Name: Multiplexado fluorescente microarrays para el análisis de proteínas salivales humanas utilizando microesferas poliméricas y Paquetes de fibra óptica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprende a analizar múltiples proteínas en saliva humana mediante microarrays fluorescentes con microesferas poliméricas y paquetes de fibra óptica. Este método multiplexado mejora la eficiencia diagnóstica.

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Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (subvención 08UDE017788-05). EBP también reconoce el apoyo de la Fundación Española para la Ciencia y la Tecnología (FECYT). Los autores agradecen a Shonda T. Gaylord y Pratyusha Mogalisetti para la lectura crítica del manuscrito.

<img alt="Figura 1" width="600px" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50726/50726fig1.jpg" /> Figura 1. . Flujo de trabajo para la aplicación de matriz de anticuerpos de microesferas de fibra óptica a la saliva de perfiles (1) Las microesferas se codifican internamente con dos colorantes fluorescentes; (2) las microesferas codificadas son modificados externamente con anticuerpos monoclonales específicos de proteínas; (3) las microesferas multiplexadas se mezclan, y (4) depositadas al azar en micropocillos grabadas en el extremo proximal de un haz de fibra óptica; (5) proteínas salivales son capturados por las microesferas a través de inmunoensayo de tipo sándwich, y (6) cuantificaron utilizando microscopía de fluorescencia. 1. Las microesferas de codificación <ol><li> Pesar europio sodio (III) thenoyltrifluoroacetonate trihidrato (Eu-TTA, PM = 869,54 g / mol) en un vial de vidrio ámbar y preparar una solución de 200 mM en tetrahidrofurano (THF). Mezclar suavemente con la pipeta; verificar visualmenteel colorante se disuelve completamente. </li><li> Pesar cumarina 30 (C30, PM = 347,41 g / mol) en un vial de vidrio ámbar y preparar una solución madre 12 mM en THF. Mezclar suavemente con la pipeta, verifique visualmente que el colorante se haya disuelto completamente. </li><li> Preparar 700 l de solución de trabajo para cada tipo de microesfera usando las soluciones madre y THF para alcanzar la concentración final de la lista en la Tabla 1. </li><li> Asegúrese de microesferas (10% w / v) son bien suspendidas mediante agitación con vórtex, y luego transferir 60 l de suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Añadir 600 l de PBS a la suspensión de microesferas y mezclar pipeteando 20x. Centrifugar el tubo a 10.000 rpm durante 3 min y retirar con cuidado el sobrenadante. Repita este proceso otra 2x para lavar las microesferas. </li><li> Lavar el sedimento de microesferas 3x con THF usando un procedimiento similar que en el paso 1.5. </li><li> Se centrifuga la suspensión de microesferas / THF a 10.000 rpm durante 3 min, separar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento en 600 lSolución de trabajo de la lista en la Tabla 1. Transferir la mezcla a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Selle el tubo de microcentrífuga con Parafilm y colocarlo en un agitador. Agitar a 3.000 rpm y se incuba durante 24 horas, protegerlo de la luz cubriendo la configuración mediante el uso de una caja cubierta con papel de aluminio. </li><li> Centrifugar la suspensión de microesferas a 10.000 rpm durante 3 minutos para formar un pellet. </li><li> Retire la solución de colorante líquido sobrenadante, lavar las microesferas 6X con 600 l de metanol y luego con 600 l de PBS que contenía 0,01% de Tween-20 6x otra, tal como se describe en el paso 1.5. </li><li> Guarde las microesferas codificadas en 600 l de PBS que contenía 0,01% de Tween-20 a 4 ° C hasta su uso, proteger de la luz. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del tipo de microesferas: </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </strong&gt; </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Eu-TTA (mM) </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td> 100 </td><td> 10 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> C30 (mM) </td><td></td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Las concentraciones de Eu-TTA y C30 soluciones de trabajo. 2. Preparación de Microesferas de Proteína de captura <ol><li> Preparar tampón MES [2 - (N-morfolino) etanosulfónico (MES) 0,1 M, NaCl 0,9%, SDS al 0,01%, pH 5,7] y tampón PBS / SDS (fosfato de sodio 0,01 M, NaCl 0,154 M, SDS al 0,01%, pH 7.4) con antelación a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 200 l codificado suspensión de microesferas (que contiene ~ 2 mg de microesferas) en un 1,5 ml tubo de microcentrífuga Safe-Lock. Es importante la utilización de este tipo de tubo de microcentrífuga para evitar derrames durante la incubación en el paso 2.6. </li> &lt;li&gt; Lavarse las microesferas con 600 mu l tampón MES 3x como se describe en el paso 1.5. Añadir 700 mu l MES al sedimento de microesferas y se mezcla bien con la pipeta. </li><li> Preparar 0.105 g / ml de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC, PM = 191,7 g / mol) y 0,163 g / ml de sulfo-N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS, PM = 217,13 g / mol) soluciones en tampón MES en tubos separados. </li><li> Añadir 150 l recién preparada EDC solución gota a gota a la suspensión de microesferas. La EDC hidroliza muy rápidamente, por lo que es imprescindible el uso de una solución recién hecha para asegurar la eficacia de la inmovilización. Inmediatamente después de la adición del EDC, añadir 150 l solución de sulfo-NHS para las microesferas, mezclar bien pipeteando y verifique la suspensión es homogénea. </li><li> Tapar el tubo, sellarlo con Parafilm, y colocarlo en un agitador. Agitar a 1.500 rpm durante 4 horas, protegerlo de la luz usando una caja cubierta con papel de aluminio. </li><li> Centrifugar las suspens microesferasde iones a 10.000 rpm durante 3 min para formar un precipitado y retirar el sobrenadante. Lavar las microesferas con 500 l de PBS / SDS 3x tampón como se ha descrito en el paso 1.5. </li><li> Añadir 200 l de tampón PBS / SDS al sedimento, mezclar bien las microesferas y pasar la solución a 300 l de tampón PBS / SDS que contiene 60 microgramos anticuerpos de captura. Es importante a suspender el sedimento de microesferas primero y luego añadir