak, I., Robbins, T., Lasala, R., Saunders, R., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+orthologue+of+progeroid+human+WRN+exonuclease%2C+DmWRNexo%2C+cleaves+replication+substrates+but+is+inhibited+by+uracil+or+abasic+sites+%3A+Analysis+of+DmWRNexo+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">The Drosophila orthologue of progeroid human WRN exonuclease, DmWRNexo, cleaves replication substrates but is inhibited by uracil or abasic sites : Analysis of DmWRNexo activity in vitro.</a> Age (Dordr). , (2012).</li>
<li>Machwe, A., Xiao, L., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Length-dependent+degradation+of+single-stranded+3%27+ends+by+the+Werner+syndrome+protein+%28WRN%29%3A+implications+for+spatial+orientation+and+coordinated+3%27+to+5%27+movement+of+its+ATPase%2Fhelicase+and+exonuclease+domains%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Length-dependent degradation of single-stranded 3' ends by the Werner syndrome protein (WRN): implications for spatial orientation and coordinated 3' to 5' movement of its ATPase/helicase and exonuclease domains.</a> BMC Mol. Biol. 7, 6 (2006).</li>
<li>Mangerich, A., Veith, S., Popp, O., Fahrer, J., Martello, R., Bohr, V. A., Burkle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+WRN+exonuclease+activity+by+isotope+dilution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of WRN exonuclease activity by isotope dilution mass spectrometry.</a> Mech. Ageing Dev. 133, 575-579 (2012).</li>
<li>Xue, Y., Ratcliff, G. C., Wang, H., Davis-Searles, P. R., Gray, M. D., Erie, D. A., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+exonuclease+domain+of+WRN+forms+a+hexamer+on+DNA+and+possesses+both+3%27-+5%27+exonuclease+and+5%27-protruding+strand+endonuclease+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A minimal exonuclease domain of WRN forms a hexamer on DNA and possesses both 3'- 5' exonuclease and 5'-protruding strand endonuclease activities.</a> Biochemistry. 41, 2901-2912 (2002).</li>
<li>Machwe, A., Ganunis, R., Bohr, V. A., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blockage+of+the+3%27--%3E5%27+exonuclease+activity+of+WRN+protein+by+certain+oxidative+modifications+and+bulky+lesions+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selective blockage of the 3'-->5' exonuclease activity of WRN protein by certain oxidative modifications and bulky lesions in DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28, 2762-2770 (2000).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La determinación de la actividad exonucleasa de las proteínas purificadas requiere el análisis de los productos de escisión del ADN. La escisión secuencial del ADN por exonucleasas se puede visualizar mediante la separación de productos de escisión marcados en geles de acrilamida. Históricamente, esto implicó el etiquetado final del sustrato de ADN con un radiomarcado (por ejemplo, 32P o 35S), pero con las desventajas inherentes al uso del radiomarcado (costo, problemas de seguridad e inest...

