Un modelo in vitro para estudiar las respuestas inmunitarias de las células mononucleares de sangre periférica humana a la infección por el virus respiratorio sincitial humano

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la respuesta de las células inmunitarias humanas a la infección por el virus respiratorio sincitial o VRS. Esto se logra primero cultivando una cepa infecciosa del VRS en células HEp-2. En el segundo paso, la cepa cultivada del VRS se purifica mediante ultracentrifugación.

A continuación, las células inmunitarias sanguíneas primarias humanas se aíslan mediante centrifugación por densidad. En la etapa final, las células inmunitarias aisladas se estimulan con el virus. En última instancia, la respuesta inmunitaria celular frente a la infección por VSR se puede evaluar mediante ELIZA QPCR o citometría de flujo.

Esta técnica constituye un valioso aporte para el estudio de infecciones virales del sistema respiratorio en sitio. El VSR es altamente adaptativo a los seres humanos. Por lo tanto, es importante utilizar células inmunitarias humanas para estudiar las vías inflamatorias implicadas en la patogénesis del virus.

Aunque el virus utilizado en este video es el VSR, este método también se puede adaptar fácilmente para estudiar otros virus, como el virus de la influenza o el rinovirus. Comience calentando un vial del stock de siembra de VSR humano en un baño de agua a 37 grados Celsius. Una vez que el virus se haya descongelado, diluya el stock en alícuotas de cuatro mililitros de medio de infección por frasco.

Manteniendo la MOI en 0,1 o inferior, agregue el virus a las células Heli con el menor volumen total posible sin que las células se sequen. Luego, incube los cultivos durante dos a cuatro horas a 37 grados Celsius y 5 %CO2, agitando suavemente el frasco cada 15 minutos para redistribuir el medio. A continuación, retire el inóculo y lave las células una vez con PBS.

Luego, agregue 15 mililitros de medio de cultivo a los frascos e incúbelos durante tres a cinco días bajo las mismas condiciones de cultivo. Observe las células una vez al día, todos los días, mediante microscopía de campo brillante normal para detectar cambios citopatológicos inducidos por el virus. Cuando se observen estos cambios, raspe las células para recolectar el VSR y luego recopile la suspensión en un tubo estéril de 50 mililitros, cortexe las células y centrifúguelas durante 10 minutos a 1800 Gs y temperatura ambiente para obtener un sedimento de los restos celulares.

El VSR no forma un precipitado a esta velocidad, por lo tanto, el sobrenadante se puede almacenar a menos 80 grados Celsius como stock de siembra en un mililitro. Los alícuotas para uso futuro siempre deben congelarse rápidamente en nitrógeno líquido para prevenir la pérdida de partículas virales infecciosas. Para purificar el VSR, comience colocando un tubo de centrífuga estéril en cada cubeta de una ultracentrífuga.

Luego, agregue cinco mililitros de solución de sacarosa recién preparada y filtrada estérilmente en la parte inferior de cada tubo. A continuación, agregue muy lentamente 30 mililitros de la solución de VSR encima de la solución de sacarosa, teniendo cuidado de no perturbar la solución de sacarosa y de mantener las capas bien definidas. Luego, en una cabina de flujo laminar para mantener la esterilidad, equilibre cuidadosamente los seis cubos de ultracentrifugación con PBS estéril hasta que su peso sea igual con una diferencia máxima de 0,1 gramos entre ellos, incluyendo las tapas. Centrifugue el virus durante 1,5 horas a 20.000 RCF y 4 grados Celsius.

Luego, cuando finalice la centrifugación, utilice una pinza estéril para retirar cuidadosamente los tubos de centrifuga de los portamuestras. Las partículas virales habrán atravesado la capa de sacarosa para formar un precipitado. Incline los tubos de centrifuga sobre un frasco para residuos virales y deje que el tubo escurra boca abajo sobre una superficie estéril.

No permita que el pellet se seque por completo. A continuación, deje cuidadosamente que un mililitro de HPSS pase sobre el pellet e incline nuevamente el tubo de centrífuga para drenar el HPSS. Luego, gire el tubo boca abajo nuevamente, teniendo cuidado de evitar que el pellet se seque.

Ahora, resuspenda el precipitado 40 veces en otro mililitro de HBSS, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas, ya que estas pueden destruir el virus. Luego, congele rápidamente alícuotas del virus en nitrógeno líquido. Almacene el virus a menos 80 grados Celsius hasta su cuantificación y uso posterior. Después de obtener sangre en tubos de 10 mililitros con EDTA de voluntarios sanos, diluya la sangre con PBS a temperatura ambiente hasta dos veces, con un máximo de 35 mililitros de sangre diluida en un tubo de 50 mililitros.

