Multiplexado fluorescente microarrays para el análisis de proteínas salivales humanas utilizando microesferas poliméricas y Paquetes de fibra óptica
October 10th, 2013
Se describe un procedimiento para crear perfiles de proteínas salivales usando multiplexados arrays de anticuerpos basados en microesferas. Los anticuerpos monoclonales se unen covalentemente al colorante fluorescente codificada 4,5 micras microesferas de polímero utilizando química de la carbodiimida. Las microesferas modificadas fueron depositados en micropocillos de fibra óptica para medir los niveles de proteína en la saliva usando inmunoensayos de tipo sándwich de fluorescencia.
El objetivo general de este procedimiento es analizar múltiples proteínas en muestras de saliva humana utilizando matrices fluorescentes basadas en microesferas. Primero, codifique las microesferas con diferentes cantidades de dos tintes fluorescentes. Acople los anticuerpos de captura para diferentes proteínas en las microesferas codificadas.
A continuación, ensamble el microarray de proteínas multiplexadas en el haz de fibra óptica utilizando los inmunoensayos intercalados en el ensayo de microarrays ensamblados para múltiples proteínas en las muestras de saliva de prueba. En última instancia, el análisis por microscopía de fluorescencia puede medir las respuestas de señal de diferentes proteínas en las muestras de saliva. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el de Eliza es que permite el análisis simultáneo de múltiples proteínas en biofluidos complejos.
Aunque este método puede proporcionar información sobre el análisis de la saliva humana, también se puede aplicar a otras gripes biológicas, como la orina y el esputo en suero. Pesar el TTA de opio en un frasco de vidrio ámbar y preparar una solución madre de 200 milimolares en tetra hidro furina. Mezclar suavemente por pipeteo y verificar visualmente que el tinte esté completamente disuelto.
Del mismo modo, prepare una solución madre de 12 milimolares de cumarina 30 mezclada suavemente por pipeteo. Visualmente. Verifique que el D esté completamente disuelto en suspensión de vórtice a microesfera y luego transfiera 60 microlitros a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Para lavar las microesferas, agregue 600 microlitros de PBS mezclado por pipeteo 20 veces y centrifugue a 10,000 RPM durante tres minutos.
Después de tres lavados con solución de tetra hidro furina, retire el sobrenadante, vuelva a suspender el paladar en 600 microlitros de solución de trabajo y transfiera la mezcla a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Selle el tubo de microcentrífuga con una película para y colóquelo en un agitador. Protégelo de la luz cubriéndolo con papel de aluminio.
Agregue 200 microlitros de suspensión de microesferas codificadas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con cierre seguro. De manera gota a gota, agregue 150 microlitros, una solución EDC recién preparada Agregue inmediatamente 150 microlitros de solución de sulfamida NHS. Mezclar bien pipeteando y verificar que la suspensión sea homogénea.
Tape el tubo, séllelo con paraform y colóquelo en una coctelera. Protégelo de la luz cubriéndolo con papel de aluminio. Después de tres lavados de tampón P-B-S-S-D-S reus, suspender el pellet en 200 microlitros de mezcla tampón P-B-S-S-D-S.
A continuación, transfiera la solución a 300 microlitros de tampón P-B-S-S-D-S que contiene 60 microgramos de anticuerpos de captura. Mezcle 50 microlitros de cada tipo de microesferas de captura de proteínas en un nuevo tubo de microcentrífuga de autoclave. Centrifugar la piscina de microesferas a 7.000 rpm durante tres minutos y eliminar todos los microlitros de sobrenadante, excepto 100.
Ahora haga haces de fibra óptica cortados a mano a aproximadamente cinco centímetros de longitud, pula secuencialmente ambos extremos con películas de lapeado de diamante. A continuación, sonique el paquete pulido en agua desionizada durante dos minutos. Para eliminar cualquier partícula, coloque una pequeña barra agitadora magnética en un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros.
