Name: Anticancerosos complejos metálicos: Síntesis y Evaluación de la citotoxicidad por el ensayo MTT (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Aprende a sintetizar compuestos metálicos sensibles al aire de titanio y vanadio para evaluar su citotoxicidad en líneas celulares cancerosas humanas mediante el ensayo MTT. Este método permite determinar valores de IC50.

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Se ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación dentro del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (FP7/2007-2013) / acuerdo de subvención del CEI no [239603]

<ol><li> Preparación de la V (V) complejo (Figura 2); 18 conducta pasos 1.1 a 1.4 en una caja de guantes, si una caja de guante no está disponible, vaya a la alternativa pasos 2 (2.1 a 2.6). <ol><li> Disolver 0,42 mmol de los ligandos H 2 L en THF seco y agregarlo a una solución en agitación de cantidades equivalentes de VO (O i Pr) 3 en THF. </li><li> Se agita la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 15 min, y eliminar los volátiles a vacío. </li><li> Añadir hexano frío y quitarlo al vacío. Un polvo de color púrpura oscuro se debe obtener en un rendimiento cuantitativo. </li><li> Pesar 8 mg del compuesto obtenido en un vial Eppendorf. Vaya directamente al paso 3. </li></ol></li><li> Preparar el complejo V (V) utilizando una línea Schlenk. <ol><li> Disolver 0,42 mmol del ligando H 2 L en THF seco en un matraz de Schlenk seco con una tapa de septo, se unen a una línea de Schlenk y se aplica entornos de vacío / gas inerte (N 2 o Ar) alterna; se recomienda aplicar tres sUCH rondas y esperar 2-5 minutos en las etapas de vacío. </li><li> Añadir THF seco mediante una jeringa a través del tapón de septo. </li><li> Añadir cantidades equivalentes de VO (O i Pr) 3 en una solución de THF, que había sido preparado de manera similar enganchando un matraz de Schlenk seco adecuado a la línea, la aplicación de un entorno inerte y la adición de los reactivos a través de una jeringa de la solución de vanadio a la de el ligando. </li><li> Se agita la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 15 min y eliminar los volátiles a vacío, y si no es una preocupación de los productos inestables, tipo Schlenk de realizar la destilación de los volátiles bajo atmósfera inerte, el uso de flujo de gas inerte para unir el material de vidrio se requiere que había sido secado previamente . </li><li> Añadir hexano frío y quitarlo al vacío. Un polvo de color púrpura oscuro se debe obtener en un rendimiento cuantitativo. </li><li> Pesar 8 mg del compuesto obtenido en un vial Eppendorf. </li></ol></li><li> Preparación de Ti (IV) complejo (Figura 2); 28 </sarriba&gt; conducta pasos 3.1 a 3.3 en una caja de guantes, si una caja de guantes no está disponible, ajustar las medidas alternativas analizadas para el análogo de vanadio (paso 2), que emplean una línea Schlenk lugar. <ol><li> Disolver 0,35 mmol del ligando H 2 L en THF seco y agregarlo a una solución en agitación de cantidades equivalentes de Ti (O i Pr) 4 en THF. </li><li> Se agita la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 2 h. Eliminar los compuestos volátiles a vacío para dar un producto amarillo con un rendimiento cuantitativo. </li><li> Pesar 8 mg del compuesto obtenido en el vial Eppendorf. </li></ol></li><li> Preparación de las células HT-29 placa de 96 pocillos <ol><li> Cultura HT-29 células en un matraz de 75 cm 2 con medio RPMI-1640 que contiene 1% de penicilina / antibióticos estreptomicina, 1% de L-glutamina, y suero bovino fetal al 10% (FBS), a 37 ° C con 5% de CO 2 . </li><li> Retire el medio cuando las células HT-29 alcanzan la confluencia máxima (90-100%, cada 3-4 días sin subcultura). Lavar con 1 mlde tripsina (0,25%) / EDTA (0,05%) solución y retírela. </li><li> Añadir 1 ml de tripsina (0,25%) / EDTA (0,05%) de la solución e incubar durante 5 min. </li><li> Separar las células HT-29 del matraz y añadir 10 ml del medio para desactivar la actividad de la tripsina. Transferir 5 ml de la mezcla de células a un tubo. </li><li> Use la pipeta para transferir unas gotas de la mezcla de las células en la cámara de mostrador. La cámara de contador incluye 5 x 5 plazas. </li><li> Contar las células en 5 cuadrados representativos usando un microscopio: los 4 cuadrados en las esquinas y la que está en el medio. </li><li> Calcula el importe estimado de las células presentes. Suma las celdas en las 5 plazas representativas y dividir por 20. </li><li> Divida 0.6 por el resultado de la etapa 4.7. El número recibido es la cantidad de mezcla de células requerido por placa. Este cálculo se refiere a una placa que contiene 0,6 x 10 6 células (9000 células por pocillo). </li><li> Use la pipeta para transferir la cantidad de mezcla de células requerido por ptarde (tal como se calcula en la sección 4.8) y añadir 13,2 ml del medio (200 l por pocillo × 66 pozos). </li><li> Añadir la mezcla a placas de 96 pocillos con una pipeta de 11 canales (200 l por pocillo, 6 líneas, 66 pozos en total). Un pozo de cada línea debe permanecer vacío para el control blanco. </li><li> Incubar la placa a 37 ° C con 5% de CO 2 durante 24 horas para permitir que las células se unan a la placa. </li></ol></li><li> La inserción de los compuestos <ol><li> Añadir 200 l (o diferente cantidad de acuerdo con el intervalo de concentración deseada) de THF seco a 8 mg de cada compuesto pesado como se describe en el paso 1.4 (o 2.6) o 3.3. Pesar 8 mg del ligando H 2 L, también. </li><li> Diluir cada solución de compuesto adicional mediante la adición de 60 l de THF en 9 viales Eppendorf diferentes. </li><li> Con una pipeta de 60 l de la mezcla en la sección 5.1 a la primera vial Eppendorf, se resuspende y la transferencia de 60 l al siguiente vial, y así sucesivamente hasta 10 concentraciones diferentes son Obtained (incluyendo la mezcla de los padres en la sección 5.1). </li><li> Diluir 20 l de cada concentración en THF con 180 l de medio. </li><li> Preparar una solución de control con sólo THF; 20 l de THF con 180 l de medio en cada medición. </li><li> Añadir 10 l de la solución resultante (incluyendo el control de THF), a cada pocillo que ya contiene 200 l de la solución antes mencionada de las células en el medio para dar concentraciones finales de compuesto de hasta 200 mg / L (el intervalo de