Anticancerosos complejos metálicos: Síntesis y Evaluación de la citotoxicidad por el ensayo MTT

El objetivo general de este procedimiento es preparar fármacos metalogénicos contra el cáncer y evaluar su citotoxicidad mediante el ensayo MTT. Esto se logra sintetizando primero compuestos anticancerígenos a base de metales. El segundo paso es preparar placas de 96 pocillos de células cancerosas.

A continuación, los compuestos anticancerígenos a base de metales se insertan en las células cancerosas. El paso final es medir la viabilidad celular mediante el ensayo MTT, donde se mide la reducción de MTT por las enzimas mitocondriales y citosólicas para formar zen, en última instancia, la actividad anticancerígena y la concentración inhibitoria máxima media. O veo que se determinan 50 valores de los compuestos.

Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque es un procedimiento de varios pasos que requiere toda la atención del trabajador del laboratorio y se coloca en un cronograma estricto. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la preparación de la placa celular no es sencilla porque trabajar con células viables requiere seguir pautas particulares. Trabajando en una guantera, prepare el complejo de cinco vanadio disolviendo 0,42 milimoles del precursor del ligando en THF seco.

Luego agréguelo a una solución agitadora de cantidades equivalentes de vanadio o óxido de tris isop en THF. Revuelva la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de eliminar los volátiles al vacío. A continuación, añade un hexano frío y retíralo al vacío.

Se debe obtener un polvo de color púrpura oscuro en un rendimiento cuantitativo. Pesar ocho miligramos del compuesto obtenido en un vial epi orph. Para preparar el complejo de titanio cuatro, disuelva 0,35 milimoles del precursor del ligando en THF seco y agréguelo a una solución agitadora de cantidades equivalentes a cantidades de óxido de tetra isop de titanio en THF.

Revuelva la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante dos horas. A continuación, elimine los volátiles al vacío para obtener un producto amarillo con un rendimiento cuantitativo. Pesar ocho miligramos del compuesto obtenido en un vial de eph para preparar células HT 29 en un primer cultivo en placa de 96 pocillos.

Las células de un matraz de 75 centímetros cuadrados, tal y como se describe en el protocolo de texto, eliminan el medio cuando las células HT 29 alcanzan la máxima fluidez de la moneda. Después de lavar las células en un mililitro de solución de tripsina EDTA, agregue un mililitro de la misma solución e incube durante cinco minutos. Separe las células HT 29 del matraz y añada 10 mililitros del medio para desactivar la actividad de la tripsina.

Transfiera cinco mililitros de la mezcla de células a un tubo. Utilice una pipeta para transferir unas gotas de la mezcla de células a una cámara de mostrador. La contracámara incluye dos partes de cinco por cinco cuadrados.

Cuente las células en cinco cuadrados representativos de cada parte usando un microscopio. Cuatro cuadrados en las esquinas y un cuadrado en el medio. Calcule la cantidad estimada de células presentes.

Suma las celdas de los cinco cuadrados representativos de cada parte, calcula la suma media de las dos partes y divídelas por 20. A continuación, divide 0,6 por el cociente.

El número recibido es la cantidad de mezcla de células requerida por placa. Este cálculo se refiere a una placa que contiene 9.000 células por pocillo. Con una pipeta, combine la cantidad de mezcla de células necesaria por placa con 13,2 mililitros del medio.

Agregue la mezcla a un plato de 96 pocillos. Utilizando una pipeta de 11 canales a 200 microlitros por pocillo en seis líneas que contienen 66 pocillos en total. Un pocillo de cada línea debe permanecer vacío para el control en blanco.

Incubar la placa a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 24 horas para permitir que las células se adhieran a la placa para insertar primero los compuestos, agregue 200 microlitros de THF seco a ocho miligramos del compuesto de peso. Diluya aún más la solución compuesta añadiendo primero 60 microlitros de THF en nueve limas einor diferentes. Para cada solución, utilice una pipeta para transferir 60 microlitros de la solución compuesta a la primera lima einor.