Las nucleasas cumplen un papel vital en las células en la eliminación del ADN dañado, resolviendo estructuras no dúplex como las uniones de Holliday y proporcionando capacidad de lectura durante la replicación del ADN, tanto intrínseca dentro de las ADN polimerasas como extrínseca a ellas1. Las nucleasas pueden actuar degradando secuencialmente el ADN de los extremos libres (exonucleasas) o rompiendo los enlaces fosfodiéster internos dentro de una molécula de ADN más larga (endonucleasas). La pérdida de la actividad de la nucleasa puede dar lugar a fenotipos muy específicos de inestabilidad del genoma. Mientras que la mutación del miembro de la familia helicasa RecQ, BLM, da lugar a tasas excesivamente altas de intercambio de cromátidas hermanas y tasas de cáncer elevadas a nivel mundial (revisado por Payne y Hickson2), la mutación de la proteína WRN altamente relacionada conduce al envejecimiento prematuro3; la principal diferencia significativa entre estos dos miembros de la familia es la presencia de un dominio exonucleasa 3'-5' con WRN4. La evidencia de un papel crítico de la exonucleasa WRN en el mantenimiento de la estabilidad del genoma se ha acumulado a partir del análisis de genotipos en pacientes con SW5, junto con estudios de mutación puntual y deleción en células humanas, respaldados por estudios cristalográficos del dominio de exonucleasa aislado6. Sin embargo, la cooperación y la comunicación cruzada entre la actividad exonucleasa de WRN y su actividad helicasa central7 dificulta desentrañar la funcionalidad de cada una y sus contribuciones relativas a la estabilidad del genoma. En plantas y animales con metazoos inferiores, la actividad exonucleasa WRN está presente en un solo polipéptido que carece de actividad helicasa8-10 (revisado en Cox y Boubriak11); se ha demostrado bioquímicamente en Arabidopsis que esta exonucleasa actúa coordinadamente con la helicasa WRN afín, reconstituyendo eficazmente las actividades enzimáticas combinadas observadas en los vertebrados WRN9. Hemos estudiado la exonucleasa WRN en Drosophila ya que las excelentes herramientas genéticas permiten analizar el impacto de la mutación de la exonucleasa (sin impactar en la presunta helicasa afín) a nivel de todo el organismo y a través del desarrollo10,12. Además, hemos clonado, expresado y purificado la exonucleasa recombinante de Drosophila WRN (DmWRNexo) que permite un análisis bioquímico completo de sus propiedades enzimáticas13,14.
El análisis de nucleasas in vitro se ha realizado tradicionalmente utilizando oligonucleótidos radiomarcados, evaluando la degradación mediante la búsqueda de escalonamiento de productos en geles de acrilamida4,8,15. Si bien son sensibles, estos ensayos no son cuantitativamente reproducibles en el día a día debido a la desintegración radiactiva de los sustratos marcados. Además, la manipulación y eliminación de los reactivos radiactivos plantea importantes problemas medioambientales y sanitarios; El abastecimiento de radioetiquetas también se está volviendo cada vez más problemático. Un método alternativo reciente evalúa la cantidad del producto final de degradación por espectrometría de masas16. Sin embargo, lleva mucho tiempo (tarda varios días), requiere equipo especializado y la lectura es la cantidad de producto final (un solo nucleótido), por lo que no es adecuado para la medición sensible de aspectos como la procesividad de las enzimas o para determinar si algunos nucleótidos, secuencias o modificaciones provocan una pausa o detención de la nucleasa. Para superar estos problemas, hemos adaptado los ensayos tradicionales basados en gel para su uso con sustratos de oligonucleótidos fluorescentes, generando sustratos marcados de manera estable que se pueden usar de manera reproducible durante largos períodos de tiempo y, por lo tanto, permiten la comparación directa de las actividades de las nucleasas en diferentes condiciones.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>Reactivo/Material</fuerte></td></tr><tr><td>Oligonucleótidos personalizados</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>Es necesario obtenerlos a alta pureza p. ej. con purificación PAGE.</td></tr><tr><td></td><td></td><td>5'FLO</td><td>fluoresesceína-5' GAACTATGGCTCTC GAGTGCTAGGACATGTCTGA CTACGTACAAGTCACC - 3'burbuja</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>5'- GGTGACTTGTACGT AGTCAGACATGTCCTAGCAC TCGAGAGCCATAGTTC-3'40</td></tr><tr><td>% 19:1 Solución de acrilamida</td><td>Severn Biotech</td><td>20-2400-05</td><td>PRECAUCIÓN: neurotoxina potente, por lo que se deben usar guantes en todo momento</td></tr><tr><td>Columnas His-Trap (1 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Todos los demás reactivos</td><td>de cualquier proveedor</td><td></td> de confianza <td>Es necesario el grado de biología molecular (libre de DNasa); De manera similar, los tubos de microfuge deben estar libres de ADNasa y RNasa<</td></tr>td colspan="4">EquipmentHoefer SE400 aparato de gel Hoefer SE400-15-1.5 FLA-3000 (fósforo y fluorescencia <tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lector</td> de imágenes <td>Fuji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>V2.02</td><td>FujiFilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Gauge V3.3</td><td>FujiFilm</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo de exonucleasa basado en fluorescencia para caracterizar dmwrnexo, ortólogo de la exonucleasa wrn progeroide humana, y su aplicación a otras nucleasas