concentración puede ser cambiado de acuerdo con la actividad del compuesto). </li><li> Usted puede observar algo de precipitación a la concentración más alta aplicada en función de la solubilidad del compuesto. </li><li> Repita cada medición de los compuestos (3x 3 líneas en la placa del mismo compuesto); cada línea contiene: células tratadas con el compuesto en 10 concentraciones diferentes, 1 pocillo que contiene células tratadas con disolvente solo para el control y 1 bien sin células para blanco de control. </li><li> Incubar la placa cargada durante 3 días a 37 ° C en el 5% atmósfera de CO 2. </li></ol></li><li> Medición de la citotoxicidad utilizando el ensayo MTT <ol><li> Preparar la solución de MTT mediante la adición de 1 g de polvo de MTT a una solución de medio RPMI-1640 200 ml sin rojo de fenol. La solución madre se pueden dividir para tubos de 15 ml y se almacenan en -20 ° C. </li><li> Añadir 20 l de solución de MTT a cada pocillo con una pipeta de 11 canales (excepto a los pocillos de control de blanco sin las células de la etapa 4.10), e incubar la placa durante 3 h adicionales. </li><li> Retire la solución del medio de cada pocillo. </li><li> Añadir 200 l de isopropanol a cada pocillo para disolver el formazano. Agitar la placa durante 0,5 horas hasta que se alcanza la homogeneidad. </li><li> Medir la absorbancia a 550 nm para 200 l de la solución mencionada anteriormente mediante un espectrofotómetro lector de microplacas. </li><li> Repita cada medición (que incluye 3 repeticiones, consulte el paso 5.8) en 3 días diferentes. </li><li> Calcular tél porcentaje de viabilidad celular mediante la deducción del valor de absorbancia de control en blanco del valor medido, dividiendo el resultado por la absorbancia del valor de control de disolvente THF y multiplicando por 100%. </li><li> Calcular los valores de CI50 usando el software GraphPad Prism (o equivalente). </li><li> El IC 50 reportado es el promedio de todos los valores de CI50 recogidos en al menos tres días diferentes, y el valor de error es la desviación estándar. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+in+vitro+cytotoxicity+assays+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 3, 655-669 (2008).</li>
<li>Hatok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+for+the+evaluation+of+drug+resistance+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vitro assays for the evaluation of drug resistance in tumor cells.</a> Clinical and Experimental Medicine. 9, 1-7 (2009).</li>
<li>Wang, D., Lippard, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+processing+of+platinum+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cellular processing of platinum anticancer drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4, 307-320 (2005).</li>
<li>Muggia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platinum+compounds+30+years+after+the+introduction+of+cisplatin%3A+Implications+for+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Platinum compounds 30 years after the introduction of cisplatin: Implications for the treatment of ovarian cancer.</a> Gynecologic Oncology. 112, 275-281 (2009).</li>
<li>Bruijnincx, P. C., Sadler, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+trends+for+metal+complexes+with+anticancer+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">New trends for metal complexes with anticancer activity.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 12, 197-206 (2008).</li>
<li>Ott, I., Gust, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non+platinum+metal+complexes+as+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+der+Pharmazie+%28Weinheim%22%5BJournal%5D)">Non platinum metal complexes as anti-cancer drugs.</a> Archiv der Pharmazie (Weinheim. 340, 117-126 (2007).</li>
<li>Desoize, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metals+and+metal+compounds+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Metals and metal compounds in cancer treatment.</a> Anticancer Research. 24, 1529-1544 (2004).</li>
<li>Jakupec, M. A., Galanski, M., Arion, V. B., Hartinger, C. G., Keppler, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumour+metal+compounds%3A+more+than+theme+and+variations%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">Antitumour metal compounds: more than theme and variations.</a> Dalton Transactions. , 183-194 (2008).</li>
<li>Meléndez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+complexes+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Titanium complexes in cancer treatment.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 309-315 (2002).</li>
<li>Evangelou, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanadium+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Vanadium in cancer treatment.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 42, 249-265 (2002).</li>
<li>Djordjevic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+of+vanadium+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Metal+ions+in+biological+systems%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity of vanadium compounds.</a> Metal ions in biological systems. 31, 595-616 (1995).</li>
<li>Caruso, F., Rossi, M., Pettinari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+titanium+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Patents%22%5BJournal%5D)">Anticancer titanium agents.</a> Expert Opinion on Therapeutic Patents. 11, 969-979 (2001).</li>
<li>Caruso, F., Rossi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+titanium+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Mini-Review+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antitumor titanium compounds.</a> Mini-Review in Medicinal Chemistry. 4, 49-60 (2004).</li>
<li>Kostova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+and+vanadium+complexes+as+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Anti-Cancer+Agents+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Titanium and vanadium complexes as anticancer agents.</a> Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 9, 827-842 (2009).</li>
<li>Tshuva, E. Y., Ashenhurst, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+Titanium%28IV%29+Complexes%3A+Renaissance%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic Titanium(IV) Complexes: Renaissance.</a> European Journal of Inorganic Chemistry. , 2203-2218 (2009).</li>
