Entérica invasión bacteriana de las células epiteliales intestinales

El objetivo general del siguiente experimento consiste en utilizar el modelo de cámara de difusión vertical o modelo VDC para investigar las interacciones bacterianas con una invasión de células epiteliales intestinales. Esto se logra primero mediante el uso de un filtro especial que sostiene una monocapa polarizada de células epiteliales intestinales Caco-2 para crear compartimentos laterales apical y basal separados en la VDC. En el segundo paso, se añade el inóculo bacteriano de interés al compartimento apical.

Bajo condiciones microaeróbicas y cultivo celular, se añade medio al compartimento basolateral en condiciones aeróbicas; luego, en los puntos temporales deseados durante el co-cultivo, se retira el filtro y se cuentan los números de bacterias interaccionantes o intracelulares. En última instancia, se puede observar un aumento en la cantidad de bacterias interaccionantes e intracelulares utilizando el modelo VDC en comparación con las condiciones estándar de cultivo aeróbico. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como los ensayos estándar de adhesión e invasión en cultivo de tejidos, es que con esta técnica, el co-cultivo de bacterias y células epiteliales intestinales se lleva a cabo en condiciones in vitro que imitan más de cerca las condiciones in vivo del intestino humano.

El procedimiento será demostrado por N Vida nas, estudiante de doctorado de mi laboratorio, y Dominic Mills, un postdoctorado que desarrolló el modelo de cámara de difusión vertical como parte de su doctorado en mi laboratorio. Comience sembrando cuatro por 10 a la quinta células epiteliales intestinales caco-2 por filtro de 0,4 micrones en medio de cultivo, luego cultive las células hasta la polarización durante 21 días, cambiando el medio cada dos o tres días para confirmar el estado de polarización de la monocapa. Utilice un medidor de resistencia voltiohmiómetro para medir la resistencia eléctrica transepitelial.

24 horas antes de comenzar el ensayo de co-cultivo en CVD, incubar jejuni en una placa fresca de agar sangre bajo condiciones microaeróbicas en un incubador de atmósfera variable. Al mismo tiempo, preincubar 30 mililitros de caldo Bruce bajo las mismas condiciones el día del experimento, sumergir las medias cámaras del CVD, así como las juntas tóricas y los tapones, en solución de esterilización. Luego, usar una jeringa estéril de 20 mililitros para hacer pasar la solución a través de las entradas de gas en ambas medias cámaras. Después de una hora, enjuagar las piezas del CVD con agua estéril fresca utilizando otra jeringa estéril de 20 mililitros para enjuagar las entradas de gas.

Luego, recolecte la mitad del cultivo de la placa de agar sangre CJ en un mililitro del caldo barella preincubado para obtener aproximadamente 10 a la 10ª UFC por mililitro. Mida la densidad óptica de la suspensión bacteriana a 600 nanómetros para cuantificar de forma semicuantitativa las unidades formadoras de colonias bacterianas o UFC, y luego ajuste la suspensión bacteriana al nivel deseado de inóculo en un volumen total de cuatro mililitros del caldo Bruce preincubado. Realice una dilución seriada a partir de esta suspensión bacteriana final, plaque la dilución adecuada en placas de agar sangre por triplicado e incube las placas en el incubador de atmósfera variable durante 48 horas.

Ahora, coloque la mitad inferior de la cámara del VDC plana sobre el banco y coloque una junta tórica en ella. Luego, retire un filtro que contenga las células epiteliales intestinales del soporte y lávelo tres veces con 400 microlitros de PBS estéril. Coloque el filtro sobre la mitad inferior de la cámara, asegurándose de que la junta tórica permanezca en su lugar, y luego baje suavemente la mitad superior de la cámara hasta colocarla en posición.

Una vez que las dos cámaras semicirculares estén ensambladas, sujételas juntas utilizando las abrazaderas de anillo y coloque el VDC horizontalmente sobre la superficie de trabajo con las dos aberturas orientadas hacia arriba. Añada el inóculo bacteriano en la cámara semicircular apical y luego agregue cuatro mililitros de medio de cultivo celular en la cámara semicircular basal lateral. Coloque las piezas finales en las aberturas de ambas cámaras semicirculares, y luego introduzca el VDC en el incubador de atmósfera variable.