Agregue 400 microlitros de tampón PBS sin proteínas y revuelva en una placa de agitación magnética durante 30 minutos. Para eliminar las burbujas de aire, grabe un extremo del haz de fibras pulidas en una solución normal de cloruro de hidrógeno 0.025 durante 150 segundos. Sumerja inmediatamente y sonique el N grabado en agua desionizada durante un minuto.
Luego, seque los haces de fibra con aire comprimido, monte el haz de fibra en un soporte de fibra y bloquee el extremo grabado en el tampón PBS sin proteínas sin burbujas durante una hora, deposite un cuádruple ALI de un microlitro de la suspensión de microesferas almacenada en el extremo grabado del haz de fibra óptica. Proteja la configuración de la luz con una caja envuelta con papel de aluminio. Después de 15 minutos, el volumen de la suspensión disminuirá por evaporación y forzará las microesferas a entrar en los micropocillos grabados.
Utilice un hisopo saturado con solución de muestra para eliminar las microesferas que no estén atrapadas en los micropocillos. Para que el microarray de proteínas esté listo para su uso, añada 200 microlitros de solución de muestra en un tubo de microcentrífuga de autoclave de 0,5 mililitros. Sumerja el microarray de proteínas cargado en la fibra en la solución y colóquelo en un agitador.
Protéjase de la luz cubriéndolo con papel de aluminio. A continuación, sumerja el microarray de proteínas en un nuevo tubo de microcentrífuga de autoclave que contenga 200 microlitros de tampón de lavado y agite a 600 RPM durante dos minutos. Ahora incube el microarray en una solución de 100 microlitros de un cóctel de anticuerpos de detección que contiene anticuerpos de detección biotinilados y un tampón de bloqueo de PBS durante 30 minutos.
A temperatura ambiente en la oscuridad, limpie el extremo distal del haz de fibras con un hisopo saturado con etanol absoluto. A continuación, seque ambos extremos de la fibra con aire comprimido, monte la fibra en un microscopio epifluorescente y obtenga una imagen a través del extremo distal de la fibra, adquiera las imágenes de microesferas correspondientes a las intensidades de emisiones fluorescentes de opio TTAC 30 y SAP. Aquí se muestran las imágenes codificadoras de siete tipos de microesferas.
Se observan dos niveles de intensidad en la imagen codificante UTTA, que representan microesferas codificadas con diferentes cantidades de UTTA die Se observan resultados similares en la imagen codificante C 30. El análisis de imágenes de MATLAB permite calcular las intensidades de fluorescencia de diferentes microesferas en la imagen de señal. Los resultados de la decodificación se muestran en la figura 2D siete.
Diferentes microesferas se decodifican con éxito. Las microesferas no muestran respuesta cuando se incuban con tampón de ensayo. Cuando se incuba con muestras de saliva humana, se observan respuestas fluorescentes significativas.
Para una mejor comparación, los contrastes en estas dos figuras se han ajustado al mismo nivel. Una vez dominado, este método permite el análisis reproducible de diferentes proteínas en las muestras de saliva humana. Se muestran los resultados de tres detecciones independientes en la misma muestra.
Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar un microrrayo de proteína multiplex basado en microesferas y usarlo para análisis de biofluidos complejos. Siguiendo este procedimiento. También se pueden analizar otros biomarcadores proteicos en diferentes biofluidos complejos.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Información general
Este artículo describe un procedimiento para perfilar proteínas salivales utilizando matrices de anticuerpos multiplexadas basadas en microesferas. El método permite el análisis simultáneo de múltiples proteínas en muestras de saliva humana, mejorando las capacidades de los ensayos tradicionales.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biotecnología
- Proteómica
Antecedentes
- La saliva contiene una variedad de proteínas que pueden proporcionar información sobre la salud y las enfermedades.
- Los métodos tradicionales como ELISA están limitados a analizar una proteína a la vez.
- Los ensayos multiplexados pueden mejorar la eficiencia y la riqueza de datos.
- La tecnología de microesferas fluorescentes ofrece un enfoque novedoso para la detección de proteínas.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método para analizar múltiples proteínas en la saliva simultáneamente.
