Name: Entérica invasión bacteriana de las células epiteliales intestinales In Vitro Se ha mejorado considerablemente gracias a un modelo de cámara de difusión vertical (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Aprende a usar el modelo de cámara de difusión vertical (VDC) para estudiar la invasión bacteriana en células epiteliales intestinales Caco-2 bajo condiciones de oxígeno fisiológicamente relevantes. Este protocolo mejora significativamente la detección de interacciones patógeno-hospedador.

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Dominic Mills fue apoyado por una Bloomsbury Colegios Beca de doctorado (2007-2010). Los autores desean dar las gracias a Ozan Gundogdu y Abdi Elmi por su ayuda en el desarrollo del modelo VDC.

1. El crecimiento de monocapas IEC en especial 0.4 Filtros micras <ol><li> Cultura Caco-2 células en medio esencial modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% (v / v) de suero de ternero fetal, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 1% (v / v) de aminoácidos no esenciales en una tejido estándar de cultivo en estufa a 37 ° C en 5% de CO2 y 95% de aire. Seed 4 x 10 5 células Caco-2 IECs por 0,4 micras filtran y crecen a la polarización durante 21 días, el cambio de los medios de comunicación cada 2-3 días. </li><li> Mida la TEER para confirmar el estado de polarización de la monocapa utilizando un medidor de resistencia de Volt-Ohm. En nuestros estudios, la TEER de 21 días Caco-2 células cultivadas en estos filtros de 0,4 micras es 700-800 Ωcm 2. </li></ol> 2. Preparación de C. jejuni y el Medio bacteriana Para el ensayo de cocultivo <ol><li> 24 horas antes de la punto de inicio deseado del ensayo cocultivo VDC, preparar una placa de agar sangre fresca de C. jejuni y se incuba a 37 ° C en condiciones microaeróbicas (85% N 2, 5% O 2 y CO 2 del 10%) en la atmósfera variable de incubadora. </li><li> Al mismo tiempo, preincubar 30 ml de caldo de Brucella a 37 ° C en condiciones microaerobias en un ambiente incubadora variable. </li></ol> 3. Preparación y esterilización de las medias cámaras VDC antes del ensayo <ol><li> Sumerja completamente las cámaras VDC medio, así como las juntas tóricas y los tapones en la solución de esterilización. </li><li> Mediante una jeringuilla estéril 20, lave la solución de esterilización a través de las entradas de gas en ambas cámaras medio. El no hacerlo puede resultar en la contaminación de las muestras durante el cocultivo. </li><li> Deje todos los componentes inmersos en la solución de esterilización para&gt; 1 hr. </li><li> Enjuague todos los componentes con agua estéril fresco, utilizando otra jeringa estéril de 20 ml para eliminar las entradas de gas. </li></ol> 4. Preparacióndel inóculo bacteriano <ol><li> Cosecha medio de una placa de C. jejuni crecimiento de la placa de agar sangre preparó el día anterior en 1 ml del caldo de Brucella preincubado. Esto debería dar ~ 10 10 ufc / ml. </li><li> Medir la densidad óptica de la suspensión bacteriana a 600 nm para semicuantificar unidades formadoras de colonias bacterianas (CFU). </li><li> Ajustar la suspensión bacteriana al nivel de inóculo deseado en 4 ml de caldo de Brucella preincubado. </li><li> Realizar una dilución en serie a partir de esta suspensión bacteriana final, seguido de chapado de las diluciones apropiadas en placas de agar sangre, por triplicado, a continuación, se incuba a 37 ° C en la atmósfera variable de incubadora durante 48 horas para cuantificar el número de UFC bacterianas presentes en el inóculo. </li></ol> 5. Configuración del VDC <ol><li> Coloque la cámara de mitad inferior de un VDC plana sobre el banco. Coloque una junta tórica en la cámara media más baja. </li><li> Separe un filtro que llevan los IECs de tél portador y lavar tres veces con 400 l de PBS estéril. Coloque el filtro en la cámara media inferior, asegurándose de que la junta tórica permanece en su lugar. </li><li> Baje con cuidado la cámara de medio superior en su lugar. Una vez que las dos medias cámaras están montadas, la abrazadera juntas usando las abrazaderas de anillo. Coloque el VDC horizontalmente en la parte superior del banco, con las dos aberturas hacia arriba. </li><li> Añadir el 4 ml de inóculo bacteriano en la cámara de medio apical. </li><li> Añadir 4 ml de medio de cultivo celular en la cámara de medio basolateral. </li><li> Coloque las piezas de los extremos en las aberturas en ambas cámaras medio. </li></ol> 6. Colocación de la CC al colector de gas dentro de la variable de ambiente Incubadora <ol><li> Coloque el VDC a la atmósfera variable de incubadora en estrecha proximidad con el colector de gas. </li><li> Abra el regulador de suministro de gas conectado al colector de gas. Fije el tubo desde el colector en la entrada de gas en la cámara de medio basolateral de la VCC. Conecte el gas tubo de salida que conduce fuera de la variable ambiente incubadora a uno de los puntos de venta en la pieza final en la cámara de medio basolateral. </li><li> Cierre la otra salida de la pieza final en la cámara de medio basolateral. Abra el flujo de gas en el colector de gas, teniendo cuidado para abrirlo muy lentamente para evitar el exceso de presión de gas, ya que esto puede conducir a la expulsión del medio basolateral. </li><li> El objetivo es un flujo de gas de 1 burbuja cada 2-5 seg. Periódicamente comprobar el flujo de gas durante el transcurso del experimento y ajustar si es necesario. </li></ol> 7. Desmontaje del VDC después Coculture <ol><li> Después del periodo de co-cultivo apropiado, cerrar el regulador de suministro de gas conectado al colector de gas. Cierre el suministro de gas en el VDC en el colector. Desconectar la entrada de gas, la salida de gas y el tapón de la VCC. </li><li> Retire el VDC de un ambiente incubadora variable. Retirar el sobrenadante y almacenar apical y basolateral a -80 ° C para subsequenanálisis de t. </li><li> Retire las abrazaderas del anillo y tome suavemente aparte del VDC. Quite el filtro de la cámara de medio y transferir a un 6-así placa de cultivo celular estéril. Lávese las IECS tres veces con 400 l de PBS estéril. </li><li> Para la enumeración del número total de bacterias que interactúan, añadir 400 l de PBS estéril que contiene 0,1% (v / v) de Triton X-100 a las IECs y se incuba durante 20 min a temperatura ambiente para lisar la IEC. Realizar una dilución en serie de este lisado celular, seguido por chapado de las diluciones apropiadas en placas de agar sangre, por triplicado, a continuación, se incuba a 37 ° C en la atmósfera variable de incubadora durante 48 horas para cuantificar el número de interactuar UFC bacterianas. </li><li> Para la enumeración del número total de bacterias invasoras, añadir 400 l de medio de cultivo celular DMEM que contiene 150 mg / ml de gentamicina a los IECs y se incuba durante 2 horas en un incubador de cultivo de tejido estándar a 37 ° C en 5% de CO 2 y 95% aire para matar las bacterias extracelulares,luego siga como para el paso 7.4 anterior. </li></ol> 8. Limpieza del VDC después Coculture Lave el VDC con agua estéril y tienda para la siguiente ronda de experimentos.