<li>Buettner, K. M., Valentine, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinorganic+Chemistry+of+Titanium%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bioinorganic Chemistry of Titanium.</a> Chemical Reviews. 112, 1863-1881 (2012).</li>
<li>Meker, S., Margulis-Goshen, K., Weiss, E., Magdassi, S., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+antitumor+activity+of+highly+resistant+salan-titanium%28IV%29+complexes+in+nanoparticles%3A+an+identified+active+species%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+in+English%22%5BJournal%5D)">High antitumor activity of highly resistant salan-titanium(IV) complexes in nanoparticles: an identified active species.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 51, 10515-10517 (2012).</li>
<li>Reytman, L., Braitbard, O., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+cytotoxic+vanadium%28V%29+complexes+of+salan+ligands%3B+insights+on+the+role+of+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">Highly cytotoxic vanadium(V) complexes of salan ligands; insights on the role of hydrolysis.</a> Dalton Transactions. 41, 5241-5247 (2012).</li>
<li>Tzubery, A., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+and+Hydrolysis+of+trans-Ti%28IV%29+Complexes+of+Salen+Ligands%3A+Structure-Activity+Relationship+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity and Hydrolysis of trans-Ti(IV) Complexes of Salen Ligands: Structure-Activity Relationship Studies.</a> Inorganic Chemistry. 51, 1796-1804 (2012).</li>
<li>Tshuva, E. Y., Peri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+cytotoxic+titanium%28IV%29+complexes%3B+Insights+on+the+enigmatic+involvement+of+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Coordination+Chemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Modern cytotoxic titanium(IV) complexes; Insights on the enigmatic involvement of hydrolysis.</a> Coordination Chemistry Reviews. 253, 2098-2115 (2009).</li>
<li>Shavit, M., Peri, D., Manna, C. M., Alexander, J. S., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+cytotoxic+reagents+based+on+non-metallocene+non-diketonato+well-defined+C-2-symmetrical+titanium+complexes+of+tetradentate+bis%28phenolato%29+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Active cytotoxic reagents based on non-metallocene non-diketonato well-defined C-2-symmetrical titanium complexes of tetradentate bis(phenolato) ligands.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 12098-12099 (2007).</li>
<li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Colorimetric+Assay+for+Cellular+Growth+and+Survival+-+Application+to+Proliferation+and+Cyto-Toxicity+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival - Application to Proliferation and Cyto-Toxicity Assays.</a> Journal of Immunological Methods. 65 (83), 55-63 (1983).</li>
<li>Ahmadian, S., Barar, J., Saei, A. A., Fakhree, M. A. A., Omidi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Toxicity+of+Nanogenomedicine+in+MCF-7+Cell+Line%3A+MTT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cellular Toxicity of Nanogenomedicine in MCF-7 Cell Line: MTT assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (26), e1191(2009).</li>
<li>Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+hepatic+subcellular+fractions+for+Alamar+blue+and+MTT+reductase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity.</a> Toxicology in Vitro. 15, 257-259 (2001).</li>
<li>Denizot, F., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Colorimetric+Assay+for+Cell-Growth+and+Survival+-+Modifications+to+the+Tetrazolium+Dye+Procedure+Giving+Improved+Sensitivity+and+Reliability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid Colorimetric Assay for Cell-Growth and Survival - Modifications to the Tetrazolium Dye Procedure Giving Improved Sensitivity and Reliability.</a> Journal of Immunological Methods. 89, 271-277 (1986).</li>
<li>Alley, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+drug+screening+with+panels+of+human+tumor+cell+lines+using+a+microculture+tetrazolium+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay.</a> Cancer Research. 48, 589-601 (1988).</li>
<li>Weyermann, J., Lochmann, D., Zimmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+note+on+the+use+of+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">A practical note on the use of cytotoxicity assays.</a> International Journal of Pharmaceutics. 288, 369-376 (2005).</li>
<li>Chmura, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+4+complexes+with+aminebisphenolate+ligands+and+their+application+for+the+ring+opening+polymerization+of+cyclic+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Group 4 complexes with aminebisphenolate ligands and their application for the ring opening polymerization of cyclic esters.</a> Macromolecules. 39, 7250-7257 (2006).</li>
<li>Sebaugh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+accurate+EC50%2FIC50+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Statistics%22%5BJournal%5D)">Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation.</a> Pharmaceutical Statistics. 10, 128-134 (2011).</li>
<li>Yung, W. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Chemosensitivity+Testing+and+its+Clinical-Application+in+Human+Gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgical+Review%22%5BJournal%5D)">In vitro Chemosensitivity Testing and its Clinical-Application in Human Gliomas.</a> Neurosurgical Review. 12, 197-203 (1989).</li>
<li>McCarthy, N. J., Evan, G. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCarthy%2C+NJ+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22">Current Topics in Developmental Biology</a>. 36, 259-278 (1997).</li>
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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El método descrito en este manuscrito combina síntesis química con ensayo de viabilidad celular biológica. Al igual que con cualquiera de los métodos biológicos relativos a las células viables, es de vital importancia para trabajar en una campana laminar, y mantener las condiciones estériles, incluyendo el uso de disolventes orgánicos estériles. También, la preparación y el almacenamiento de los medicamentos basados ​​en metales hidrolíticamente inestable deben llevarse a cabo bajo condiciones inertes, para los que las ...