la suspensión de microesferas en la solución de anticuerpo. </li><li> Incubar la mezcla de anticuerpos-microesferas por agitación a 1500 rpm durante 4 horas en un agitador, protegerlo de la luz usando una caja cubierta con papel de aluminio. </li><li> Centrifugar la suspensión de microesferas a 10.000 rpm durante 3 minutos para formar un precipitado y retirar el sobrenadante. Lavar las microesferas con 500 l StartingBlock (TBS) el bloqueo de 3x tampón, como se describe en el paso 1.5. </li><li> Mezclar microesferas con 1 ml de TBS de tampón de bloqueo y se incuba microesferas a 1.500 rpm durante 1 hora en un agitador, protegerlo de la luz utilizando una cala cuadrorojo con papel de aluminio. </li><li> Centrifugar la suspensión de microesferas a 7.000 rpm durante 3 minutos para formar un precipitado y retirar el sobrenadante. Lavar el pellet 3x con 500 l de TBS tampón de bloqueo, como se describe en el paso 1.5. </li><li> Centrifugar la solución de microesferas a 7.000 rpm durante 3 minutos para formar un precipitado y retirar el sobrenadante. Añadir 500 l tampón de bloqueo TBS y mezclar con la pipeta. </li><li> Guarde la suspensión de microesferas modificado a 4 ° C hasta su uso, proteger de la luz. </li><li> Repita este procedimiento para hacer otros tipos de microesferas utilizando anticuerpos correspondientes. </li></ol> 3. Asamblea de fibra óptica Microarray <ol><li> Mezclar 50 l de cada tipo de microesferas de proteína de captura en un nuevo tubo de microcentrífuga esterilizado en autoclave. Centrifugar las microesferas de valores en común a 7.000 rpm durante 3 min, y eliminar el sobrenadante de forma que el volumen restante es de aproximadamente 100 l. </li><li> Cortadas a mano manojos de fibra óptica a aproximadamente 5 cm de longitud ysecuencialmente pulir ambos extremos en una máquina de pulido utilizando 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0,5, y 0,05 m de diamante de tamaño lapeado películas. Sonicar el haz de pulido en agua desionizada durante 2 minutos para eliminar cualquier partícula. </li><li> Ponga una pequeña barra de agitación magnética en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml, añadir 400 l de PBS libre de proteínas de amortiguación y revolver en una placa de agitación magnética durante 30 minutos para eliminar las burbujas de aire. </li><li> Etch un extremo del haz de fibras pulido en una solución de HCl 0,025 N para 150 seg 10,16. Inmediatamente sumergirse y someter a ultrasonidos el final grabado al agua fuerte en agua desionizada durante 1 min. Secar los haces de fibras con aire comprimido. </li><li> Monte el haz de fibras en un soporte de fibra y el bloque final grabado en el tampón PBS libre de proteínas libre de burbujas durante 1 hora. </li><li> Depósito 1 l alícuota de la suspensión de microesferas almacenada en el extremo grabado al agua fuerte del haz de fibra óptica. Proteger la configuración de la luz con una caja con papel de aluminio, y esperar 15 min. El volumen de la suspensión sedisminuir por evaporación y obligar a las microesferas en los pocillos grabados. Repita este paso de carga una vez más. </li><li> Use un hisopo saturado con solución de muestra para eliminar las microesferas que no están atrapadas en los micropocillos. El microarray de proteínas ya está listo para usar. Vaya inmediatamente al paso 4.1 para el análisis de la saliva. </li></ol> 4. Análisis de la muestra de saliva, con microesferas de Microarray <ol><li> Añadir 200 l de solución de muestra (100 sobrenadante de saliva l diluyó con igual volumen de StartingBlock T20 (PBS) tampón de bloqueo. El protocolo de recogida de sobrenadante de la saliva ha sido publicado previamente 10). en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml en autoclave. Sumerja el microarray proteína cargada en la fibra en la solución y se incuba en un agitador a 600 rpm durante 2 horas, protegerlo de la luz usando una caja cubierta con papel de aluminio. </li><li> Preparar 20 ml de tampón de lavado mediante la adición de 200 l solución de BSA al 10% y 200 l 10% de Tween-20 en 19,6 ml de PBS, MIx bien agitando suavemente. </li><li> Sumerja los microarrays de proteínas en un nuevo tubo de microcentrífuga de autoclave que contiene 200 l de tampón de lavado y se agita a 600 rpm durante 2 min. Repita este 3x lavado. </li><li> Incubar la micromatriz en una solución de 100 l de un cóctel de anticuerpo de detección que contiene 5 g / ml de anti-VEGF, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9, anticuerpos de detección biotinilados de IL-1β en StartingBlock T20 (PBS) tampón de bloqueo durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador a 600 rpm, protegerlo de la luz usando una caja cubierta con papel de aluminio. </li><li> Lave el microarray 3x con tampón de lavado como se describe en el paso 4.3. </li><li> Incubar los microarrays en 200 l de 20 mg / ml de estreptavidina conjugada R-ficoeritrina (SAPE) solución en PBS a 600 rpm en el agitador durante 10 min, protegerlo de la luz usando una caja cubierta con papel de aluminio. </li><li> Lave el microarray 5x con tampón de lavado como se describe en el paso 4.3. </li><li> Limpiar el extremo distal de la fibra (es decir, el extremo alejadoa partir de las microesferas) paquete con un hisopo saturado con etanol absoluto. </li><li> Secar ambos extremos de la fibra con aire comprimido. Montar la fibra en un microscopio de epifluorescencia y la imagen a través del extremo distal de la fibra. </li><li> Adquirir imágenes de microesferas que corresponden a Eu-TTA, C30 y SAPE intensidades de emisión de fluorescencia. Filtros ópticos configuración y los tiempos de exposición de imágenes de fluorescencia de Eu-TTA, C30 y SAPE se muestran en la Tabla 2. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Canal </td><td> Eu-TTA </td><td> C30 </td><td> SAPE </td></tr><tr><td> Exciter </td><td> 365/10x </td><td> 350/50x </td><td> 546/10x </td></tr><tr><td> Beamsplitter </td><td> 525DCLP </td><td> 400DCLP </td><td> 560LP </td></tr><tr><td> Emisor </td><td> 620/60m </td><td> 460/50m </td><td> 580/30m </td></tr><tr><td> Tiempo de exposición </td><td> 1 seg</td><td> 0.3 seg </td><td> 1 seg </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Parámetros para las tres imágenes fluorescentes de la micromatriz.