<ol><li>Mills, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+Campylobacter+jejuni+invasion+of+intestinal+epithelial+cells+under+low-oxygen+coculture+conditions+that+reflect+the+in+vivo+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment.</a> Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).</li>
<li>Marteyn, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Shigella+virulence+in+response+to+available+oxygen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo.</a> Nature. 465, 355-358 (2010).</li>
<li>Dorrell, N., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+century+of+Campylobacter+research%3A+recent+advances%2C+new+opportunities+and+old+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).</li>
<li>Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Campylobacter+jejuni%3A+molecular+biology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).</li>
<li>Hu, L., Kopecko, D. J. Chapter 17. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHu%2C+L+%22Campylobacter%22">Campylobacter</a>. Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. , ASM Press. 297-313 (2008).</li>
<li>Everest, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+Caco-2+cells+as+a+model+for+enteric+invasion+by+Campylobacter+jejuni+and+C.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli.</a> J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).</li>
<li>Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+the+internalization+and+intracellular+survival+of+Campylobacter+jejuni+in+human+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures.</a> Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).</li>
<li>Monteville, M. R., Konkel, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin-facilitated+invasion+of+T84+eukaryotic+cells+by+Campylobacter+jejuni+occurs+preferentially+at+the+basolateral+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface.</a> Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).</li>
<li>Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+culture+methods+for+investigating+Campylobacter+invasion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms.</a> J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).</li>
<li>Schuller, S., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microaerobic+conditions+enhance+type+III+secretion+and+adherence+of+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+to+polarized+human+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells.</a> Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).</li>
<li>Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microaerophilic+conditions+permit+to+mimic+in+vitro+events+occurring+during+in+vivo+Helicobacter+pylori+infection+and+to+identify+Rho%2FRas-associated+proteins+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling.</a> J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

El uso de métodos de cultivo de células in vitro para estudiar las interacciones de patógenos bacterianos con células huésped es una técnica ampliamente utilizada en muchos laboratorios de investigación. Sin embargo, como estos ensayos de cultivo celular se realizan bajo condiciones aeróbicas, estos modelos in vitro pueden no representar con precisión el entorno in vivo en el que las interacciones huésped-patógeno se llevan a cabo. El ampliamente utilizado en modelos de infec...