A continuación, resus suspender y transferir 60 microlitros al siguiente vial y así sucesivamente hasta obtener 10 concentraciones diferentes. Proceda a diluir 20 microlitros de cada concentración en THF con 180 microlitros de medio. Además, prepare una solución de control de solo solvente agregando 20 microlitros de THF a 180 microlitros de medio.

A continuación, agregue 10 microlitros de cada solución resultante a cada pocillo. Que ya contiene 200 microlitros de la mencionada solución de células en el medio para dar concentraciones finales del compuesto de hasta 200 miligramos por litro. Cada línea contiene células tratadas con el compuesto en 10 concentraciones diferentes.

Uno, pocillo de control que contiene celdas tratadas solo con solvente y un pocillo sin celdas Para el control en blanco, configure las líneas para repetir cada medición del compuesto tres veces. Incubar la placa cargada durante tres días a 37 grados centígrados en una atmósfera de dióxido de carbono al 5%. Prepare la solución MTT como se describe en el protocolo de texto utilizando una pipeta de 11 canales.

Agregue 20 microlitros de solución de MTT a cada pocillo, excepto a los pocillos de control en blanco. Incube la placa durante tres horas adicionales después de la incubación. Retire la solución de medio de cada pocillo y agregue 200 microlitros de isopropanol a cada pocillo.

Para disolver la formina, revuelva el plato durante 30 minutos hasta que quede homogéneo. Mida la absorbancia a 550 nanómetros para 200 microlitros de la solución homogénea mediante un lector de microplacas, espectrofotómetro que repite cada medición en tres días diferentes. A continuación, calcule el porcentaje de viabilidad celular deduciendo el valor de absorbancia de control en blanco del valor medido, dividiendo el resultado por la absorbancia del valor de control de solvente THF y multiplicando por 100%Calcule la mitad de los valores de concentración inhibitoria máxima utilizando un software gráfico.

El IC 50 notificado es el promedio de todos los valores de IC 50 recopilados en al menos tres días diferentes, y el valor de error es la desviación estándar. Los datos recibidos del ensayo MTT se analizan para evaluar la citotoxicidad del compuesto. Las mediciones deben realizarse en un rango de concentraciones que produzca un gráfico que muestre una distribución de puntos uniforme, al menos tres puntos en cada meseta y tres puntos para definir la pendiente.

Las mediciones insuficientes a altas o bajas concentraciones perjudicarán el ajuste de regresión no lineal de la curva requerido para la determinación de los valores de IC 50 y, como resultado, disminuirán su precisión. Los valores relativos de IC 50 determinados por el ajuste de regresión no lineal corresponden a las concentraciones que conducen al 50% de la inhibición del crecimiento celular posible por el compuesto ensayado. Esto se calcula como el punto medio entre la viabilidad celular máxima y mínima medida, que no son necesariamente 100% y 0% respectivamente.

Al inspeccionar los resultados de los experimentos descritos en el protocolo. Está claro que el cisplatino, así como los complejos de titanio y vanadio, son muy activos. También es notable que cuanto más cerca está el valor de inhibición máxima de un compuesto dado del 100%, más cerca está el valor relativo de IC 50 al absoluto cuando se comparan los valores de IC 50 entre los diferentes compuestos.

El complejo de titanio cuatro tiene la citotoxicidad más alta y sus valores de IC 50 son más bajos que los del cisplatino y el complejo de vanadio cinco. Sin embargo, el ligando libre exhibe una actividad marcadamente reducida desde después de la adición del ligando a diferentes concentraciones. La viabilidad celular no disminuye tan significativamente como lo hace para sus complejos.

Esto asegura que la alta actividad anticancerígena de los complejos depende de los centros metálicos al intentar este procedimiento. Es importante mantener las condiciones estériles en todo momento. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo evaluar la citotoxicidad de sus compuestos anticancerígenos mediante el M-T-T-S-A.