A continuación, coloque una aguja estéril con bloqueo de cebo en una jeringa estéril de 50 mililitros y aspire luego el medio de gradiente de densidad hacia la jeringa. Coloque la aguja en el fondo del tubo de sangre diluida e introduzca cuidadosamente 15 mililitros de medio de gradiente de densidad por debajo de la sangre, manteniendo una delimitación nítida entre el gradiente de densidad y la sangre. Ahora, separe las células durante 20 minutos a 800 GS a temperatura ambiente, con aceleración máxima y sin frenado. Tras la separación, los eritrocitos se encuentran en el sedimento en el fondo del tubo, con una capa plateada de neutrófilos encima.

La capa clara sobre el sedimento contiene el medio de gradiente de densidad y la capa delgada entre el medio de gradiente de densidad y la capa superior de plasma sanguíneo contiene los pbmc. Utilice una pipeta Pasteur para recolectar cuidadosamente los pbmc, luego transfiera las células a un nuevo tubo de 50 mililitros sobre hielo. Añada PBS frío con hielo hasta un volumen de 50 mililitros y sediméntese las células cuando finalice la centrifugación.

Aspire el sobrenadante y lave el sedimento con 50 mililitros de PBS frío dos veces; después del segundo lavado, agregue un mililitro de medio frío al sedimento, cuente las células y ajuste la concentración celular a cinco por 10 a la seis pbmc por mililitro. Para estimular los pbmc con RSV vivo primero, agregue 100 microlitros de pbmc a cada pocillo de una placa de fondo redondo de 96 pocillos. Luego agregue 50 microlitros de dos estímulos recién diluidos a cada uno.

Incube bien la placa durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5 %CO2, luego centrifugue la placa y recoja el sobrenadante para su análisis posterior mediante ELISA. Las PBMC estimuladas en el sedimento pueden analizarse mediante QPCR o teñirse para citometría de flujo. Al realizar el experimento de estimulación A-P-B-M-C, se recomienda el método de fraccionamiento de estímulos junto con este procedimiento.

Las condiciones se dividen en condiciones de estímulos estándar, como RPMI o VSR humano, y condiciones con fracciones de prueba, como mial, dipéptido o LPS. Es importante destacar que en cada experimento siempre se incluye un control negativo, como RPMI solo, y un control positivo, como LPS. Tras 24 horas de estimulación con VSR, diferentes poblaciones de PBMC muestran una tasa de infección dependiente de la dosis y una diferencia en la eficiencia de infección por VSR. Tras 24 horas de estimulación con el virus, el análisis por qPCR de los PBMC para la expresión de TNF alfa o interferón gamma demuestra que el VSR induce una marcada sobreexpresión en la transcripción de estas dos citocinas inflamatorias. Por el contrario, la estimulación con miam, dipéptido o LPS resulta únicamente en una expresión débil de ARNm.

Cuando los BMC de p se estimulan con RSV y el dipéptido MIAL juntos, se observa una potente regulación positiva sinérgica. Los pbmc estimulados también se analizaron en cuanto a su producción de TNF alfa o interferón gamma mediante ELIZA. En contraste con las observaciones a nivel transcripcional, RSV es un pobre inductor de la secreción de proteínas de TNF alfa e interferón gamma; la estimulación con el dipéptido MIAM induce la producción de pequeñas cantidades de TNF alfa y ninguna de interferón gamma.

De forma similar a los análisis transcripcionales, tanto el TNF alfa como el interferón gamma muestran una regulación positiva sinérgica cuando se estimulan conjuntamente con RSV y el dipéptido MIAM como control para determinar si la inducción de citocinas depende de la replicación del RSV. Los PBMC se estimularon con RSV vivo o inactivado con beta-propiolactona, tal como se ilustra en las gráficas; tanto el RSV vivo como el inactivado indujeron la producción de citocinas proinflamatorias. No olvide que los experimentos con RSV deben realizarse dentro de una cabina de seguridad biológica en un laboratorio de nivel de seguridad biológica 2.

Además, es fundamental recordar, al intentar este método, utilizar reactivos y materiales libres de endotoxinas durante todo el procedimiento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estimular los PBMC humanos con el VSR y de varios ensayos que pueden utilizarse para analizar la respuesta inmunitaria.