Las interacciones de patógenos bacterianos con células huésped se han investigado extensamente en el uso de métodos de cultivo celular in vitro. El uso de estos ensayos de cultivo celular, la adhesión bacteriana a las células huésped, la identificación de los receptores de la célula huésped, célula huésped vías de señalización y la invasión bacteriana de células huésped todas han sido estudiados en detalle, lo que resulta en muchas observaciones importantes. Sin embargo, tales ensayos de cultivo celular se realizan bajo condiciones aeróbicas que pueden no ser representativos de la ambiente in vivo. Una limitación importante de los modelos in vitro utilizados para estudiar infecciones gastrointestinales es que las condiciones de cultivo, incluyendo altos niveles de oxígeno generalmente favorecen la supervivencia celular eucariota. Sin embargo las condiciones en el lumen intestinal serán casi anaeróbica. Patógenos entéricos en un entorno muy poco oxígeno expresan genes de virulencia cuya expresión cambia en condiciones aeróbicas 2. Como tal, los datos obtenidos utilizando el estándar de cultivo celular modelos may dar una indicación inexacta de las interacciones con las células huésped bacterianas. Campylobacter jejuni es el agente causal principal de gastroenteritis aguda bacteriana en todo el mundo, con síntomas que van desde diarrea leve hasta enteritis inflamatoria severa. La mayoría de C. jejuni infecciones producen gastroenteritis sin complicaciones, sin embargo C. jejuni es también el agente infeccioso identificado con mayor frecuencia en las neuropatías periféricas, incluyendo el síndrome de Guillain-Barré (GBS). En el Reino Unido, se estima que hay más de 500.000 casos de enteritis causadas por C. jejuni infección cada año con un coste previsto de la economía del Reino Unido de £ 580 millones. En el mundo en desarrollo, C. jejuni es la causa principal de mortalidad entre los niños. A pesar de la indudable importancia de la infección por Campylobacter y décadas de investigación, incluido el análisis basada en la genómica completa, C. jejuni patogenia es aún mal comprendood, en contraste con otros patógenos entéricos, tales como Salmonella, Escherichia coli, Shigella y Vibrio cholerae. La falta de un modelo animal pequeño conveniente es una razón principal para este 3. También el ampliamente utilizado en modelos de infección in vitro son más apropiado para el estudio de microaerophilic C. jejuni que para otros patógenos entéricos que son anaerobios facultativos. Mientras que C. jejuni es reconocido como un patógeno invasor, los mecanismos de C. jejuni invasión de las células epiteliales intestinales (IECS) aún no están claros 4,5. C. invasión jejuni ha demostrado ser dependiente de cualquiera de microfilamentos, microtúbulos, una combinación de ambos o ninguno 5. La confusión en esta zona es muy probablemente debido a la utilización de no apropiado en condiciones de ensayo in vitro. Un número de diferentes ensayos de cultivo celular se han utilizado para investigar las interacciones de C. jejunicon las células huésped. Caco-2 6, INT 407 7, y 8 líneas de células T84 han todos han utilizado para estudiar las capacidades de adherencia y la invasión de diferentes C. jejuni cepas. Sin embargo, los niveles de la adhesión bacteriana y la invasión de C. jejuni con IECs son considerablemente inferiores a los de otros patógenos entéricos 9. El cocultivo de C. jejuni con IECs se realiza normalmente en un incubador de CO2 en condiciones próximas a los niveles de oxígeno atmosférico, necesario para la supervivencia de IECs. C. la expresión de genes jejuni será muy diferente en el entorno de bajo oxígeno de la luz intestinal en comparación con las condiciones de oxígeno atmosférico. El uso de un sistema de cámara