Multiplexado fluorescente microarrays para el análisis de proteínas salivales humanas utilizando microesferas poliméricas y Paquetes de fibra óptica
10 de octubre de 2013
Se describe un procedimiento para crear perfiles de proteínas salivales usando multiplexados arrays de anticuerpos basados en microesferas. Los anticuerpos monoclonales se unen covalentemente al colorante fluorescente codificada 4,5 micras microesferas de polímero utilizando química de la carbodiimida. Las microesferas modificadas fueron depositados en micropocillos de fibra óptica para medir los niveles de proteína en la saliva usando inmunoensayos de tipo sándwich de fluorescencia.
El objetivo general de este procedimiento es analizar múltiples proteínas en muestras de saliva humana utilizando matrices fluorescentes basadas en microesferas. Primero, codifique las microesferas con diferentes cantidades de dos tintes fluorescentes. Acople los anticuerpos de captura para diferentes proteínas en las microesferas codificadas.
A continuación, ensamble el microarray de proteínas multiplexadas en el haz de fibra óptica utilizando los inmunoensayos intercalados en el ensayo de microarrays ensamblados para múltiples proteínas en las muestras de saliva de prueba. En última instancia, el análisis por microscopía de fluorescencia puede medir las respuestas de señal de diferentes proteínas en las muestras de saliva. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el de Eliza es que permite el análisis simultáneo de múltiples proteínas en biofluidos complejos.
Aunque este método puede proporcionar información sobre el análisis de la saliva humana, también se puede aplicar a otras gripes biológicas, como la orina y el esputo en suero. Pesar el TTA de opio en un frasco de vidrio ámbar y preparar una solución madre de 200 milimolares en tetra hidro furina. Mezclar suavemente por pipeteo y verificar visualmente que el tinte esté completamente disuelto.
Del mismo modo, prepare una solución madre de 12 milimolares de cumarina 30 mezclada suavemente por pipeteo. Visualmente. Verifique que el D esté completamente disuelto en suspensión de vórtice a microesfera y luego transfiera 60 microlitros a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Para lavar las microesferas, agregue 600 microlitros de PBS mezclado por pipeteo 20 veces y centrifugue a 10,000 RPM durante tres minutos.
Después de tres lavados con solución de tetra hidro furina, retire el sobrenadante, vuelva a suspender el paladar en 600 microlitros de solución de trabajo y transfiera la mezcla a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Selle el tubo de microcentrífuga con una película para y colóquelo en un agitador. Protégelo de la luz cubriéndolo con papel de aluminio.
Agregue 200 microlitros de suspensión de microesferas codificadas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con cierre seguro. De manera gota a gota, agregue 150 microlitros, una solución EDC recién preparada Agregue inmediatamente 150 microlitros de solución de sulfamida NHS. Mezclar bien pipeteando y verificar que la suspensión sea homogénea.
Tape el tubo, séllelo con paraform y colóquelo en una coctelera. Protégelo de la luz cubriéndolo con papel de aluminio. Después de tres lavados de tampón P-B-S-S-D-S reus, suspender el pellet en 200 microlitros de mezcla tampón P-B-S-S-D-S.
A continuación, transfiera la solución a 300 microlitros de tampón P-B-S-S-D-S que contiene 60 microgramos de anticuerpos de captura. Mezcle 50 microlitros de cada tipo de microesferas de captura de proteínas en un nuevo tubo de microcentrífuga de autoclave. Centrifugar la piscina de microesferas a 7.000 rpm durante tres minutos y eliminar todos los microlitros de sobrenadante, excepto 100.
Ahora haga haces de fibra óptica cortados a mano a aproximadamente cinco centímetros de longitud, pula secuencialmente ambos extremos con películas de lapeado de diamante. A continuación, sonique el paquete pulido en agua desionizada durante dos minutos. Para eliminar cualquier partícula, coloque una pequeña barra agitadora magnética en un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros.
Agregue 400 microlitros de tampón PBS sin proteínas y revuelva en una placa de agitación magnética durante 30 minutos. Para eliminar las burbujas de aire, grabe un extremo del haz de fibras pulidas en una solución normal de cloruro de hidrógeno 0.025 durante 150 segundos. Sumerja inmediatamente y sonique el N grabado en agua desionizada durante un minuto.