La quimioterapia es todavía uno de los platos principales de los tratamientos empleados en la clínica para varias enfermedades de cáncer, por lo que gran cantidad de investigación se lleva a cabo en todo el mundo con el objetivo de desarrollar nuevos y mejores medicamentos contra el cáncer. Estos estudios comienzan principalmente a nivel químico, con el diseño y la preparación de los compuestos, seguido de evaluación biológica de las propiedades citotóxicas in vitro. La viabilidad celular puede evaluarse mediante diversos ensayos que proporcionan información sobre la actividad celular 1-2. El cisplatino es un ejemplo de un complejo de platino que se utiliza ampliamente como un fármaco quimioterapéutico, que se considera un tratamiento eficaz principalmente para los cánceres testiculares y ováricos 3-4. Sin embargo, su estrecho rango de actividad y los efectos secundarios graves se activan los estudios de otros complejos de metales de transición potente 5-8. Entre otros, de titanio (IV) y vanadio complejos (V) mostraron resultados prometedores de alta actividad y reducentoxicidad 9-16. Ti (IV) fueron los primeros en entrar en ensayos clínicos después de cisplatino debido a estas propiedades, sin embargo, han fallado los ensayos debido a las dificultades de formulación y la inestabilidad hidrolítica. Hay así una necesidad actual para desarrollar mejores derivados de estos complejos metálicos que pueden combinar alta actividad contra el cáncer con resistencia al agua 15,17-21. Un reto en la preparación de Ti (IV) y V (V) se refiere a complejos de la inestabilidad hidrolítica de los reactivos precursores, por lo tanto, la atmósfera inerte debe mantenerse. La preparación de Ti (IV) y V (V) compuestos se lleva a cabo en atmósfera de N2 o Ar condiciones en una caja de guantes o utilizando técnicas de línea Schlenk. Un método común para la evaluación de la actividad anti-cáncer se basa en el MTT (3 - (4,5-dimetiltiazolil) -2,5-difeniltetrazolio) de ensayo. Este ensayo es un ensayo de viabilidad colorimétrico que se presentó en 1983 por Mosmann22. Está muy bien estudiado y caracterizado, y se considera altamente eficiente en la evaluación de la eficacia de nuevos compuestos citotóxicos debido a su precisión, rapidez, y su capacidad para ser aplicada en la variedad de líneas celulares. Este ensayo de viabilidad se basa en el cambio de color de la molécula MTT cuando se expone a las células viables. Medición de la absorbancia, que es proporcional al número de células viables, y la comparación con los controles no tratados, permite la evaluación de las capacidades de inhibición del crecimiento celular del compuesto ensayado. El ensayo colorimétrico de MTT se lleva a cabo en un formato de 96 pocillos placa 23. Las células pueden requerir la preincubación en los pocillos antes de la adición del fármaco probado. Los tiempos de preincubación puede variar desde 0 hasta 24 horas de acuerdo con las propiedades de la línea celular. Las células están normalmente expuestas a la droga durante 24-96 horas, dependiendo de la actividad del fármaco. Solución de MTT se añade entonces a las células tratadas, en el que el gritanOW MTT se reduce a formazán púrpura por una variedad de enzimas mitocondriales y citosólicas que están en funcionamiento en las células viables (Figura 1) 24. La molécula de MTT no se reduce por las células muertas o células rojas de la sangre (células metabólicamente inactivos), células de bazo (células en reposo) y concanavalina A linfocitos estimulada (células activadas) 22. Después de 3-4 horas de incubación con MTT formazan los precipitados. La formación del formazano comienza después de 0,5 horas de incubación, pero para obtener resultados óptimos es mejor para exponer las células a MTT durante al menos 3 h 22. En consecuencia, se elimina el medio de cultivo y el formazán se disuelve en un disolvente orgánico, preferentemente isopropanol 25, aunque DMSO también se puede utilizar 26. La eliminación del medio es crucial para la consecución de resultados precisos desde rojo de fenol, que es ampliamente común en medio de crecimiento, y la precipitación de las proteínas pueden interferir con la medición de la absorbancia 25. Cuando la formaciónsolución Zan alcanza homogénea, la absorbancia de la solución se mide utilizando un espectrofotómetro lector de microplacas. La absorbancia a 550 nm es directamente proporcional al número de células en el rango de 200-50,000 células por pocillo, y por lo tanto muy pequeñas cantidades de células se puede detectar 22. La absorbancia indica la cantidad de células viables que se mantuvo después del tratamiento con el fármaco, y se compara con la absorbancia de células de control que no fueron expuestos a la droga. Análisis de los resultados por el software adecuado proporciona la IC50 (concentración de inhibición, el 50%) los valores y los errores estadísticos basados ​​en varias repeticiones de la medición. El ensayo MTT es ampliamente común en estudios de citotoxicidad para la selección de nuevos compuestos contra el cáncer, debido a su precisión y simplicidad relativa. Sin embargo, cuando se utiliza el ensayo MTT, que se dependía de la reacción enzimática, se debe considerar que varios inhibidores de la enzima pueden afectar a la reducción de MTT und conducir a falsos resultados 27. Además, el ensayo de MTT no proporciona ninguna información sobre el mecanismo molecular de la actividad citotóxica del fármaco 2.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fuerte>Reactivo/Material</fuerte></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal (FBS)</td><td>Industrias Biológicas</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>Hexano AR</td><td>Gadot</td><td>830122313</td><td>Secado mediante un sistema de secado por solvente</td></tr><tr><td>Línea celular HT-29</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol AR</td><td>Gadot</td><td>830111370</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Industrias Biológicas</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655-1G</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>antibióticos Industrias Biológicas</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 con rojo de fenol con L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI sin rojo de fenol</td><td>Industrias Biológicas</td><td>01-103-1A</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano (THF) AR</td><td>Gadot</td><td>830156391</td><td>seca utilizando un sistema de secado con disolvente</td></tr><tr><td>Ti(OiPr)4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>205273-500ML</td><td>sensible a la humedad</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Industrias Biológicas</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>VO(OiPr)3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>404926-10G</td><td>humedad sensitive</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>pipeta de 12 canales 30-300 &mu; l</td><td>Pipeta Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de 12 canales 5-50 &mu; l</td><td>Finnpipeta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 matraz</td><td>NUNC</td><td>156472</td><td></td></tr><tr><td>placa de 96 pocillos con tapa (fondo plano)</td><td>NUNC</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Aglutinante</td> de incubadora <td>APT.line C150</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de mostrador</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>650030</td><td></td></tr><tr><td>Frasco Eppendorf</td><td>KARTELL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guantera</td><td>M. Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Campana de flujo laminar</td><td>ADS LAMINAIRE</td><td>OPTIMALE 12</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas espectrofotómetro</td><td>Bio-Tek</td><td>El-800</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 20-200 &mu; l</td><td>Pipeta Finnpipette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-50 &mu; l</td><td>Finnpipette</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