- Mejorar la sensibilidad y especificidad de la detección de proteínas en biofluidos complejos.
- Proporcionar una alternativa más eficiente a los ensayos de analitos individuales existentes.
Métodos utilizados
- Codificación de microesferas con colorantes fluorescentes.
- Vinculación covalente de anticuerpos captores a las microesferas.
- Ensamblaje de matrices de proteínas multiplexadas en haces de fibra óptica.
- Uso de inmunoensayos de sándwich de fluorescencia para detectar proteínas en muestras de saliva.
Resultados principales
- El método detectó con éxito múltiples proteínas en muestras de saliva.
- La microscopía de fluorescencia proporcionó respuestas de señal claras para diferentes proteínas.
- La técnica demostró ventajas sobre los métodos ELISA tradicionales.
- Los resultados indican posibles aplicaciones en diagnósticos clínicos.
Conclusiones
- Este enfoque multiplexado permite un análisis eficiente de las proteínas salivales.
- El método podría facilitar una mejor comprensión de diversas condiciones de salud.
- Estudios futuros pueden expandir la aplicación de esta técnica en otros biofluidos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Multiplexed protein analysis in complex biofluids like saliva addresses a critical bottleneck in biomarker discovery, where traditional single-plex assays limit throughput and increase sample consumption. This microsphere-based fiber-optic array enables simultaneous quantification of multiple salivary proteins, improving assay efficiency and supporting early-stage target validation in neurodegenerative and inflammatory disease research. By providing quantitative, reproducible readouts from limited clinical samples, the method enhances predictive confidence in lead identification and preclinical de-risking workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring multiple salivary protein biomarkers simultaneously in disease-relevant samples.
- Operational Value: Reduces sample volume requirements and assay timelines through parallel protein detection in a single workflow.
- Predictive Value: Supports biomarker panel development and functional target validation by correlating multi-analyte responses with phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative fluorescence readouts for six proteins using encoded microspheres, enabling reproducible assay performance across runs.
- Operational Value: Facilitates assay standardization via fiber-optic bundle immobilization and automated decoding algorithms, reducing user-dependent variability.
- Scalability: Supports platform reuse for other biofluids (serum, urine, sputum) as noted in the transcript, extending utility beyond saliva.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing clinically relevant salivary protein data that can inform mechanistic models.
- Mechanistic De-risking: Enables pathway-level analysis through multiplexed detection, reducing ambiguity in target engagement and biological response assessments.
- Predictive Confidence: Delivers quantitative, fluorescence-based signal responses that support go/no-go decisions in early preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through assay development to preclinical mechanistic studies, particularly for biomarker-driven programs in neurology and inflammation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling simultaneous measurement of multiple salivary proteins linked to disease states.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized microsphere encoding, fiber-optic array assembly, and fluorescence-based quantification compatible with high-content imaging.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity per microsphere type) that allow comparison across experimental conditions and sample groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via disease-relevant salivary biomarkers that reflect systemic or local pathophysiological processes.
- Enterprise Reuse: Encodes a adaptable microsphere-based platform applicable to multiple complex biofluids, supporting cross-project standardization and reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through multiplexed, quantitative protein detection in native biofluids.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via fiber-optic immobilization and algorithmic decoding, reducing technical noise.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by maximizing data yield per sample and enabling reuse across biomarker programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering multi-analyte profiles that inform mechanistic and safety-related decision-making.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsphere encoding, antibody conjugation, and fluorescence microscopy for successful assay setup and optimization.
- Dependent on fluorescence microscopy and MATLAB-based image analysis infrastructure for signal acquisition and decoding.
- Necessitates cross-team standardization of microsphere preparation, fiber-optic handling, and assay protocols to ensure reproducibility across sites.
- Adaptation to other model systems (e.g., serum, urine) requires re-validation of encoding stability and antibody performance in differing matrices.
- Practical limitations include potential microsphere leakage from microwells and signal variability due to incomplete washing or evaporation during array assembly.