de difusión vertical (VCC) ha sido desarrollado que permite el co-cultivo de las bacterias y las células huésped bajo diferentes condiciones de medio y de gas 1,10,11. Este sistema imita las condiciones en el intestino humano, donde las bacterias no sufriráder condiciones de muy bajo, mientras que los tejidos de oxígeno se suministran con el oxígeno de la corriente de la sangre. Monocapas de IEC polarizadas cultivadas en filtros de 0,4 micras especiales se colocaron en una VCC la creación de un compartimento apical y basolateral, que se llenaron individualmente con caldo bacteriano y medio de cultivo celular, respectivamente (Figura 1). El VDC se colocó en la atmósfera variable de incubadora que contiene 85% de N 2, 5% de O 2, y CO 2 al 10% a 37 ° C, que representa las condiciones óptimas para C. jejuni. El compartimento apical se dejó abierta y expuesta a la atmósfera microaerobia dentro de la atmósfera variable de incubadora, mientras que el compartimento basolateral sellada fue suministrado con oxígeno mediante la administración constante de 5% de CO 2/95% de O 2 mezcla de gas con un tubo de salida prevención de la acumulación de la presión . Caco-2 y la supervivencia celular integridad de la monocapa en estas condiciones se confirmaron mediante la supervisión del elemento transepitelialresistencia ctrical (TEER) a través de la monocapa de más de 24 horas para demostrar la supervivencia de células Caco-2 monocapa celular y separación física de los compartimentos apical y basolateral en condiciones bajas de oxígeno en el compartimiento apical. La TEER de monocapas en los CDA mantenidos en la atmósfera incubadora variables (condiciones microaeróbicas) y en un cultivo de células de CO 2 incubadora estándar (condiciones aeróbicas) no mostró diferencias significativas, indicando la integridad de la monocapa de células en diferentes condiciones atmosféricas 1. En condiciones microaeróbicas, uniones estrechas se mantuvo presente y distribuida de manera uniforme entre los bordes de las celdas con un patrón de tinción similar a la ocludina células mantenidas en condiciones aeróbicas 1. Las interacciones de C. jejuni con células Caco-2 y células T84 en el VDC fueron investigados mediante la evaluación de la interacción bacteriana (adherencia y la invasión) y la invasión. Dos diferentes C. jejuni wild-type strains se utilizaron 1. C. jejuni 11168H es un derivado de la cepa hypermotile secuencia original NCTC11168. La cepa 11168H muestra los niveles de colonización mucho más altos en un modelo de colonización de pollo y por lo tanto se considera una cepa adecuada a utilizar para estudios de interacción huésped-patógeno. 81-176 es un aislado de humanos y es una de las cepas de laboratorio ampliamente estudiados más invasivos. C. jejuni cepas fueron añadidos al compartimiento apical de una VCC ya sea bajo condiciones microaeróbicas o aeróbico. Hemos observado tasas más altas tanto para la interacción y la invasión se registraron para C. jejuni en condiciones microaeróbicas 1. El aumento de la C. interacciones jejuni no se debieron a un aumento en el número de bacterias en condiciones microaerobias 1. Estos datos apoyan nuestra hipótesis de que el entorno de bajo nivel de oxígeno en el compartimento apical de la VCC mejora las interacciones bacteria-huésped e indica que las propiedades invasivas de C. jejuni son incraliviado en estas condiciones. Este fue el primer informe del uso del modelo de VCC para estudiar un patógeno bacteriana invasiva y pone de relieve la importancia de llevar a cabo en ensayos de infección in vitro en condiciones que más estrechamente imita la situación in vivo. El modelo VCC podría ser utilizado para estudiar las interacciones huésped-patógeno para muchas especies bacterianas diferentes.