anticancerosos complejos metálicos: síntesis y evaluación de la citotoxicidad por el ensayo mtt

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

Complejos de titanio (IV) y vanadio (V) son agentes anticancerígenos altamente potentes. Un reto en su síntesis se refiere a su inestabilidad hidrolítica, por lo tanto su preparación debe llevarse a cabo bajo una atmósfera inerte. Evaluación de la actividad contra el cáncer de estos complejos se puede lograr mediante el ensayo de MTT. El ensayo MTT es un ensayo de viabilidad colorimétrico basado en la reducción enzimática de la molécula de MTT a formazán cuando se expone a las células viables. El resultado de la reducción es un cambio de color de la molécula MTT. Las mediciones de absorbancia relativos a un control determinan el porcentaje restante de las células cancerosas viables después de su tratamiento con concentraciones variables de un compuesto ensayado, que se traduce a la actividad contra el cáncer compuesto y sus valores de CI 50. El ensayo MTT es ampliamente común en estudios de citotoxicidad debido a su precisión, rapidez y relativa sencillez. En esto nos preenviado un protocolo detallado para la síntesis de los fármacos basados ​​en metales sensibles al aire y mediciones de viabilidad celular, incluyendo la preparación de las placas de células, la incubación de los compuestos con las células, las mediciones de viabilidad utilizando el ensayo de MTT, y la determinación de los valores de IC50.

Los complejos se prepararon sobre la base de los procedimientos establecidos 18,28 y su pureza se puede evaluar mediante análisis de RMN y elemental. Los datos recibidos desde el ensayo de MTT se analizaron para evaluar la citotoxicidad del compuesto 18,21. En primer lugar, se realiza la resta del valor de absorbancia de control en blanco de todos los otros valores. En segundo lugar, el valor de control de disolvente de THF se establece en 100% de viabilidad, como no se...

Un método para la síntesis de agentes de titanio y vanadio contra el cáncer sensibles al aire se describe, junto con la evaluación de su actividad citotóxica hacia línea celular de cáncer humano por el ensayo MTT.

Anticancerosos complejos metálicos: Síntesis y Evaluación de la citotoxicidad por el ensayo MTT