<ol><li>Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+monitoring+of+gene-expression+patterns+with+a+complementary-DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray.</a> Science. 270, 467-470 (1995).</li>
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<li>Wang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-based+multiplexed+screening+and+quantitation+of+human+cytokines+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines.</a> J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).</li>
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<li>Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oil-sealed+femtoliter+fiber-optic+arrays+for+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis.</a> Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).</li>
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<li>Mukhopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Devices+to+drool+for%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Devices to drool for.</a> Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).</li>
<li>Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+diagnostics+powered+by+nanotechnologies%2C+proteomics+and+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Dent.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics.</a> J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).</li>
<li>Segal, A., Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+diagnostics%3A+enhancing+disease+detection+and+making+medicine+better%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Dent.+Educ%22%5BJournal%5D)">Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better.</a> Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).</li>
<li>St John, M. A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+6+and+interleukin+8+as+potential+biomarkers+for+oral+cavity+and+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Otolaryngol.+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).</li>
<li>Herr, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immunoassays+as+rapid+saliva-based+clinical+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).</li>
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<li>Mouse IgG1 Isotype Control [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.rndsystems.com/Products/MAB002">http://www.rndsystems.com/Products/MAB002</a> (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Los investigadores deben prestar especial atención a los siguientes pasos: para una mayor precisión de decodificación, es necesario verificar que las microesferas fueron suspendidas de forma homogénea en toda la incubación y el lavado pasos durante el proceso de codificación de microesferas. Además, las microesferas codificadas necesitan ser protegidos de la luz a lo largo de todo el experimento. Siguiendo los procedimientos de codificación y de almacenamiento adecuadas, encontramos que la precisión global de decodifica...

