Aislamiento de microvascular endotelial Tubos de arterias de resistencia Ratón

El objetivo general de este procedimiento es aislar los tubos de las células endoteliales de la arteria epigástrica superior del ratón o SEA para estudiar la dinámica de señalización intra e intercelular de un endotelio microvascular nativo intacto. Esto se logra aislando primero el SEA de la pared del músculo esquelético abdominal del ratón. En el segundo paso, el vaso se digiere suave y somáticamente, y luego se TAT cuidadosamente para disociar las células musculares lisas y la adventicia del tubo de células endoteliales.

En el paso final, el tubo se asegura en una cámara de flujo y se fusiona con una solución salina fisiológica. En última instancia, las imágenes confocales se pueden utilizar para visualizar la señalización del calcio en el tubo endotelial microvascular intacto nativo. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el cultivo de células endoteliales, es que las células endoteliales que componen el tubo mantienen su morfología nativa, expresión de proteínas y capacidad de respuesta, el endotelio es integral para el control del flujo sanguíneo en todo el cuerpo.

La aplicación de esta técnica nos permite investigar los eventos de señalización de célula a célula que median el control del flujo sanguíneo y cómo pueden salir mal durante la disfunción vascular. Para aislar primero el SEA, haga una pequeña incisión a través de la piel justo por encima del área de la región púbica de un ratón anestesiado, extienda la incisión lateralmente en cada dirección a las extremidades traseras respectivas, y luego continúe la incisión a lo largo de la línea media ventral hasta la parte superior de la caja torácica, extendiendo aún más la incisión lateralmente en cada dirección a las cuatro extremidades respectivas. Ahora levante suavemente la piel y corte el tejido conectivo que sujeta la piel al músculo subyacente, exponiendo toda la superficie de la musculatura abdominal.

Irriga el músculo expuesto con solución salina a temperatura ambiente. Luego, bajo un microscopio estereoscópico, levante la almohadilla de grasa ubicada en la parte inferior del esternón. Haga una incisión a través de la almohadilla de grasa y a lo largo de la costilla inferior.

El SEA ahora debe ser visible, teniendo cuidado de no dañar la arteria, irrigar el tejido expuesto con más solución salina a temperatura ambiente. Después de que la capa superior del músculo esquelético se haya retraído, observe la longitud del SEA y luego extirpe cuidadosamente la capa muscular delgada debajo de la arteria. A continuación, use pinzas en ángulo para pasar una longitud de seis suturas de seda por debajo del SCA.

A continuación, ligar la arteria y su vena adyacente para mantenerla presurizada y mantener la sangre retenida dentro de la luz del vaso. Después de ligar el SCA en el lado contralateral, haga una incisión a lo largo de la línea media de los músculos abdominales para separar los lados respectivos y luego extienda la incisión lateralmente en cada dirección como se hace para la piel. Continúe la incisión verticalmente a lo largo del borde exterior para separar completamente el músculo abdominal del cuerpo.

A continuación, corte el SEA por encima de la ligadura para mantener el sello y coloque el músculo y la arteria aislados en un vaso de precipitados de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de tampón de disección de cuatro grados centígrados. Después de aislar el músculo del otro lado del abdomen, incube los tejidos en un tampón de disección durante 10 minutos. Ahora, coloque el músculo abdominal que contiene el SEA en una placa de Petri de cuatro grados centígrados recubierta con una capa de protector de cilindro y que contiene tampón de disección Use alfileres de insectos de 0,15 milímetros para estirar el SEA y el músculo a sus longitudes in vivo aproximadas anotadas anteriormente.

Asegure el SEA al protector del cilindro, orientando el músculo de tal manera que la capa delgada que mira hacia el peritoneo quede en la parte superior. Luego, trabajando desde el sitio de ligadura aguas arriba hacia el extremo aguas abajo, despeje alrededor de uno a dos centímetros del MAR desde su vena emparejada y el tejido circundante hasta el sitio de la primera rama principal. Corte el MAR justo por encima del sitio de la rama y justo debajo de la ligadura.

A continuación, utilice un trozo de tubo elástico para conectar la parte posterior de una pipeta a una jeringa de cinco mililitros que contenga un tampón de disección helado. Asegure la punta de la pipeta de canulación dentro de la cámara de disección y canule el SEA. Luego, una vez que se hayan eliminado todos los eritrocitos, retire el SEA de la pipeta de canulación y retire la pipeta de la placa de disección para aislar los tubos endoteliales.