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar fármacos metálicos contra el cáncer y evaluar su citotoxicidad mediante el ensayo MTT. Esto se logra primero sintetizando compuestos anticancerígenos basados en metales. El segundo paso consiste en preparar placas de 96 pozos con células cancerosas.A continuación, se introducen los compuestos anticancerígenos basados en metales en las células cancerosas. El paso final consiste en medir la viabilidad celular mediante el ensayo MTT, en el cual se mide la reducción del MTT por enzimas mitocondriales y citosólicas para formar zen, lo que indica finalmente la actividad anticancerígena y la concentración inhibitoria máxima media. O bien, se determinan los valores de IC50 de los compuestos.Generalmente, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque se trata de un procedimiento de varios pasos que requiere la atención completa del trabajador de laboratorio y está sujeto a una cronología estricta. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la preparación de la placa celular no es sencilla, porque trabajar con células viables exige seguir pautas específicas. Trabajando en una cabina de flujo laminar, prepare el complejo de vanadio cinco disolviendo 0,42 milimoles del precursor del ligando en THF anhidro.Luego, agréguelo a una solución agitada de cantidades equivalentes de óxido de vanadio o tris isopropóxido en THF. Agite la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de eliminar los volátiles bajo vacío. A continuación, agregue hexano frío y elimínelo bajo vacío.Se debe obtener un polvo de color púrpura oscuro con un rendimiento cuantitativo. Pese ocho miligramos del compuesto obtenido en un vial epi u orph. Para preparar el complejo de titanio cuatro, disuelva 0,35 milimol del precursor del ligando en THF seco y añádalo a una solución agitada que contenga cantidades equivalentes de tetraisopropóxido de titanio en THF.Agite la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante dos horas. Luego, elimine los volátiles bajo vacío para obtener un producto amarillo con un rendimiento cuantitativo. Pese ocho miligramos del compuesto obtenido en un vial eppendorf para preparar las células HT 29 en una placa de 96 pozos para el primer cultivo.Las células en un matraz de 75 centímetros cuadrados según se describe en el protocolo del texto, retire el medio cuando las células HT 29 alcancen la máxima confluencia. Después de lavar las células con un mililitro de solución de tripsina-EDTA, agregue un mililitro de la misma solución e incube durante cinco minutos. Desprenda las células HT 29 del matraz y agregue 10 mililitros del medio para inactivar la actividad de la tripsina.Transfiera cinco mililitros de la mezcla celular a un tubo. Utilice una pipeta para transferir unas gotas de la mezcla celular a una cámara de recuento. La cámara de recuento incluye dos partes de cuadrados de cinco por cinco.Cuente las células en cinco cuadros representativos de cada parte utilizando un microscopio. Cuatro cuadros en las esquinas y un cuadro en el centro. Calcule la cantidad estimada de células presentes.Sume las células en los cinco cuadros representativos de cada parte. Calcule la suma promedio de las dos partes y divida entre 20. A continuación, divida 0.6 por el cociente.El número recibido es la cantidad de mezcla celular necesaria por placa. Este cálculo se refiere a una placa que contiene 9 000 células por pocillo. Mediante el uso de una pipeta, combine la cantidad de mezcla celular necesaria por placa con 13,2 mililitros del medio.Añada la mezcla a una placa de 96 pocillos. Utilice una pipeta de 11 canales con 200 microlitros por pocillo en seis líneas que contengan en total 66 pocillos. Un pocillo de cada línea debe permanecer vacío como control en blanco.Incube la placa a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 24 horas para permitir que las células se adhieran a la placa. Para insertar los compuestos, agregue primero 200 microlitros de THF seco a ocho miligramos del compuesto por peso. Diluya aún más la solución del compuesto agregando primero 60 microlitros de THF en nueve eppendorfs diferentes. Para cada solución, use una pipeta para transferir 60 microlitros de la solución del compuesto al primer eppendorf.Luego, resuspenda y transfiera 60 microlitros al siguiente vial, y así sucesivamente hasta obtener 10 concentraciones