Un modelo in vitro para estudiar las respuestas inmunitarias de las células mononucleares de sangre periférica humana a la infección por el virus respiratorio sincitial humano

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la respuesta de las células inmunitarias humanas a la infección por el virus respiratorio sincitial o VRS. Esto se logra cultivando primero una reserva infecciosa de VRS en células helo. En el segundo paso, el material cultivado de RSV se purifica por ultracentrifugación.

A continuación, las células inmunitarias primarias de la sangre humana se aíslan mediante centrifugación por densidad. En el paso final, las células inmunitarias aisladas se estimulan con el virus. En última instancia, la respuesta inmunitaria celular a la infección por VRS puede evaluarse mediante QPCR por E iza o citometría de flujo.

Esta técnica es una valiosa adición para el estudio de las infecciones respiratorias sin situ por virus. El VRS es altamente adaptable a los humanos. Por lo tanto, es importante utilizar células inmunitarias humanas para estudiar las vías inflamatorias implicadas en la patogénesis del virus.

Aunque el virus utilizado en este vídeo es el VRS, este método también se puede adaptar fácilmente para estudiar otros virus como el virus de la gripe o el rinovirus. Comience calentando un frasco de asientos para VRS humanos y un baño de agua a 37 grados centígrados. Cuando el virus se haya descongelado, diluir el caldo en cuatro mililitros de alícuotas de medio infeccioso por matraz.

Manteniendo el MOI en 0,1 o menos, agregue el virus a las células heli y un volumen total lo más bajo posible sin que las células se sequen. Y luego incubar los cultivos durante dos a cuatro horas a 37 grados centígrados y 5% de CO2, agitando el matraz cada 15 minutos para redistribuir el medio. A continuación, retire el inóculo y lave las células una vez con PBS.

A continuación, añada 15 mililitros de medio de cultivo a los matraces e incubelos durante tres a cinco días en las mismas condiciones de cultivo. Observe las células una vez al día todos los días bajo microscopía de campo claro normal para detectar cambios citopatológicos inducidos por virus. Cuando se observan estos cambios, raspe las células para recolectar el VRS y luego recoja la suspensión en un tubo estéril de 50 mililitros, cortexe las células y luego centrifugue durante 10 minutos a 1800 Gs y temperatura ambiente para pellet los restos celulares.

El VRS no se granula a esta velocidad y, por lo tanto, el sobrenadante se puede almacenar a menos 80 grados centígrados como material de siembra en un mililitro. Las alícuotas para uso futuro siempre congelan el VRS y el nitrógeno líquido para evitar la pérdida de partículas virales infecciosas. Para purificar el VRS, comience colocando un tubo de centrífuga estéril en cada cubo de una ultracentrífuga.

Luego agregue cinco mililitros de solución de sacarosa esterilizada con filtro recién preparada en el fondo de cada tubo. A continuación, muy lentamente, agregue 30 mililitros de la solución de VRS encima de la solución de sacarosa, teniendo cuidado de no alterar la solución de sacarosa y de mantener las capas separadas. Luego, en una cabina de flujo para mantener la esterilidad, equilibre cuidadosamente los seis cubos de ultracentrifugación con PBS estéril a una distancia de 0,1 gramos entre sí, incluidas las tapas. Centrifugar el virus durante 1,5 horas a 20.000 RCF y cuatro grados centígrados.

Y luego, cuando se complete el centrifugado, use una pinza estéril para quitar con cuidado los tubos de centrífuga de los cubos. Las partículas del virus habrán pasado a través de la capa de sacarosa para formar una bolita. Coloque los tubos de centrífuga en un matraz de desechos virales y deje que el tubo se drene boca abajo sobre una superficie estéril.

No deje que el pellet se seque por completo. A continuación, con cuidado, deje que un mililitro de HPSS corra sobre el pellet y vuelva a inclinar el tubo de centrífuga para drenar el HPSS. A continuación, vuelva a poner el tubo boca abajo, teniendo cuidado de que el pellet no se seque.

Ahora tripular el pellet 40 veces en otro mililitro de HBSS, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas, ya que esto puede destruir el virus. A continuación, congele las alícuotas del virus en nitrógeno líquido. Almacene el virus a menos 80 grados centígrados hasta su cuantificación y uso posterior. Después de obtener sangre en tubos de EDTA de 10 mililitros de voluntarios sanos, diluya la sangre con PBS a temperatura ambiente hasta dos veces hasta un máximo de 35 mililitros de sangre diluida en un tubo de 50 mililitros.