Luego, seque los haces de fibra con aire comprimido, monte el haz de fibra en un soporte de fibra y bloquee el extremo grabado en el tampón PBS sin proteínas sin burbujas durante una hora, deposite un cuádruple ALI de un microlitro de la suspensión de microesferas almacenada en el extremo grabado del haz de fibra óptica. Proteja la configuración de la luz con una caja envuelta con papel de aluminio. Después de 15 minutos, el volumen de la suspensión disminuirá por evaporación y forzará las microesferas a entrar en los micropocillos grabados.
Utilice un hisopo saturado con solución de muestra para eliminar las microesferas que no estén atrapadas en los micropocillos. Para que el microarray de proteínas esté listo para su uso, añada 200 microlitros de solución de muestra en un tubo de microcentrífuga de autoclave de 0,5 mililitros. Sumerja el microarray de proteínas cargado en la fibra en la solución y colóquelo en un agitador.
Protéjase de la luz cubriéndolo con papel de aluminio. A continuación, sumerja el microarray de proteínas en un nuevo tubo de microcentrífuga de autoclave que contenga 200 microlitros de tampón de lavado y agite a 600 RPM durante dos minutos. Ahora incube el microarray en una solución de 100 microlitros de un cóctel de anticuerpos de detección que contiene anticuerpos de detección biotinilados y un tampón de bloqueo de PBS durante 30 minutos.
A temperatura ambiente en la oscuridad, limpie el extremo distal del haz de fibras con un hisopo saturado con etanol absoluto. A continuación, seque ambos extremos de la fibra con aire comprimido, monte la fibra en un microscopio epifluorescente y obtenga una imagen a través del extremo distal de la fibra, adquiera las imágenes de microesferas correspondientes a las intensidades de emisiones fluorescentes de opio TTAC 30 y SAP. Aquí se muestran las imágenes codificadoras de siete tipos de microesferas.
Se observan dos niveles de intensidad en la imagen codificante UTTA, que representan microesferas codificadas con diferentes cantidades de UTTA die Se observan resultados similares en la imagen codificante C 30. El análisis de imágenes de MATLAB permite calcular las intensidades de fluorescencia de diferentes microesferas en la imagen de señal. Los resultados de la decodificación se muestran en la figura 2D siete.
Diferentes microesferas se decodifican con éxito. Las microesferas no muestran respuesta cuando se incuban con tampón de ensayo. Cuando se incuba con muestras de saliva humana, se observan respuestas fluorescentes significativas.
Para una mejor comparación, los contrastes en estas dos figuras se han ajustado al mismo nivel. Una vez dominado, este método permite el análisis reproducible de diferentes proteínas en las muestras de saliva humana. Se muestran los resultados de tres detecciones independientes en la misma muestra.
Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar un microrrayo de proteína multiplex basado en microesferas y usarlo para análisis de biofluidos complejos. Siguiendo este procedimiento. También se pueden analizar otros biomarcadores proteicos en diferentes biofluidos complejos.
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Resumen
Este artículo describe un procedimiento para el perfilado de proteínas salivales mediante matrices de anticuerpos multiplexados basadas en microesferas. El método permite el análisis simultáneo de múltiples proteínas en muestras de saliva humana, mejorando las capacidades de los ensayos tradicionales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biotecnología
- Proteómica
Antecedentes
- La saliva contiene una variedad de proteínas que pueden proporcionar información sobre la salud y la enfermedad.
- Los métodos tradicionales como el ELISA se limitan a analizar una proteína a la vez.
- Los ensayos multiplex pueden mejorar la eficiencia y la riqueza de los datos.
- La tecnología de microesferas fluorescentes ofrece un enfoque novedoso para la detección de proteínas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para analizar múltiples proteínas en saliva simultáneamente.
- Mejorar la sensibilidad y especificidad de la detección de proteínas en biofluidos complejos.
- Proporcionar una alternativa más eficiente a los ensayos existentes de analito único.
Métodos Utilizados
- Microesferas de codificación con colorantes fluorescentes.
- Unión covalente de anticuerpos de captura a las microesferas.
- Ensamblaje de microarrays multiplexados de proteínas en haces de fibra óptica.
- Uso de inmunoensayos de sándwich por fluorescencia para detectar proteínas en muestras de saliva.
Resultados principales
- El método detectó con éxito múltiples proteínas en muestras de saliva.
- La microscopía de fluorescencia proporcionó respuestas de señal clara para diferentes proteínas.
- La técnica demostró ventajas frente a los métodos tradicionales de ELISA.
- Los resultados indican aplicaciones potenciales en diagnósticos clínicos.
Conclusiones
- Este enfoque multiplex permite un análisis eficiente de las proteínas salivales.
- El método podría facilitar una mejor comprensión de diversas afecciones de salud.