diferentes. Proceda a diluir 20 microlitros de cada concentración en THF con 180 microlitros de medio. Además, prepare una solución control con solo el disolvente agregando 20 microlitros de THF a 180 microlitros de medio.A continuación, agregue 10 microlitros de cada solución resultante a cada pocillo. Eso ya contiene 200 microlitros de la solución mencionada anteriormente de células en medio para obtener concentraciones finales del compuesto de hasta 200 miligramos por litro. Cada fila contiene células tratadas con el compuesto en 10 concentraciones diferentes.Un pozo control que contenga células tratadas solo con disolvente y un pozo sin células para el control en blanco. Configure las líneas para repetir cada medición del compuesto tres veces. Incube la placa cargada durante tres días a 37 grados Celsius en una atmósfera de 5% de dióxido de carbono. Prepare la solución de MTT según se describe en el protocolo del texto utilizando una pipeta de 11 canales.Añada 20 microlitros de solución de MTT a cada pocillo, excepto a los pocillos de control en blanco. Incube la placa durante tres horas adicionales tras la incubación. Retire la solución del medio de cada pocillo y añada 200 microlitros de isopropanol a cada pocillo.Para disolver la formina, agite la placa durante 30 minutos hasta lograr una mezcla homogénea. Mida la absorbancia a 550 nanómetros de 200 microlitros de la solución homogénea mediante un lector de microplacas o un espectrofotómetro, repitiendo cada medición en tres días diferentes. A continuación, calcule el porcentaje de viabilidad celular restando el valor de absorbancia del control en blanco del valor medido, dividiendo el resultado por la absorbancia del control del disolvente THF y multiplicando por 100%. Calcule los valores de la concentración inhibitoria media máxima utilizando software de graficación.El IC50 informado es el promedio de todos los valores de IC50 recopilados en al menos tres días diferentes, y el valor de error es la desviación estándar. Los datos obtenidos del ensayo de MTT se analizan para evaluar la citotoxicidad del compuesto. Las mediciones deben realizarse en un rango de concentraciones que produzca una gráfica con una distribución uniforme de puntos, al menos tres puntos en cada meseta y tres puntos para definir la pendiente.Mediciones insuficientes en concentraciones altas o bajas afectarán el ajuste de regresión no lineal de la curva necesario para la determinación de los valores de IC50, y en consecuencia reducirán su precisión. Los valores de IC50 relativos determinados mediante el ajuste de regresión no lineal corresponden a las concentraciones que provocan una inhibición del crecimiento celular del 50 % posible con el compuesto ensayado. Esto se calcula como el punto medio entre la viabilidad celular máxima y mínima medida, que no necesariamente son del 100 % y 0 %, respectivamente.Al inspeccionar los resultados de los experimentos descritos en el protocolo, es evidente que el cisplatino, así como los complejos de titanio y vanadio, son altamente activos. También es notable que cuanto más cercano sea el valor máximo de inhibición de un compuesto dado al 100 %, más cercano estará el valor relativo de IC50 al valor absoluto al comparar los valores de IC50 entre los diferentes compuestos.El complejo de titanio cuatro presenta la citotoxicidad más alta y sus valores de CI50 son más bajos que los del cisplatino y del complejo de vanadio cinco. Sin embargo, el ligando libre muestra una actividad notablemente reducida, ya que tras la adición del ligando a diferentes concentraciones, la viabilidad celular no disminuye de forma tan significativa como ocurre con sus complejos.Esto asegura que la alta actividad anticancerígena de los complejos dependa de los centros metálicos mientras se lleva a cabo este procedimiento. Es importante mantener condiciones estériles en todo momento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la citotoxicidad de sus compuestos anticancerígenos mediante el ensayo M-T-T-S-A.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

El ensayo de MTT es un ensayo colorimétrico fácil y reproducible para la evaluación de la viabilidad celular basado en la reducción de MTT amarilla y la producción de agua morada formazán insoluble. En este caso, la viabilidad de las células MCF-7 sobre el tratamiento de nanogenomedicine ha sido evaluada.