<table><tbody><tr><td>Sistema de difusión vertical especializado para usar con insertos Snapwell</td><td>Aparato Harvard</td><td>66-0001</td><td>Colector y seis cámaras Snapwell</td></tr><tr><td>Tapas Aparato</td><td>Harvard</td><td>66-0020</td><td></td></tr><tr><td>Juntas tóricas</td><td>Aparato Harvard</td><td>66-0007</td><td></td></tr><tr><td>Abrazaderas</td><td>Aparato Harvard</td><td>66-0012</td><td></td></tr><tr><td>Filtros Snapwell (tamaño de poro 0,4 &mu; m)</td> <td>Corning Costar</td><td>3407</td><td></td></tr><tr><td>Millicell ERS-2 Volt-Ohm medidor de resistencia</td><td>Millipore</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>WPA Lightwave II espectrofotómetro</td><td>Biochrom</td><td>80-3003-72</td><td></td></tr></tbody></table>

entérica invasión bacteriana de las células epiteliales intestinales<em&gt; in vitro</em&gt; se ha mejorado considerablemente gracias a un modelo de cámara de difusión vertical

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Las interacciones de patógenos bacterianos con células huésped se han investigado extensamente en el uso de métodos de cultivo celular in vitro. Sin embargo, como estos ensayos de cultivo celular se realizan bajo condiciones aeróbicas, estos modelos in vitro pueden no representar con precisión el entorno in vivo en el que las interacciones huésped-patógeno se llevan a cabo. Hemos desarrollado un modelo in vitro de la infección en que permite que el co-cultivo de las bacterias y las células huésped bajo diferentes condiciones de medio y de gas. La cámara de difusión vertical (VCC) modelo imita las condiciones en el intestino humano, donde las bacterias estarán en condiciones de muy baja, mientras que los tejidos de oxígeno serán suministrados con el oxígeno del torrente sanguíneo. La colocación de monocapas de células epiteliales intestinales polarizadas (IEC) obtenidas en los prospectos Snapwell en una VDC crea compartimentos apical y basolateral separados. El compartimento basolateral se llena con medio de cultivo celular, sellado y perfundidos con oxígeno wHilst el compartimiento apical está lleno de caldo, mantienen abiertas y se incubaron bajo condiciones microaeróbicas. Tanto Caco-2 y T84 IECs se pueden mantener en el VDC bajo estas condiciones, sin efectos perjudiciales aparentes sobre la supervivencia celular o integridad de la monocapa. Experimentos de cocultivo a cabo con diferentes C. jejuni cepas de tipo salvaje y diferentes líneas de IEC en el modelo VCC con condiciones microaeróbicas en el compartimiento apical reproducible resultan en un aumento en el número de interactuar (casi 10 veces) y las bacterias intracelulares (casi 100 veces) en comparación a las condiciones de cultivo aerobio 1. El ambiente creado en el modelo VDC imita más de cerca el ambiente encontrado por C. jejuni en el intestino humano y pone de relieve la importancia de llevar a cabo en ensayos de infección in vitro en condiciones que imitan más estrechamente la realidad in vivo en el. Proponemos que el uso del modelo VDC permitirá nuevas interpretaciones de las interacciones apuestaween patógenos bacterianos y células huésped.