Primero, llene un tubo de cultivo de vidrio de 12 por 75 milímetros hasta la mitad con tampón de disección helado. Luego, después de cortar el SEA en pedazos de uno a tres milímetros, use pinzas en ángulo para transferir los pedazos arteriales al tubo de cultivo y coloque el tubo en hielo. A continuación, combine las enzimas de digestión con el tampón de disociación hasta un volumen final de un mililitro en un tubo de cultivo separado de 12 por 75 milímetros y precaliente la solución enzimática a 37 grados Celsius con un bloque calefactor.

Retire el tubo de cultivo que contiene las piezas arteriales a cuatro grados centígrados y colóquelo a temperatura ambiente para que se caliente mientras la solución enzimática se calienta a 37 grados centígrados. Aspire con cuidado el tampón de disección a temperatura ambiente del tubo de cultivo, dejando un pequeño volumen que contenga los segmentos del vaso. Ahora agregue lentamente tampón de disociación a temperatura ambiente sin enzimas a los segmentos del vaso, de modo que las piezas arteriales permanezcan en el fondo del tubo de cultivo para lavar cualquier tampón de disección restante.

Una vez que la solución enzimática haya alcanzado los 37 grados centígrados, aspire nuevamente el tampón de disociación del tubo de cultivo que contiene los segmentos del vaso, dejando un pequeño volumen que contenga los segmentos del vaso. Ahora transfiera la solución enzimática a 37 grados al tubo de cultivo e incube el tubo de cultivo en el bloque calefactor durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Durante la incubación, prepare una pipeta de literación rellenada con aceite mineral, marque la pipeta, haga una rotura limpia, rompa la pipeta con pinzas de fuego, pula la punta de la pipeta y asegúrela en una microjeringa montada en un micromanipulador.

A continuación, retraiga el émbolo de la microjeringa para llenar la pipeta con dos nanolitros de tampón de disociación y coloque la punta de la pipeta sobre la cámara de flujo al final de la incubación. Después de aspirar cuidadosamente el tampón como se acaba de demostrar, lavar los segmentos arteriales con cuatro mililitros de tampón de disociación a temperatura ambiente. A continuación, aspire suavemente un segmento de recipiente con una micropipeta de un mililitro y coloque el recipiente en una cámara de flujo con un mililitro de tampón de disociación.

Coloque la punta de la pipeta de tación cerca de un extremo del segmento del vaso y, a continuación, aspire el segmento del vaso en la pipeta de tación a unos 225 nanolitros por segundo, para no causar tensión mecánica a las células endoteliales, expulse el vaso de vuelta a la cámara. Si la digestión fue exitosa, las células musculares lisas y la adventicia se disociarán del tubo endotelial. Aleje la adventicia del tubo endotelial lo antes posible para evitar que se enrede en el tubo, y luego repita la tación como se acaba de demostrar hasta que todas las células musculares lisas estén disociadas.

Después de la iteración final, ASEE colocó el tubo endotelial aislado en el centro de la cámara de flujo, se alineó a lo largo de la dirección del flujo y retiró la pipeta de activación. Asegure las pipetas de fijación en micromanipuladores montados en cada extremo de la cámara de flujo y luego coloque sus puntas en los extremos respectivos del tubo endotelial. Baje las pipetas de fijación, una a la vez, sobre los extremos opuestos del tubo, presionando el tubo contra el fondo de la cámara, a unos 50 micrómetros de cada extremo del tubo.

Justo cuando la pipeta de fijación toca el tubo, retírela lentamente a lo largo del eje del tubo, extendiéndolo hasta su longitud aproximada in vivo. Presione la pipeta contra el fondo de la cámara para asegurar el tubo y, a continuación, comience el flujo de la solución de superfusión utilizando una bomba peristáltica para mantener un flujo constante de la solución de superfusión a través del tubo endotelial. En esta imagen de contraste de interferencia diferencial, se muestra un tubo de células endoteliales aisladas de un seguimiento de SEA, una superfusión de una hora con tampón de superfusión a tres mililitros por minuto a temperatura ambiente.

Esta película muestra las respuestas de calcio de un tubo de células endoteliales cargado de gripe en respuesta a una estimulación de acetilcolina de un micromolar. Estas imágenes de fluorescencia representativas se recogieron en varios momentos después de la estimulación del tubo endotelial con acetilcolina. Observe cómo oscila el calcio intracelular con el tiempo.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe evitar dañar mecánicamente el tubo endotelial durante la posición y la fijación triples, ya que las células endoteliales son extremadamente delicadas y se dañan fácilmente. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo aislar los tubos endoteliales de la arteria epigástrica superior del ratón y, por lo tanto, estudiar el endotelio microvascular intacto nativo.