Desde la primera micromatriz reportado por Mark Schena y compañeros de trabajo a mediados de la década de 1990, esta potente herramienta se ha utilizado en muchos campos de la investigación biológica 1. Microarrays de anticuerpos capaces de detectar simultáneamente múltiples proteínas en los fluidos de diagnóstico, tales como la sangre, tienen aplicaciones importantes en el diagnóstico clínico y la detección de biomarcadores 2-10. La saliva, que contiene muchos de los mismos analitos como la sangre, ha sido considerada como una alternativa preferible a la sangre debido a la toma de saliva es segura, no invasiva, y puede ser llevado a cabo por el personal médico mínimamente entrenados 11-13. Actualmente, el análisis de proteínas multiplexada usando muestras de saliva está limitado por varios factores importantes, incluyendo la baja concentración de analito diana 14 y el amplio intervalo de concentración de diferentes biomarcadores 15. . En este documento, se demuestra el análisis de seis proteínas: factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF), proteína inducida por gamma-interferón 10 (IP-10), interleucina-8 (IL-8), factor de crecimiento epidérmico (EGF), metalopeptidasa matriz 9 (MMP-9), y la interleucina-1 beta (IL-1β) . El rendimiento del método se verificó inicialmente usando soluciones estándar que constituyen las proteínas recombinantes de analito y tampón de bloqueo. Muestras de saliva real obtenida de pacientes de diferentes enfermedades respiratorias crónicas, así como también controles sanos se probaron con un rendimiento satisfactorio. El protocolo debe ser aplicable a otros analitos de proteínas y otros ensayos basados ​​en microesferas. Esta plataforma ofrece ventajas considerables para el campo de la Química Analítica, ya que permite el análisis simultáneo rápido, preciso, y reproducible de bajas concentraciones de varias proteínas con un amplio rango dinámico, un mínimo de interacciones no específicas, la reducción del consumo de la muestra, y de bajo costo en comparación con un Ensayo inmunoenzimático análoga (ELISA).