- Estudios futuros podrían ampliar la aplicación de esta técnica a otros biofluidos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El análisis multiplexado de proteínas en biofluidos complejos como la saliva aborda un cuello de botella crítico en el descubrimiento de biomarcadores, donde los ensayos tradicionales de un solo analito limitan el rendimiento y aumentan el consumo de muestras. Esta matriz de microesferas basada en fibra óptica permite la cuantificación simultánea de múltiples proteínas salivales, mejorando la eficiencia del ensayo y apoyando la validación temprana de dianas en investigaciones sobre enfermedades neurodegenerativas e inflamatorias. Al proporcionar lecturas cuantitativas y reproducibles a partir de muestras clínicas limitadas, el método aumenta la confianza predictiva en la identificación de candidatos prometedores y en los flujos de trabajo de desactivación de riesgos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la medición simultánea de múltiples biomarcadores proteicos salivales en muestras relevantes para la enfermedad.
- Valor operativo: Reduce los volúmenes de muestra necesarios y los tiempos de ensayo mediante la detección paralela de proteínas en un único protocolo.
- Valor predictivo: Facilita el desarrollo de paneles de biomarcadores y la validación funcional de dianas al correlacionar las respuestas multi-analito con resultados fenotípicos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas estandarizadas de fluorescencia para seis proteínas mediante microesferas codificadas, lo que permite un rendimiento de ensayo reproducible entre diferentes ejecuciones.
- Valor operativo: Facilita la estandarización del ensayo mediante la inmovilización en haces de fibra óptica y algoritmos automatizados de decodificación, reduciendo la variabilidad dependiente del usuario.
- Escalabilidad: Permite la reutilización de la plataforma para otros biofluidos (suero, orina, esputo), como se indica en la transcripción, extendiendo su utilidad más allá de la saliva.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta los flujos de trabajo de descubrimiento y preclínicos al proporcionar datos clínicamente relevantes sobre proteínas salivales que pueden informar modelos mecanicistas.
- Reducción de Riesgos Mecanicistas: Permite el análisis a nivel de vías mediante detección multiplexada, reduciendo la ambigüedad en la evaluación del compromiso del blanco y de las respuestas biológicas.
- Confianza Predictiva: Ofrece respuestas cuantitativas basadas en fluorescencia que respaldan las decisiones de avance o interrupción en las primeras etapas del desarrollo preclínico.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación inicial del blanco hasta el desarrollo de ensayos y estudios mecanicistas preclínicos, especialmente para programas guiados por biomarcadores en neurología e inflamación.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la medición simultánea de múltiples proteínas salivales asociadas a estados patológicos.
- Detección: Ofrece disponibilidad para ensayos mediante la codificación estandarizada de microesferas, el ensamblaje de matrices de fibra óptica y la cuantificación basada en fluorescencia compatible con imágenes de alto contenido.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes (intensidad de fluorescencia por tipo de microesfera) que permiten comparaciones entre condiciones experimentales y grupos de muestras.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante biomarcadores salivales relevantes para enfermedades que reflejan procesos fisiopatológicos sistémicos o locales.
- Reutilización Empresarial: Codifica una plataforma adaptable basada en microesferas, aplicable a múltiples biofluidos complejos, que favorece la estandarización entre proyectos y el intercambio de reactivos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos mediante la detección multiplex cuantitativa de proteínas en biofluidos nativos.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante la inmovilización en fibra óptica y la decodificación algorítmica, reduciendo el ruido técnico.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al maximizar el rendimiento de datos por muestra y permitir la reutilización en diversos programas de biomarcadores.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al proporcionar perfiles de múltiples analitos que informan la toma de decisiones relacionadas con mecanismos y seguridad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la codificación de microesferas, conjugación de anticuerpos y microscopía de fluorescencia para el correcto establecimiento y optimización del ensayo.
- Depende de la infraestructura de microscopía de fluorescencia y análisis de imágenes basado en MATLAB para la adquisición y decodificación de señales.
- Necesita la estandarización entre equipos en la preparación de microesferas, manipulación de fibras ópticas y protocolos de ensayo para garantizar la reproducibilidad entre diferentes sitios.
- La adaptación a otros sistemas modelo (por ejemplo, suero, orina) requiere una nueva validación de la estabilidad de la codificación y del desempeño de los anticuerpos en matrices diferentes.
- Las limitaciones prácticas incluyen la posible fuga de microesferas de los micropozos y la variabilidad de la señal debido a lavados incompletos o evaporación durante el ensamblaje de la matriz.