A continuación, conecte una aguja de bloqueo de señuelo estéril a una jeringa estéril de 50 mililitros y luego aspire los medios de gradiente de densidad en la jeringa. Coloque la aguja en la parte inferior del tubo de sangre diluida y pipetee cuidadosamente 15 mililitros de medio de gradiente de densidad debajo de la sangre, manteniendo una demarcación clara entre el gradiente de densidad y la sangre. Ahora separe las células durante 20 minutos a 800 GS a temperatura ambiente a la máxima aceleración con la ruptura Después de la separación, los eritrocitos se encuentran en el pellet en la parte inferior del tubo con una capa plateada de neutrófilos en la parte superior.

La capa transparente por encima del gránulo contiene el medio de gradiente de densidad y la capa delgada entre el medio de gradiente de densidad y la capa de plasma sanguíneo en la parte superior contiene el pbmc. Use una pipeta más pastosa para recoger cuidadosamente el pbmc, luego transfiera las células a un nuevo tubo de 50 mililitros con hielo. Agregue PBS helado a un volumen de 50 mililitros y granule las celdas cuando se complete el centrifugado.

Aspire el sobrenadante y lave el pellet en 50 mililitros de PBS helado dos veces después del segundo lavado, agregue un mililitro de medio helado al pellet, cuente las células y ajuste la concentración de células a cinco veces 10 a seis pbmc por mililitro. Para estimular primero el pbmc con VRS vivo, agregue 100 microlitros de pbmc a cada pocillo de una placa inferior redonda de 96 pocillos. A continuación, añade 50 microlitros de dos estímulos recién diluidos a cada uno.

Incubar bien la placa durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5%CO2, y luego centrifugar la placa, recoger el sobrenadante para su posterior análisis por Eliza. El pbmc estimulado en el pellet puede analizarse mediante QPCR o teñirse para citometría de flujo. Al realizar el experimento de estimulación A-P-B-M-C, se sugiere el método de fracción de estímulos con este método.

Las condiciones se dividen en condiciones de estímulos estándar, como RPMI o RSV humano, y condiciones de fracción de prueba, como mial, dipéptido o LPS. Es importante destacar que un control negativo como RPMI solo y un control positivo como LPS siempre se incluyen en cada experimento después de 24 horas de estimulación con RSV diferentes poblaciones de PBMC muestran una tasa de infección dependiente de la dosis y una diferencia en la eficiencia de la infección por RSV Después de 24 horas de estimulación con el virus qPCR R, el análisis de las P BMC para la expresión de TNF alfa o interferón gamma demuestra que el VRS induce una regulación positiva robusta de la transcripción de estas dos citocinas inflamatorias. Por el contrario, la estimulación con dipéptido miam o LPS da como resultado solo una expresión débil de ARNm.

Cuando las P BMC se estimulan con el dipéptido RSV y MIAL juntos, se observa una fuerte regulación sinérgica al alza. También se analizaron las pbmc estimuladas para su producción de TNF Alfa o Interferón gamma por Eliza. En contraste con las observaciones a nivel transcripcional, el VRS es un mal inductor de la secreción de proteínas TNF alfa e interferón gamma por p La estimulación de BMCs con dipéptido miam da como resultado la producción de bajas cantidades de TNF alfa y ningún interferón gamma.

De manera similar a los análisis transcripcionales, tanto el TNF alfa como el interferón gamma exhiben una regulación sinérgica cuando se coestimulan con el VRS y el dipéptido MIAM como control para ver si la inducción de citocinas depende de la replicación del VRS. Las P BMC se estimularon con VRS vivo o beta propal, inactivado por lactona, como se ilustra en los gráficos, tanto el VRS vivo como el inactivado indujeron la producción de citocinas PROINFLAMATORIAS. No olvide que los experimentos con VRS deben realizarse en una cabina de seguridad biológica en un laboratorio dual de nivel de bioseguridad.

Además, si bien es crucial intentar este método recordar usar reactivos y materiales libres de endotoxinas durante todo el procedimiento. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo estimular la pbmc humana con RSV y de varios ensayos que se pueden usar para analizar la respuesta inmune.