<table><tbody><tr><td>Colorante Eu-TTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC42319-0010</td><td></td></tr><tr><td>THF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34865-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidrio ámbar</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-339-23B</td><td></td></tr><tr><td>Colorante cumarina 30</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>546127-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas</td><td>Bangslabs</td><td>PC05N/6698</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x concentrado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td>Agua</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tw-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>BupH MES solución salina tamponada</td><td>Thermo Scientific</td><td>28390</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05030-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Solución de NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS256-500</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga con cierre seguro</td><td>VWR labshop</td><td>53511-997</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>Captura de VEGF humano anticuerpo</td><td>R& D Systems</td><td>MAB293</td><td></td></tr><tr><td>Humano IP-10 captura anticuerpo</td><td>R& D Systems</td><td>MAB266</td><td></td></tr><tr><td>Humano IL-8 captura anticuerpo</td><td>R& D Systems</td><td>MAB208</td><td></td></tr><tr><td>Captura de EGF humano anticuerpo</td><td>R& D Systems</td><td>MAB636</td><td></td></tr><tr><td>Captura de anticuerpos MMP-9 humanos</td><td>R& D Systems</td><td>MAB936</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 humana y beta; captura de anticuerpos</td><td>R& D Systems</td><td>MAB601</td><td></td></tr><tr><td>Ratón IgG1 anticuerpo de control de isotipo</td><td>R& D Systems</td><td>MAB002</td><td></td></tr><tr><td>Tampón StartingBlock (TBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>37542</td><td></td></tr><tr><td>HCl solución estándar 1,0 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318949-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml tubos de microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>Tampón sin proteínas (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>37572</td><td></td></tr><tr><td>VEGF humano recombinante 165</td><td>R& D Systems</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante humano IP-10</td><td>R& D Systems</td><td>266-IP</td><td></td></tr><tr><td>IL-8 humano recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>208-IL</td><td></td></tr><tr><td>EGF humano recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>MMP-9 humano recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>911-MP</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 humana recombinante y beta;</td><td>R& D Systems</td><td>201-LB</td><td></td></tr><tr><td>StartingBlock T20 (PBS) tampón</td><td>Thermo Scientific</td><td>37539</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueador BSA en PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>37525</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de detección de VEGF biotinilado</td><td>R& D Systems</td><td>BAF293</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilado Anticuerpo de detección IP-10</td><td>R& D Systems</td><td>BAF266</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de detección de IL-8 biotinilado</td><td>R& D Systems</td><td>BAF208</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de detección de EGF biotinilado</td><td>R& D Systems</td><td>BAF236</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilado MMP-9 anticuerpo de detección</td><td>R& D Systems</td><td>BAF911</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 biotinilada y beta; anticuerpo de detección</td><td>R& D Systems</td><td>BAF201</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina, R-ficoeritrina</td><td>Invitrogen</td><td>S-21388</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (200 pruebas)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr></tbody></table>

multiplexado fluorescente microarrays para el análisis de proteínas salivales humanas utilizando microesferas poliméricas y paquetes de fibra óptica

Multiplexed Fluorescent Microarray for Human Salivary Protein Analysis Using Polymer Microspheres and Fiber-optic Bundles

En la presente memoria, se describe un protocolo para medir simultáneamente seis proteínas en la saliva utilizando una matriz de anticuerpos basados ​​en microesferas de fibra óptica. La tecnología de inmuno-matriz empleada combina las ventajas de la suspensión de microesferas a base de matriz de la fabricación con el uso de microscopía de fluorescencia. Como se describe en el protocolo de vídeo, comercialmente disponibles microesferas de polímero 4,5 micras fueron codificados en siete tipos diferentes, que se diferencian por la concentración de dos colorantes fluorescentes atrapados físicamente dentro de las microesferas. Las microesferas codificadas que contienen grupos carboxilo superficiales fueron modificados con anticuerpos de captura monoclonales través de la química de acoplamiento EDC / NHS. Para ensamblar el microarray de proteínas, los diferentes tipos de microesferas codificadas y funcionalizados se mezclaron y se depositan aleatoriamente en 4,5 micras micropocillos, que fueron grabadas químicamente en el extremo proximal de un haz de fibra óptica. El haz de fibra óptica se utiliza como un portador y para obtener imágenes de la microspheres. Una vez montado, se utilizó el microarray para capturar las proteínas en el sobrenadante de la saliva obtenida de la clínica. La detección se basa en un inmunoensayo de tipo sándwich usando una mezcla de anticuerpos de detección biotinilados para diferentes analitos con una sonda fluorescente conjugada con estreptavidina, R-ficoeritrina. La micromatriz Se obtuvieron imágenes por microscopía de fluorescencia en tres canales diferentes, dos para el registro de microesferas y uno para la señal de ensayo. Las micrografías de fluorescencia se descodifican y se analizaron usando un algoritmo de hecho en casa en MATLAB.