Experimentos de cocultivo realizaron con un C. jejuni cepa de tipo salvaje y los IEC en el modelo VCC con condiciones microaeróbicas en el compartimiento apical han demostrado un aumento en el número de interactuar (casi 10 veces) y las bacterias intracelulares (casi 100 veces) en comparación con las condiciones de cultivo aerobias en un momento que dependen de forma 1. Esta observación fue reproducible usando dos diferentes C. jejuni cepas de tipo salvaje (11168H y 81-176) y dos líneas de e...

Realización de ensayos de cultivo celular para investigar la adhesión bacteriana y la invasión en condiciones aerobias es generalmente representativo de la<em&gt; In vivo</em&gt; Medio ambiente. Un modelo de cámara de difusión vertical permite el estudio de las interacciones del patógeno humano<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Con las células epiteliales del intestino más bajo<em&gt; In vivo</em&gt; Condiciones similares, lo que resulta en una mayor invasión bacteriana.

Entérica invasión bacteriana de las células epiteliales intestinales<em&gt; In Vitro</em&gt; Se ha mejorado considerablemente gracias a un modelo de cámara de difusión vertical

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en utilizar el modelo de cámara de difusión vertical o modelo VDC para investigar las interacciones bacterianas con una invasión de células epiteliales intestinales. Esto se logra primero mediante el uso de un filtro especial que sostiene una monocapa polarizada de células epiteliales intestinales Caco-2 para crear compartimentos laterales apical y basal separados en la VDC. En el segundo paso, se añade el inóculo bacteriano de interés al compartimento apical.Bajo condiciones microaeróbicas y cultivo celular, se añade medio al compartimento basolateral en condiciones aeróbicas; luego, en los puntos temporales deseados durante el co-cultivo, se retira el filtro y se cuentan los números de bacterias interaccionantes o intracelulares. En última instancia, se puede observar un aumento en la cantidad de bacterias interaccionantes e intracelulares utilizando el modelo VDC en comparación con las condiciones estándar de cultivo aeróbico. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como los ensayos estándar de adhesión e invasión en cultivo de tejidos, es que con esta técnica, el co-cultivo de bacterias y célul

enteric-bacterial-invasion-intestinal-epithelial-cells-vitro-is

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este protocolo describe un co-cultivo de microfluidos modelo de cultivo simultáneo y localizada de células epiteliales y bacterias. Este modelo se puede utilizar para investigar el papel de las diferentes señales moleculares solubles en la patogénesis, así como la pantalla de la supuesta eficacia de cepas de bacterias probióticas.

Microfluidos Co-cultivo de células epiteliales y bacterias para la Investigación de la señal mediada Soluble Interacciones

Fuente: Calatayud Arroyo, M., et al. Evaluación de la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz intestino-microbio in vitro. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo demuestra un modelo intestino-microbio in vitro para estudiar la viabilidad bacteriana. Se incuba un cocultivo de células Caco-2 y HT29-MTX con bacterias pretratadas bajo condiciones digestivas simuladas. Se evalúa la integridad de la barrera epitelial utilizando resistencia eléctrica transepitelial, y se recogen...

Modelo intestinal in vitro para evaluar la adhesión bacteriana e internalización

Este video muestra un método para establecer un modelo de infección en tejidos placentarios para estudiar la propagación de la infección. Un cultivo de órganos placentarios ex vivo está infectado con Listeria monocytogenes, un parásito intracelular facultativo. Las bacterias invaden los trofoblastos extravellosos (EVT) para entrar en el tejido placentario y luego se propagan a otras células a través de la propagación de célula a célula.