A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

WRN La exonucleasa está involucrada en la resolución del daño del ADN que ocurre durante la replicación del ADN o después de la exposición a genotoxinas endógenas o exógenas. Es probable que desempeñe un papel en la prevención de la acumulación de intermediarios recombinógenos que, de otro modo, se acumularían en horquillas de replicación transitoriamente estancadas, lo que es coherente con un fenotipo hiperrecombinante de células que carecen de WRN. En los seres humanos, el dominio exonucleasa comprende una porción N-terminal de una proteína mucho más grande que también posee actividad helicasa, junto con sitios adicionales importantes para la interacción entre el ADN y la proteína. Por el contrario, en Drosophila, la actividad exonucleasa de WRN (DmWRNexo) está codificada por un locus genético distinto de la presunta helicasa, lo que permite la disección bioquímica (y genética) del papel de la actividad de la exonucleasa en los mecanismos de estabilidad del genoma. Aquí, demostramos un método fluorescente para determinar la actividad de la exonucleasa WRN utilizando DmWRNexo recombinante purificado y oligonucleótidos fluorescentes marcados al final. Este sistema permite una mayor reproducibilidad que los ensayos radiactivos, ya que los oligonucleótidos del sustrato permanecen estables durante meses, y proporciona un método más seguro y relativamente rápido para el análisis detallado de la actividad de la nucleasa, lo que permite determinar la polaridad, la procesividad y las preferencias del sustrato.

Realizar el análisis in vitro de la actividad exonucleasa requiere varios pasos preparatorios además del análisis propiamente dicho. En la Figura 1 se muestra un resumen de los procedimientos. 
Antes de realizar ensayos de exonucleasa basados en fluorescencia, es fundamental optimizar la detección del sustrato de oligonucleótido marcado fluorescentemente tras su separación en geles de urea-acrilamida, utilizando un sistema de imagen fluorescente adecuado. La elección ...

Las exonucleasas desempeñan un papel fundamental para garantizar la estabilidad del genoma. La pérdida de la función de la exonucleasa WRN provoca un envejecimiento prematuro. El estudio de los sustratos y otros requisitos de la nucleasa in vitro puede ayudar a dilucidar su papel in vivo. Aquí demostramos un ensayo rápido y reproducible basado en fluorescencia para medir su actividad nucleasa.

Un ensayo de exonucleasa basado en fluorescencia para caracterizar DmWRNexo, ortólogo de la exonucleasa WRN progeroide humana, y su aplicación a otras nucleasas

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. ...

