Aislamiento de microvascular endotelial Tubos de arterias de resistencia Ratón

El objetivo general de este procedimiento es aislar tubos de células endoteliales de la arteria epigástrica superior del ratón o AEP para estudiar la dinámica de señalización intra e intercelular de un endotelio microvascular nativo e intacto. Esto se logra primero aislado la AEP de la pared muscular esquelética abdominal del ratón. En el segundo paso, el vaso se digiere suave y somáticamente, y luego se trata cuidadosamente con TAT para disociar las células musculares lisas y la adventicia del tubo de células endoteliales.

En el paso final, el tubo se fija en una cámara de flujo y se perfunde con una solución salina fisiológica. Finalmente, se puede utilizar la microscopía confocal para visualizar la señalización de calcio en el tubo endotelial microvascular intacto y nativo. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el cultivo de células endoteliales es que las células endoteliales que componen el tubo conservan su morfología nativa, expresión de proteínas y capacidad de respuesta. El endotelio es fundamental para el control del flujo sanguíneo en todo el organismo.

La aplicación de esta técnica nos permite investigar los eventos de señalización entre células que median el control del flujo sanguíneo y cómo pueden alterarse durante la disfunción vascular. Para aislar primero la SEA, realice una pequeña incisión a través de la piel justo por encima de la región púbica de un ratón anestesiado, extienda la incisión lateralmente en cada dirección hacia las respectivas extremidades posteriores, y luego continúe la incisión rostralmente a lo largo de la línea media ventral hasta la parte superior de la caja torácica, extendiendo aún más la incisión lateralmente en cada dirección hacia las cuatro extremidades. Ahora levante suavemente la piel y corte el tejido conectivo que la une al músculo subyacente, exponiendo toda la superficie de la musculatura abdominal.

Lave el músculo expuesto con solución salina a temperatura ambiente. Luego, bajo un microscopio estereoscópico, levante la almohadilla de grasa ubicada en la parte inferior del esternón. Haga una incisión a través de la almohadilla de grasa y a lo largo de la costilla inferior.

El SEA debe ser ahora visible; tenga cuidado de no dañar la arteria e irriague el tejido expuesto con más solución salina a temperatura ambiente. Después de haber retraído la capa superior del músculo esquelético, observe la longitud del SEA y luego extirpe cuidadosamente la delgada capa muscular situada debajo de la arteria. A continuación, use pinzas anguladas para pasar un trozo de sutura de seda seis-oh por debajo de la ASC.

A continuación, ligue la arteria y la vena adyacente para mantenerla presurizada y conservar la sangre dentro de la luz del vaso. Después de ligar la ASC en el lado contralateral, realice una incisión a lo largo de la línea media de los músculos abdominales para separar los lados correspondientes, y luego extienda la incisión lateralmente en cada dirección, como se hizo con la piel. Continúe la incisión verticalmente a lo largo del borde externo para separar completamente el músculo abdominal del cuerpo.

Luego, corte el SEA por encima de la ligadura para mantener el sello y coloque el músculo y la arteria aislados en un vaso de precipitados de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de tampón de disección a cuatro grados Celsius. Después de aislar el músculo desde el otro lado del abdomen, incube los tejidos en tampón de disección durante 10 minutos. Ahora, coloque el músculo abdominal que contiene el SEA en una placa de Petri a cuatro grados Celsius recubierta con una capa de cyl guard y que contenga tampón de disección. Use alfileres para insectos de 0,15 milímetros para estirar el SEA y el músculo hasta sus longitudes aproximadas in vivo previamente anotadas.

Sujete la AVE al protector cilíndrico orientando el músculo de forma que la capa delgada que mira hacia el peritoneo quede en la parte superior. Luego, trabajando desde el sitio proximal de la ligadura hacia el extremo distal, desprenda aproximadamente uno a dos centímetros de la AVE de su vena pareada y de los tejidos circundantes hasta el primer sitio de bifurcación importante. Corte la AVE justo por encima del sitio de bifurcación y justo por debajo de la ligadura.

A continuación, utilice un trozo de tubo elástico para conectar la parte posterior de una pipeta a una jeringa de cinco mililitros que contenga tampón de disección frío con hielo. Sujete la punta de la pipeta de canalización dentro de la cámara de disección y canalice la SEA. Luego, una vez que se hayan eliminado todos los eritrocitos, retire la SEA de la pipeta de canalización y retire la pipeta del recipiente de disección para aislar los tubos endoteliales.