Una técnica para establecer un modelo de infección bacteriana en un cultivo de órganos ex vivo

La migración transepitelial del neutrófilo en respuesta a la infección bacteriana de la mucosa contribuye a lesión epitelial y a la enfermedad clínica. Se ha desarrollado un modelo in vitro que combina patógenos, neutrófilos humanos y capas polarizadas de células epiteliales humanas cultivadas en filtros transwell para facilitar las investigaciones hacia el desentrañamiento de los mecanismos moleculares que orquestan este fenómeno.

In vitro Ensayo de cocultivo para evaluar la migración transepitelial de neutrófilos inducida por patógenos

Este protocolo describe un modelo apical-out necrotizante enterocolitis (ECN) en un plato que utiliza enteroides del intestino delgado con polaridad invertida, lo que permite el acceso a la superficie apical. Proporcionamos un protocolo de tinción inmunofluorescente para detectar la disrupción epitelial relacionada con NEC y un método para determinar la viabilidad de enteroides apicales sometidos al protocolo NEC en un plato.

In vitro Modelo enteroide apical de enterocolitis necrosante

El presente protocolo describe un método que utiliza lucifer amarillo en un modelo enteroide apical-out para determinar la permeabilidad intestinal. Este método se puede utilizar para determinar la permeabilidad paracelular en enteroides que modelan enfermedades inflamatorias intestinales como la enterocolitis necrosante.

Determinación de la permeabilidad intestinal usando amarillo de lucifer en un modelo enteroide apical-out

Escherichia coli causa sepsis en neonatos que ingieren la bacteria alrededor del momento del nacimiento. El proceso involucrado en la capacidad de E. coli para viajar desde el tracto entérico al torrente sanguíneo es poco conocido. Este modelo in vitro evalúa la capacidad de las cepas de E. coli para viajar a través de las células epiteliales intestinales.

Evaluación de la transcitosis intestinal de aislados de bacteriemia neonatal por Escherichia coli

Este protocolo describe un modelo in vitro de enterocolitis necrotizante (ECN), que puede utilizarse para estudios mecanicistas de patogénesis de la enfermedad. Cuenta con un chip microfluídico sembrado con enteroides intestinales derivados del intestino neonatal humano, células endoteliales y el microbioma intestinal de un neonato con ECN grave.

Modelo microfluídico de enterocolitis necrotizante que incorpora enteroides, enteroides, intestinos neonatales humanos y un microbioma disbiótico

El presente protocolo describe ensayos de infección para interrogar la adherencia, invasión y replicación intracelular de Shigella utilizando líneas celulares epiteliales in vitro .

Análisis de Infección de Células Epiteliales con Shigella

El estudio presenta un método para la investigación in vitro de infecciones bacterianas utilizando organoides intestinales derivados de células madre tisulares. El protocolo describe cómo cultivar y diferenciar organoides en dos dimensiones, infectarlos con Escherichia coli invasiva adherente y evaluar indicadores clave, incluyendo la ruptura de la barrera epitelial, la imagen de infecciones y la respuesta del ARN epitelial.

Un cultivo de organoides bidimensional sobre una invasina o extracto de membrana basal para estudiar las interacciones huésped-bacteria

La resistencia a los antibióticos entre cepas invasivas de Escherichia coli por adherentes plantea desafíos para evaluar la invasión bacteriana utilizando el ensayo tradicional de protección contra gentamicina. Se describe un método mejorado para evaluar cuantitativamente la invasión bacteriana enumerando unidades formadoras de colonias y cualitativamente mediante visualización de células infectadas mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia.

Ensayo de protección con amikacina para cuantificación y visualización de la invasión celular de Escherichia coli

Aprende a usar el modelo de cámara de difusión vertical (VDC) para estudiar la invasión bacteriana en células epiteliales intestinales Caco-2 bajo condiciones de oxígeno fisiológicamente relevantes. Este protocolo mejora significativamente la detección de interacciones patógeno-hospedador.

Entérica invasión bacteriana de las células epiteliales intestinales In Vitro Se ha mejorado considerablemente gracias a un modelo de cámara de difusión vertical (Video) | JoVE Journal

Entérica invasión bacteriana de las células epiteliales intestinales

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