Este experimento utiliza un ensayo basado en fluorescencia robusto y reproducible para determinar la actividad exonucleasa. Incube la enzima purificada con el sustrato de ADN fluorescente para permitir que la enzima degrade progresivamente el ADN. Luego, separe el ADN en un gel de acrilamida con urea para diferenciar los productos de degradación según su tamaño.A continuación, utilice la imagen de fluorescencia para identificar y cuantificar el grado de actividad exonucleasa. Los resultados analizados pueden determinar las condiciones de reacción del sustrato preferido, así como la actividad procesiva y general de la enzima. La principal ventaja de esta técnica frente a las técnicas basadas en radioactividad existentes es que los sustratos de ADN son estables durante mucho tiempo, lo que permite una excelente reproducibilidad, reduce costos y aumenta la seguridad.Primero, ajuste el lisado bacteriano a 20 milimolar de ole, utilizando un volumen apropiado de una solución stock de ole de dos molar. Luego, ajuste el volumen a al menos un mililitro utilizando ole al 20 milimolar para lavado, una columna de histotrap con un mililitro con 10 mililitros de agua milli Q. A continuación, equilibre la columna con 10 mililitros de ole al 20 milimolar.A continuación, cargue el lisado en la columna; a medida que se carga el lisado en la columna, puede experimentarse una presión inversa significativa. Esto es completamente normal. No intente aplicar demasiada fuerza a la jeringa y mantenga una presión constante y uniforme.Es habitual observar un ligero cambio de color cuando el lisado entra en la columna. Recoger el flujo que atraviesa en un frasco estéril de siete mililitros de capacidad y almacenarlo en hielo. A continuación, lavar la columna con 10 mililitros de emit ole 20 milimolar.Ahora pase cinco mililitros de iole 40 milimolar a través de la columna. Observe cuidadosamente el émbolo de la jeringa para medir las fracciones de un mililitro que se recogen en cada uno de los tubos microcentrífugos. De manera secuencial y similar, pase cinco mililitros de cada concentración de iole a través de la columna y recoja cinco fracciones de un mililitro cada vez.Analice las fracciones mediante dot blot e hibridación con un anticuerpo anti hiss conjugado con HRP. Para identificar las fracciones pico. Mantenga todos los reactivos a cuatro grados Celsius, alícuote la mezcla maestra y coloque en tubos Microfuge estériles libres de ADN de 0,5 mililitros; incluya también un control sin enzima para visualizar el sustrato inicial.Ahora ajuste un bloque térmico a la temperatura adecuada para la actividad enzimática. Prepare un IDE que contenga la solución de parada y guárdelo a temperatura ambiente. Organice el área de trabajo cerca del bloque térmico, incluyendo los reactivos finales que se agregarán a la reacción.Mezcle una pipeta de uno a 10 microlitros con puntas, un temporizador, un soporte para crioviales o un recipiente con hielo y la solución de detención. Inicie el temporizador al añadir la enzima al primer tubo y coloque el tubo en el bloque térmico. Continúe añadiendo la enzima al resto de los tubos a intervalos de 15 segundos, y coloque los tubos en el bloque térmico cuando el temporizador alcance el momento adecuado.Añada 10 microlitros de solución de parada a la primera muestra y mezcle mediante pipeteo. Coloque inmediatamente en hielo. Continúe deteniendo las reacciones en los intervalos de tiempo adecuados y en el mismo orden en que fueron preparadas, de modo que cada reacción haya tenido exactamente el mismo tiempo de incubación. Cargue la mitad o la totalidad de cada muestra en un gel de acrilamida. Incluya media o una carga completa de solución de parada que contenga colorante en una o más de las bandas para verificar cómo está corriendo el gel.Después de la electroforesis, retire los separadores y una placa de gel. Enjuague y limpie cuidadosamente la placa de gel para eliminar los restos de urea precipitada. Coloque la placa con el gel hacia abajo sobre el espacio de vidrio del soporte de gel y colóquelo en el equipo de imagen si es necesario.Observe las coordenadas del gel sobre el vidrio. Abra el software adecuado y escanee la región indicada del área de escaneo utilizando las condiciones detalladas en el protocolo del texto. Recorte la imagen y comprima los datos.Si es necesario, guarde y luego exporte como un archivo para su análisis. Realizar el análisis in vitro de la actividad exonucleasa requiere una serie de pasos preparatorios. Además del análisis propiamente dicho en estos ensayos de exonucleasa basados en fluorescencia, es fundamental optimizar la detección del sistema de imágenes de fluorescencia.Por ejemplo, un sustrato de oligonucleótido marcado con fluoresceína requiere un filtro que permita la excitación a 470 nanómetros y la emisión a 520 nanómetros. Con este filtro, es posible aumentar la capacidad de detectar concentraciones bajas de sustrato o producto ajustando tanto la sensibilidad como la resolución del sistema de imagen. Téngase en cuenta que existe cierta tolerancia en cuanto al ancho de banda del filtro.Como una opción subóptima de filtro aún permite la detección parcial del sustrato, aunque con una sensibilidad mucho menor. Una combinación adecuada de la concentración del oligonucleótido marcado y la configuración del equipo de imagen puede resultar en una detección robusta del sustrato. Esto es importante porque los productos de degradación tras la incubación con una exonucleasa activa estarán presentes en cantidades más bajas en cada banda, ya que el sustrato se ha fragmentado secuencialmente.Un ensayo de exonucleasa exitoso provocará la degradación del sustrato de manera secuencial hacia la cuenca. Cuatro, lo que dará lugar a un patrón característico en forma de escalera de ADN en el gel, representativo de la degradación por exonucleasa. Una vez optimizado para la detección, el ensayo puede utilizarse para detectar actividades diferenciales tanto cualitativa como cuantitativamente.Por ejemplo, se puede determinar la presencia o ausencia de actividad en mutantes de nucleasa en comparación con la proteína de tipo silvestre. También se pueden probar diferentes sustratos para evaluar su capacidad de ser degradados por la nucleasa. Bajo investigación.Este ensayo in vitro puede utilizarse para probar la especificidad del sustrato y el proceso de una nucleasa de interés.

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Investigación

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Ensayo de exonucleasa basado en fluorescencia para caracterizar DmWRNexo, ortólogo de la exoneucléasa WRN progeroid humana, y su aplicación a otras nucleasas

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