Las imágenes de fluorescencia de tres canales que muestran una pequeña sección del haz de fibra óptica se muestran en las Figuras 2A-C. Estas imágenes se analizaron utilizando un algoritmo escrito en MATLAB (como se describe en más detalle en la sección Discusión). El análisis utiliza tanto la información de la imagen de codificación de Eu-TTA (Figura 2A) y la imagen de codificación de C30 (Figura 2B) para decodificar las microesferas, y se calcularon las intensidades d...

Se describe un procedimiento para crear perfiles de proteínas salivales usando multiplexados arrays de anticuerpos basados ​​en microesferas. Los anticuerpos monoclonales se unen covalentemente al colorante fluorescente codificada 4,5 micras microesferas de polímero utilizando química de la carbodiimida. Las microesferas modificadas fueron depositados en micropocillos de fibra óptica para medir los niveles de proteína en la saliva usando inmunoensayos de tipo sándwich de fluorescencia.

Multiplexado fluorescente microarrays para el análisis de proteínas salivales humanas utilizando microesferas poliméricas y Paquetes de fibra óptica

Herein, we describe a protocol for simultaneously measuring six proteins in saliva using a fiber-optic microsphere-based antibody array. The immuno-array ...

El objetivo general de este procedimiento es analizar múltiples proteínas en muestras de saliva humana utilizando matrices fluorescentes basadas en microesferas. Primero, codifique las microesferas con diferentes cantidades de dos colorantes fluorescentes. Acople los anticuerpos de captura para diferentes proteínas sobre las microesferas codificadas.Luego, ensamblar la matriz multiplexada de proteínas sobre el haz de fibra óptica utilizando los inmunoensayos en sandwich sobre las matrices microestructuradas ensambladas para detectar múltiples proteínas en las muestras de saliva de prueba. En última instancia, el análisis mediante microscopía de fluorescencia puede medir las respuestas de señal de diferentes proteínas en las muestras de saliva. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como ELISA es que permite el análisis simultáneo de múltiples proteínas en biofluidos complejos.Aunque este método puede proporcionar información sobre el análisis de saliva humana, también puede aplicarse a otros fluidos biológicos como suero, orina y esputo. Pese la TTA de opio en un vial de vidrio ámbar y prepare una solución stock de 200 milimolar en tetrahidrofuran. Mezcle

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Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Se describe un método multiplex para la detección de microorganismos en una muestra utilizando oligonucleótidos junto perlas fluorescentes. Amplificación de todos los organismos dentro de una muestra se hibridó con un panel de cuentas, junto sonda. Un instrumento Luminex o Bio-Plex se utiliza para consultar cada cuenta para el tipo de cuentas y la señal de hibridación.

Multiplex detección de bacterias en el complejo de muestras clínicas y ambientales utilizando oligonucleótidos de acoplamiento de microesferas fluorescentes

Una descripción de la formación de un microarray de polímero utilizando una técnica de fotopolimerización en el chip. La caracterización rendimiento de alta superficie mediante microscopía de fuerza atómica, las mediciones de ángulo de contacto del agua, de rayos X y espectroscopía de fotoelectrones de tiempo de vuelo espectrometría de masa iónica secundaria y un ensayo de adhesión celular también se describe.

Microarrays de polímeros de alto rendimiento para el descubrimiento de Biomateriales

Gracias a la tecnología Luminex Corporation microesfera xMAP, hemos desarrollado el inmunoanálisis fluorométrico multiplexada (MFIA) para la vigilancia serológica de las diversas especies de animales de laboratorio. El MFIA es un microarray de suspensión donde se covalentemente con el antígeno, tejido de control o inmunoglobulinas vinculado a microesferas de poliestireno con código de color. El método de prueba MFIA, así como diversos temas de solución de problemas se aborda.