Cerca del colector de gas, abra el regulador de suministro de gas conectado al colector. Conecte el tubo del colector a la entrada de gas en la cámara lateral basal del VDC y luego conecte el tubo de salida de gas que sale del incubador de atmósfera variable a una de las salidas en la pieza final de la cámara lateral basal. Cierre la otra salida en la pieza final de la cámara lateral basal.

Luego, abra muy lentamente el flujo de gas en el múltiple de gas para evitar una presión excesiva de gas y lograr un flujo de gas de una burbuja cada dos a cinco segundos tras el período de co-cultivo adecuado. Cierre el regulador de suministro de gas conectado al múltiple de gas. A continuación, purgue el flujo de gas hacia el VDC en el múltiple y desconecte la entrada de gas, la salida de gas y el tapón del VDC.

A continuación, retire el VDC del incubador de atmósfera variable. Luego, retire los sobrenadantes laterales apicales y basales y almacénelos a 80 grados centígrados negativos para su posterior análisis. Retire las abrazaderas de anillo y desarme cuidadosamente el VDC.

Retire el filtro de la cámara semillena y transfiéralo a una placa de cultivo celular estéril de seis pocillos. Luego, lave el VDC con agua estéril y guárdelo para la siguiente ronda de experimentos para la enumeración del número total de bacterias interaccionantes. Lave las células epiteliales intestinales de tres a cinco veces con 400 microlitros de PBS estéril y luego lisee las células en 400 microlitros de PBS estéril que contenga Triton X-100 durante 20 minutos a temperatura ambiente; realice una dilución en serie a partir del lisado celular, seguida del plaqueo de las diluciones apropiadas en placas de agar sangre por triplicado.

A continuación, incubar las placas a 37 grados Celsius en el incubador de atmósfera variable durante 48 horas para la enumeración del número total de bacterias invasoras. Incubar las células epiteliales intestinales con 400 microlitros de medio de cultivo celular que contenga 150 microgramos por mililitro de gentamicina durante dos horas en un incubador estándar de cultivo de tejidos para eliminar las bacterias extracelulares. Luego, cuantificar las unidades formadoras de colonias tras la lisis celular, dilución seriada y cultivo tal como se acaba de demostrar.

Los siguientes datos ilustran una comparación entre el número de CJ jui que interactúan con o invaden células Caco-2 tras tres, seis o 24 horas de co-cultivo en condiciones estándar de ensayo de cultivo celular frente al uso del modelo VDC. Por ejemplo, tras 24 horas de co-cultivo, menos de 10⁷ UFC de CJ juna pueden observarse interactuando con células Caco-2 bajo condiciones estándar de cultivo celular. Sin embargo, tras 24 horas de co-cultivo en el modelo VDC, aproximadamente 10⁸ UFC de CJ jui pueden observarse interactuando con células Caco-2, lo que representa un aumento casi diez veces mayor en las interacciones de CJ jui con las células epiteliales intestinales.

Al comparar el número de CJ jui invasores en condiciones de cultivo estándar frente a condiciones de cultivo en VDC, aproximadamente 10 a la quinta CFU intracelular de CGE jui pueden aislarse de las células CACO-2 tras 24 horas bajo condiciones estándar de cultivo celular. En cambio, tras 24 horas de co-cultivo en el modelo VDC, pueden aislarse aproximadamente 10 a la séptima CFU intracelular de las células CACO-2, lo que representa un aumento en el CGE intracelular de casi 100 veces. Al realizar este procedimiento, es importante monitorear el flujo de gas en la cámara basal lateral tras su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la patogénesis de abuc investigaran tanto la base genética de la interacción bacteriana con las células epiteliales intestinales, como la respuesta inmune innata del huésped frente a la infección bacteriana. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar el modelo de cámara de difusión vertical para estudiar las interacciones de otras bacterias entéricas con las células epiteliales intestinales y las condiciones que representan de manera más cercana a las del intestino humano.