Primero, llene un tubo de cultivo de vidrio de 12 por 75 milímetros hasta la mitad con tampón de disección frío con hielo. Luego, después de cortar la SEA en fragmentos de uno a tres milímetros, use pinzas angulares para transferir los fragmentos arteriales al tubo de cultivo y coloque el tubo en hielo. A continuación, combine las enzimas de digestión con el tampón de disociación hasta un volumen final de un mililitro en otro tubo de cultivo de 12 por 75 milímetros y precaliente la solución enzimática a 37 grados Celsius utilizando un bloque calefactor.

Retire el tubo de cultivo que contiene los fragmentos arteriales de cuatro grados Celsius y colóquelo a temperatura ambiente para que se caliente, mientras la solución enzimática se calienta a 37 grados Celsius. Aspire con cuidado el tampón de disección, que ahora está a temperatura ambiente, del tubo de cultivo, dejando un pequeño volumen que contenga los segmentos del vaso. A continuación, agregue lentamente tampón de disociación sin enzimas a temperatura ambiente a los segmentos del vaso, de manera que los fragmentos arteriales permanezcan en el fondo del tubo de cultivo, con el fin de eliminar cualquier resto de tampón de disección.

Una vez que la solución enzimática haya alcanzado 37 grados Celsius, aspire el tampón de disociación del tubo de cultivo que contiene los segmentos de vaso nuevamente, dejando un pequeño volumen que contenga los segmentos de vaso. A continuación, transfiera la solución enzimática a 37 grados al tubo de cultivo e incube el tubo de cultivo en el bloque calefactor durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Durante la incubación, prepare una pipeta de titulación rellenada con aceite mineral, marque la pipeta, haga una fractura limpia, rompa la pipeta con fórceps encendido, pulse la punta de la pipeta y fíjela en una microjeringa montada en un micromanipulador.

A continuación, retraiga el émbolo de la microjeringa para llenar la pipeta con dos nanolitros de tampón de disociación y coloque la punta de la pipeta sobre la cámara de flujo al final de la incubación. Después de aspirar cuidadosamente el tampón tal como se acaba de demostrar, lave los segmentos arteriales con cuatro mililitros de tampón de disociación a temperatura ambiente. A continuación, aspire suavemente un segmento vascular con una micropipeta de un mililitro y coloque el vaso en una cámara de flujo con un mililitro de tampón de disociación.

Coloque la punta de la pipeta de tación cerca de uno de los extremos del segmento vascular y luego aspire el segmento dentro de la pipeta de tación a aproximadamente 225 nanolitros por segundo, para no causar estrés mecánico a las células endoteliales; a continuación, expulse el vaso de nuevo a la cámara. Si la digestión fue exitosa, las células musculares lisas y la adventicia se disociarán del tubo endotelial. Retire la adventicia del tubo endotelial lo antes posible para evitar que se enrede con el tubo, y luego repita la tación tal como se acaba de demostrar hasta que todas las células musculares lisas se hayan disociado.

Después de la última iteración, ASEE colocó el tubo endotelial aislado en el centro de la cámara de flujo, alineado en la dirección del flujo, y retiró la pipeta desencadenante. Fije firmemente las pipetas de sujeción en micromanipuladores montados en cada extremo de la cámara de flujo y luego coloque sus puntas en los extremos respectivos del tubo endotelial. Baje las pipetas de sujeción, una a la vez, sobre extremos opuestos del tubo, presionando el tubo contra el fondo de la cámara, aproximadamente a 50 micrómetros de cada extremo del tubo.

Justo cuando la pipeta de sujeción toca el tubo, retire lentamente la pipeta a lo largo del eje del tubo, extendiéndolo hasta su longitud aproximada in vivo. Presione la pipeta contra el fondo de la cámara para asegurar el tubo y luego comience el flujo de la solución de superfusión mediante una bomba peristáltica para mantener un flujo constante de la solución de superfusión a través del tubo endotelial. En esta imagen de contraste de interferencia diferencial, se muestra un tubo aislado de células endoteliales procedente de un SEA tras una superfusión de una hora con tampón de superfusión a tres mililitros por minuto a temperatura ambiente.

Esta película muestra las respuestas de calcio en un tubo de células endoteliales cargado con fluo-4 frente a una estimulación con acetilcolina de un micromolar. Estas imágenes de fluorescencia representativas se obtuvieron en diferentes momentos tras la estimulación del tubo endotelial con acetilcolina. Observe cómo el calcio intracelular oscila a lo largo del tiempo.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar evitar dañar mecánicamente el tubo endotelial durante la posición y sujeción con agujas, ya que las células endoteliales son extremadamente delicadas y se dañan fácilmente. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo aislar tubos endoteliales de la arteria epigástrica superior del ratón y, de este modo, estudiar el endotelio microvascular nativo e intacto.