Multiplexado inmunoensayo fluorométrico Metodología de prueba y solución de problemas

Este video muestra una técnica de inmunoensayo multiplex basada en perlas para detectar simultáneamente anticuerpos contra múltiples patógenos ambientales en la saliva humana. Las perlas fluorescentes se acoplaron a antígenos de diferentes patógenos, que se capturaron utilizando anticuerpos en la muestra de saliva humana. Al marcar los anticuerpos con un indicador fluorescente, las perlas se analizaron mediante citometría de flujo para evaluar la presencia de diferentes anticuerpos específicos...

Un inmunoensayo multiplex basado en perlas para identificar anticuerpos específicos de patógenos en la saliva

Este protocolo describe la fabricación de una gran escala, multiplexado de ADN o anticuerpo matriz de dos dimensiones, con aplicaciones potenciales en los estudios de la señalización celular y la detección de biomarcadores.

Flow-patrón Fabricación guiada de alta densidad de códigos de barras de anticuerpos microarrays

La detección de fluorescencia multicolor en microfluídica de gotas suele implicar sistemas de detección basados en microscopio de epifluorescencia voluminosos y complejos. Aquí describimos un esquema de detección multicolor compacto y modular que utiliza una matriz de fibras ópticas para codificar temporalmente los datos multicolor recopilados por un solo fotodetector.

Multicolor detección por fluorescencia de la gotita de microfluídica el uso de fibras ópticas

En el clima actual de escasez de recursos, están surgiendo nuevas tecnologías que permiten a los investigadores realizar estudios más baratos, más rápidos y con más precisión. En este trabajo describimos el desarrollo de un inmunoensayo múltiple de anticuerpos salivales basado en perlas para medir la exposición humana a múltiples patógenos ambientales simultáneamente.

El desarrollo de un anticuerpo salival múltiplex inmunoensayo para medir la exposición humana a los patógenos ambientales

Demostramos una tecnología de chip de complemento para realizar inmunoensayos sandwich multiplexados Cruz-reactivity-free simplemente chasquear dos diapositivas. Un aparato de presión se utiliza para transferir confiablemente reactivos de microarray de microarrays. El chip del broche de presión puede utilizarse reacciones bioquímicas que requieren colocalización de diferentes reactivos sin contaminación cruzada.

Rápido Chip para Cruz-reactivity-libre y observador de tiro multiplexado inmunoensayos de Sandwich

Aquí, presentamos un protocolo de pantalla proteína extracelular microarrays para la identificación de las interacciones receptor-ligando novela en alto rendimiento. También se describe un método para mejorar la detección de interacciones proteína-proteína transitorias mediante el uso de complejos de proteína-microbead.

Tecnología de microarrays de proteínas extracelulares para detección de alto rendimiento de las interacciones ligando-Receptor de baja afinidad

Describimos un método de tinción rápida para realizar imágenes multiespectrales en tejidos congelados.

Un método rápido para imágenes de fluorescencia multiespectral de secciones de tejido congelado

Este informe describe un protocolo automatizado para ensayos de inmunofluorescencia múltiple (mIF) en un tintor de portaobjetos automatizado. Demuestra la alta reproducibilidad de la proteómica espacial en autotinciones tisulares estándar de alto rendimiento y generadores de imágenes de fluorescencia de portaobjetos completos, lo que es ideal para ensayos mIF personalizados en un gran número de portaobjetos de tejido en investigación traslacional.

Ensayos de inmunofluorescencia multiplex automatizados de alto rendimiento para la investigación traslacional

Aprende a analizar múltiples proteínas en saliva humana mediante microarrays fluorescentes con microesferas poliméricas y paquetes de fibra óptica. Este método multiplexado mejora la eficiencia diagnóstica.

Multiplexado fluorescente microarrays para el análisis de proteínas salivales humanas utilizando microesferas poliméricas y Paquetes de fibra óptica (Video) | JoVE Journal

Multiplexado fluorescente microarrays para el análisis de proteínas salivales humanas utilizando microesferas poliméricas y Paquetes de fibra óptica

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