La toxicidad celular de Nanogenomedicine en la línea celular MCF-7: ensayo de MTT

Este video describe el ensayo colorimétrico, ensayo de metil tiazol tetrazolio (MTT), para medir la citotoxicidad inducida por fármacos en células cancerosas y determinar su actividad metabólica. Este ensayo se basa en la conversión metabólica de las sales de tetrazolio en productos coloreados, que reflejan la actividad mitocondrial de las células.

Ensayo de metil tiazolil tetrazolio o MTT: ensayo colorimétrico para medir la resistencia a los medicamentos mediante la determinación de la actividad metabólica en las células cancerosas

Aquí, la monitorización en tiempo real del metabolismo de las células tumorales, combinada con un modelo de metástasis de membrana corioalantoidea (CAM) de embrión de pollo in vivo, se utiliza para evaluar nuevos objetivos/agentes anticancerígenos por su capacidad para sensibilizar las células tumorales a los quimioterapéuticos que dañan el ADN.

Evaluación de la efectividad del medicamento para el cáncer Sensibilización<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Este protocolo describe cómo evaluar sinergismo entre un anticuerpo contra el cáncer y fármacos antineoplásicos en modelos preclínicos mediante la ecuación de índice de combinación de Chou y Talalay.

Potenciación de la eficacia del anticuerpo contra el cáncer por fármacos antineoplásicos: detección de anticuerpos-droga sinergia utilizando la ecuación de índice de combinación

El protocolo describe un ensayo rápido, de alto rendimiento, confiable, económico e imparcial para determinar eficientemente la viabilidad celular. Este ensayo es particularmente útil cuando las mitocondrias de las células han sido dañadas, lo que interfiere con otros ensayos. El ensayo utiliza el conteo automatizado de células manchadas con dos tintes nucleares: Hoechst 33342 y yoduro de propidium.

Un ensayo automatizado de tinción nuclear diferencial para la determinación precisa de la citotoxicidad mitoca

Esta metodología tiene como objetivo evaluar la citotoxicidad de biomateriales a través de la preparación de extractos solubles, utilizando ensayos de viabilidad y análisis fenotípicos, incluyendo citometría de flujo, RT-PCR, inmunocitoquímica y otras técnicas de biología celular y molecular.

Acceso a la citotoxicidad y respuesta celular a los biomateriales

Aquí, describimos un bioensayo utilizando bromuro de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) para probar oximas espirocíclicas previamente sintetizadas.

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Este protocolo presenta una técnica automatizada de alto rendimiento basada en imágenes para identificar compuestos que modulan la destrucción de células de cáncer de mama mediada por células asesinas naturales en presencia de un anticuerpo terapéutico anti-HER-2.

Ensayo de cribado de alto contenido para la identificación de compuestos modificadores de citotoxicidad celular dependientes de anticuerpos

La focalización farmacológica de los canales iónicos es un enfoque prometedor para el tratamiento de tumores sólidos. Se proporcionan protocolos detallados para caracterizar la función de los canales iónicos en las células cancerosas y analizar los efectos de los moduladores de los canales iónicos en la viabilidad del cáncer.

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Aquí, presentamos un método para identificar compuestos que modulan el mecanismo ADCC, un importante mecanismo de destrucción de células cancerosas de anticuerpos antitumorales. El efecto citotóxico de las células NK se mide en esferoides de células de cáncer de mama en presencia de trastuzumab. El análisis de imágenes identifica células asesinas y diana vivas y muertas en esferoides.

Cuantificación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en un modelo de esferoide tumoral: aplicación para el descubrimiento de fármacos

Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de citotoxicidad mediada por células (ADCC) dependiente de anticuerpos utilizando un kit de bioensayo ADCC. Este método ofrece una valiosa herramienta para dilucidar el mecanismo ADCC y evaluar el potencial terapéutico de los anticuerpos en la inmunoterapia contra el cáncer.

Evaluación de la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos en células cancerosas mediante el bioensayo reportero de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos

Aprende a sintetizar compuestos metálicos sensibles al aire de titanio y vanadio para evaluar su citotoxicidad en líneas celulares cancerosas humanas mediante el ensayo MTT. Este método permite determinar valores de IC50.

Anticancerosos complejos metálicos: Síntesis y Evaluación de la citotoxicidad por el ensayo MTT

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